米糠發(fā)酵產(chǎn)物抑制α-葡萄糖苷酶的工藝優(yōu)化

賴曉樺,鄧 甜,胡經(jīng)飛,陳德寧,呂明生,王淑軍,*

(1.江蘇海洋大學(xué)海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院,江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇連云港 222005; 2.江蘇海洋大學(xué)海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院,江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇連云港 222005; 3.鹽城康林達(dá)生物科技有限公司,江蘇鹽城 224000)

米糠是稻米加工過(guò)程中的副產(chǎn)物,主要成分為種皮、糊粉層和皮胚,約占稻米質(zhì)量的6%～8%,為可再生資源,其含有豐富的優(yōu)質(zhì)脂肪酸、維生素、γ-谷維素和大量的膳食纖維等[1]。資料顯示,種植水稻的國(guó)家很多,其區(qū)域廣,產(chǎn)量大,大部分集中在亞洲地區(qū)。中國(guó)是世界上最大的水稻種植國(guó),米糠年產(chǎn)量約為2000萬(wàn)噸,以往大都用作牲畜的飼料或植物肥料,不僅利用率低,廢棄后還會(huì)造成環(huán)境的污染[2]。

II型糖尿病,又稱非胰島素的依賴型糖尿病,是胰島素抵抗、胰島素分泌不足或二者兼有造成的。由于II型糖尿病的前期癥狀較輕,往往會(huì)被忽視,在我國(guó)糖尿病患者中II型占95%以上[3],其病程長(zhǎng),并發(fā)癥多,對(duì)人類健康威脅大。在醫(yī)學(xué)上,可以通過(guò)增加胰島素敏感、促進(jìn)胰島素分泌、抑制α-葡萄糖苷酶活性等方法來(lái)緩解和治愈II型糖尿病[4]。α-葡萄糖苷酶抑制劑(α-Glucosidase inhibitors)通過(guò)抑制腸粘膜刷狀緣的糖苷酶活性來(lái)降低雙糖水解為單糖的速度,從而減緩餐后血糖的上升,因此,能有效減緩糖尿病前期患者發(fā)展為糖尿病,對(duì)糖尿病的并發(fā)癥具有很好的預(yù)防作用[5]。α-葡萄糖苷酶抑制劑是治療糖尿病的第4類公認(rèn)藥物,是較為重要的降血糖藥物[6]。除了治療糖尿病外,α-葡萄糖苷酶抑制劑還被發(fā)現(xiàn)可用于治療高血壓、高血脂、肥胖以及抗病毒感染等[7-10]。阿卡波糖是首個(gè)上市的糖苷酶抑制劑,在我國(guó)是常見的降血糖藥物,對(duì)血糖的控制效果也較好。但長(zhǎng)期服用存在一定的副作用,如對(duì)肝臟造成損害和引起腸梗阻等[11]。所以尋找天然、安全、經(jīng)濟(jì)的α-葡萄糖苷酶抑制劑藥物是控制糖尿病的較好途徑。目前,對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究主要集中在化學(xué)合成或從天然物質(zhì)中提取上,但是這些方法開發(fā)得到的α-葡萄糖苷酶抑制劑有副作用,如引起肝、腸、胃等疾病，也存在提取量少,成本較高等問(wèn)題[12-15]。采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑成本較低,資源充足,是一種較好的方法[11]。

枯草芽孢桿菌是我國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用的有益菌種,常作為生物發(fā)酵劑,在生長(zhǎng)過(guò)程中可產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等,常將其用于豆類水解生成氨基酸、多肽及胺類化合物[16]。日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的野尻霉素對(duì)α-葡萄糖苷酶有抑制作用[17]。2008年,朱運(yùn)平等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆渣提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率達(dá)到90%[18]。2011年,張友維等用枯草芽孢桿菌發(fā)酵花生,獲得了具有較強(qiáng)抗氧化能力的花生多肽[19]。2014年,Shin等用BacillussubtilisCSYl91發(fā)酵了黑豆,顯著提高了黑豆的抗氧化能力[20]。2017年,羅斌等用枯草芽孢桿菌發(fā)酵米糠并制備活性肽[21]。

