朱砂及其復(fù)方與氯化汞、甲基汞對小鼠腎轉(zhuǎn)運體基因表達(dá)影響對比

隋 怡 楊 虹 田興中 付中祥 時京珍

貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550002

朱砂及含朱砂的中藥含汞，汞被列入有毒重金屬范疇，使其用藥安全性遭受質(zhì)疑。目前均以總汞含量為指標(biāo)來評價含朱砂中藥的安全性。然而，自然界中汞的形式多種多樣，不同形式的汞其毒性差異巨大，以總汞含量為指標(biāo)評價朱砂安全性似乎欠妥[1-4]。腎臟是汞的毒性靶器官之一。腎轉(zhuǎn)運體種類眾多，介導(dǎo)各種機體內(nèi)、外源性物質(zhì)自腎臟的排泄。本實驗前期研究了小鼠連續(xù)灌胃30 d后，朱砂安神丸及含汞化合物對小鼠腎轉(zhuǎn)運體基因表達(dá)的影響[5]，發(fā)現(xiàn)與正常組小鼠相比，HgCl2組和MeHg組小鼠腎汞蓄積量顯著升高、腎轉(zhuǎn)運體基因(Oat1、Oat2、Oat3、Mrp2、Mrp4、Urat1)表達(dá)有顯著性差異，其余各組以上基因的表達(dá)與正常組小鼠相比無顯著性差異。表明與HgCl2和MeHg相比，朱砂及其復(fù)方對小鼠造成的腎轉(zhuǎn)運體基因表達(dá)的影響相對較低。本次實驗采用實時RT-PCR的方法，繼續(xù)檢測連續(xù)灌胃30 d后，朱砂安神丸及含汞化合物對小鼠腎轉(zhuǎn)運體(Oatp4c1、Ost-α和Ost-β)基因表達(dá)的影響，從而進(jìn)一步為科學(xué)的評價朱砂及含朱砂中藥的安全性提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康成年雄性昆明種小鼠，體重18～22g，購自貴陽中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(黔)2002-0001。

1.1.2 藥品 朱砂安神丸水蜜丸(哈藥集團世一堂制藥廠)、朱砂(毫州市京皖中藥飲片廠，水飛炮制品)、HgS(美國Sigma公司)、HgCl2(貴州省萬山特區(qū)礦產(chǎn)公司)、MeHg(美國Sigma公司)。藥物的配制：以上各種藥物均用去離子水配制。

1.1.3 試劑 Trizol(invitrogen公司，批號5194 1204)、高容量逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(High Capacity Reverse Transcriptase Kit：Applied Biosystems,Foster City,CA,USA，批號0810067)、Power SYBR Green ?PCR Master Mix(Takara公司，批號0912197)、引物設(shè)計與合成(上海捷瑞生物工程有限公司)、焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate,DEPC，北京索寶來科技有限公司，批號426A057)。

1.1.4 主要儀器 JA2003N型電子天平(上海菁海儀器有限公司)、ND-2000(NaNoDop 2000)微量紫外-可見分光光度計(美國Thermo Scientific公司)、22331型多功能梯度PCR儀(Matercycler gradient，德國Eppendorf公司)、CFX-connect型熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥 小鼠42只，隨機分成7組，每組6只。分別為正常組、朱砂安神丸組(灌胃，1.8g·kg-1，含汞0.17 g·kg-1)、朱砂組(灌胃，0.2 g·kg-1，含汞0.17 g·kg-1)、朱砂高劑量組(灌胃，2g·kg-1，含汞1.7 g·kg-1)、HgS組(灌胃，0.2 g·kg-1，含汞0.17 g·kg-1)、HgCl2組(灌胃，0.032 g·kg-1，含汞0.024 g·kg-1，約1/7朱砂中汞含量)、MeHg組(灌胃，0.026 g·kg-1，含汞0.024 g·kg-1，約1/7朱砂中汞含量)。每天灌胃給藥1次，連續(xù)30 d，處死小鼠取腎組織，進(jìn)行實時熒光定量RT-PCR檢測。

1.2.2 實時RT-PCR法檢測小鼠腎轉(zhuǎn)運體基因的表達(dá) RNA的提取、純化與濃度檢測：取50mg腎組織，加入1mL Trizol，冰上勻漿。離心后取上清液加入500 μL異丙醇沉淀RNA，75%乙醇充分洗滌3次后用DEPC水100μL溶解備用。紫外可見分光光度計檢測RNA純度，OD260/OD280>1.7認(rèn)為RNA純度達(dá)到要求，RNA濃度(ng·μL-1)=OD260·40。按檢測的RNA濃度用DEPC水稀釋，配制成200 ng·μL-1的RNA樣品稀釋液備用。

逆轉(zhuǎn)錄：取6 μL RNA稀釋液按High Capacity RT試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用DEPC水稀釋成濃度為10 ng·μL-1備用。引物序列見表1。

表1 RT-PCR所用引物

PCR擴增：配置15 μL反應(yīng)體系，包括3 μL cDNA稀釋液、7.5 μL Power SYBR Green PCR Master Mix、0.5 μL混合引物(表1)、4 μL DEPC水。反應(yīng)條件：95 ℃×10 min，3個循環(huán)；95 ℃×10 s，60 ℃×1 min，40個循環(huán)；95 ℃×1 min，55 ℃×1 min，55 ℃×10 s，80個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因，根據(jù)結(jié)果對基因表達(dá)進(jìn)行相對定量。

基因相對表達(dá)(%)=目的基因的表達(dá)/內(nèi)參基因的表達(dá)×100。

2 結(jié)果

朱砂安神丸、朱砂、HgS、HgCl2、MeHg對小鼠腎組織Oatp4c1、Ost-α、Ost-β基因表達(dá)的影響， 與正常組相比，小鼠腎Oatp4c1基因的表達(dá)在朱砂安神丸組顯著升高(P<0.05)； Ost-α、Ost-β的表達(dá)在HgCl2組和MeHg組均顯著降低(P<0.05)。其余各組基因的表達(dá)與正常組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 朱砂安神丸、朱砂、HgS、HgCl2、MeHg對小鼠腎組織Oatp4c1、Ost-α、Ost-β基因表達(dá)的影響

3 討論

自然界中汞的形式有很多，常見的汞以與硫結(jié)合的形式存在，即HgS的形式。HgS的口服吸收度較差，毒性較低；而汞的另外兩種形式氯化汞和甲基汞，易于在海洋生物體內(nèi)蓄積，主要造成嚴(yán)重的肝、腎和神經(jīng)毒性[1]。不同形式的汞毒性差異巨大。朱砂安神丸全方含汞約為9%，主要為HgS，目前以總汞含量評價含朱砂中藥用藥安全性。然而HgS的水溶性小、口服吸收率低。HgCl2為可溶性二價汞，體內(nèi)吸收率遠(yuǎn)高于HgS。MeHg為脂溶性有機汞，很容易穿透細(xì)胞膜，易于蓄積造成毒性。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HgCl2組和MeHg組小鼠腎轉(zhuǎn)運體基因表達(dá)與正常組相比有顯著性差異，朱砂及朱砂安神丸對腎轉(zhuǎn)運體基因表達(dá)影響較小[5]。由于腎臟轉(zhuǎn)運體對腎功蓄積和腎臟毒性起到重要的作用[5]，因此課題組從基因水平考察不同形式的汞對腎轉(zhuǎn)運體基因表達(dá)的影響。

有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽Oatp4c1表達(dá)于腎近端小管上皮細(xì)胞基底膜，介導(dǎo)有機陰離子從腎小管周組織轉(zhuǎn)運至腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)[6]。Oatp4c1底物眾多，其中包括cAMP等機體內(nèi)源性代謝產(chǎn)物[6]。cAMP為某些細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路中重要的第二信使，其在細(xì)胞內(nèi)含量升高會激活PKA，激活的PKA使特定蛋白質(zhì)磷酸化，從而發(fā)揮生理作用。在心肌細(xì)胞中，PKA激活會使Ca2+通道開放，使得心肌自律細(xì)胞4期自動去極化加快，為快速心律失常危險因素[7]。心肌細(xì)胞內(nèi)cAMP的消除有多種方式，心肌細(xì)胞上存在一些轉(zhuǎn)運體，可以直接將cAMP排出心肌細(xì)胞，降低心肌細(xì)胞內(nèi)cAMP水平[8]。本次實驗結(jié)果中，朱砂安神丸組小鼠腎臟中Oatp4c1基因的表達(dá)與正常組相比顯著增加，表達(dá)的加強可能會增強腎臟cAMP的排泄，使心肌細(xì)胞內(nèi)cAMP維持在較低水平。

有機溶質(zhì)轉(zhuǎn)運體α、β(Ostα、Ostβ)為膽汁酸轉(zhuǎn)運體。其在不同部位表達(dá)有不同的生理意義：在小腸中主要表達(dá)介導(dǎo)膽汁酸的吸收；在肝臟表達(dá)介導(dǎo)膽汁酸自肝細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)；在腎臟表達(dá)介導(dǎo)膽汁酸及其代謝產(chǎn)物的重吸收[9]。肝細(xì)胞合成膽汁酸，其與鈉、鉀離子形成的膽鹽有助于脂肪在腸道內(nèi)的乳化、吸收。膽汁酸的排泄主要是通過腸道和腎[10]，健康機體能通過加強膽汁酸腎小管重吸收等方式，最大程度地保留體內(nèi)膽汁酸；而在病理情況下(如肝臟損害、膽汁淤積)，機體會調(diào)節(jié)膽汁酸轉(zhuǎn)運體的表達(dá)，加強膽汁酸自糞或尿的排泄。課題組前期的實驗結(jié)果顯示[11]，小鼠灌胃 0.032 g·kg-1氯化汞30 d可見肝組織炎癥細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞水腫。灌胃 0.026g·kg-1甲基汞30 d可見肝組織大量炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞水腫明顯，或壞死，顯示出氯化汞和甲基汞對肝臟的損害。本實驗中，在氯化汞組、甲基汞組小鼠腎內(nèi)Ost-α、Ost-β基因表達(dá)式顯著下調(diào)，聯(lián)系之前觀測到的氯化汞和甲基汞造成的肝臟損傷，課題組認(rèn)為這是一種機體的自我保護機制，即肝臟損害誘導(dǎo)腎內(nèi)Ost-α、Ost-β基因表達(dá)下調(diào)，降低膽汁酸在腎內(nèi)重吸，加速其排泄，緩解肝臟損傷。而與正常組相比，其余各組Ost-α、Ost-β基因表達(dá)無顯著性差異。表明不同形式的汞對小鼠腎轉(zhuǎn)運體基因表達(dá)影響差異巨大，其毒理作用有待進(jìn)一步考量。