本研究采用來(lái)源于泡菜的一株枯草芽孢桿菌發(fā)酵米糠,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性有較強(qiáng)抑制作用。隨后對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了初步表征,為進(jìn)一步研究打下了基礎(chǔ),也為提高米糠的綜合利用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌MK15 菌種篩選于四川泡菜;米糠 鹽城康林達(dá)生物科技有限公司;α-葡萄糖苷酶 上海源葉生物科技有限公司;對(duì)硝基苯α-D葡萄糖吡喃苷 Sigma公司;氯仿、正丁醇、碳酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、魚粉蛋白胨、葡萄糖、NaCl、尿素、牛肉浸膏、碳酸鈉、Na2HPO4·12H20、NaH2PO4·2H20 上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1510酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司;SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;M1282-0006恒溫?fù)u床 美國(guó)Eppendrof公司;K850真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司;JXN-26高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司;JSM-6390LA掃描電子顯微鏡 日本JEOL公司;Nicoet iso遠(yuǎn)紅外光譜 歐世盛(北京)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵種子的制備 從斜面刮取兩環(huán)枯草芽孢桿菌MK15接入50 mL種子培養(yǎng)基(NA:牛肉浸膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、pH7.0、自來(lái)水、121 ℃滅菌20 min),37 ℃ 180 r/min,發(fā)酵培養(yǎng)24 h。

1.2.2 米糠發(fā)酵產(chǎn)物的制備及純化 將種子液按3%的量接種至米糠發(fā)酵培養(yǎng)基(米糠5%、葡萄糖0.1%、NaCl 0.5%、尿素0.5%、pH8.0、自來(lái)水配制,115 ℃,殺菌20 min)中,35 ℃180 r/min發(fā)酵48 h后,8000 r/min,4 ℃離心30 min取上清液過(guò)0.45 μm濾膜制成待測(cè)樣品。

將米糠發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行初步提純[22],用氫氧化鈉將米糠發(fā)酵液的pH調(diào)至9.0,8000 r/min離心30 min,去除堿性蛋白,再用鹽酸將pH調(diào)至5.0去除酸性蛋白,然后將pH調(diào)到7.0。用三倍體積的無(wú)水乙醇,4 ℃醇沉24 h,8000 r/min離心30 min后取沉淀,用蒸餾水復(fù)溶。用Savage法[23]去除剩余蛋白,根據(jù)蛋白質(zhì)不溶于有機(jī)溶劑的特點(diǎn),將樣品溶液、氯仿、正丁醇體積比調(diào)為25∶5∶1,混合物劇烈振蕩30 min,8000 r/min 4 ℃,離心5 min,去除蛋白質(zhì)、氯仿和正丁醇生成的凝膠物。將初步純化的米糠發(fā)酵產(chǎn)物用真空冷凍干燥機(jī)凍干后測(cè)定其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用,并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

1.2.3α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定 在體外測(cè)定模型的基礎(chǔ)上加以改良[24]。在96孔板中加入50 μL濃度0.5 mol/L pH6.7磷酸鹽溶液,30 μL 0.5 mmol/L PNPG底物溶液,50 μL米糠發(fā)酵提取液,20 μLα-葡萄糖苷酶溶液(用磷酸鹽溶液將α-葡萄糖苷酶溶液配制成0.3 U/mL),在37 ℃ 反應(yīng)30 min,加入50 μL 0.67 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng),混勻后在405 nm處測(cè)量吸光值,采用100、50、10、5、1、0.1、0.02 mmol/L阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照?？瞻捉M用磷酸鹽溶液代替PNPG底物溶液和酶液,對(duì)照組用磷酸鹽溶液代替樣品溶液。將吸光值代入以下公式計(jì)算發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率:

式(1)

式中:A樣品為樣品組的吸光度值;A空白為空白組的吸光度值;A對(duì)照為對(duì)照組的吸光度值。

1.2.4 米糠發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)α-葡萄糖苷酶活性影響 將菌株MK15活化后的種子液按3%的量接種到裝有50 mL,且米糠添加量為5%,發(fā)酵培養(yǎng)基pH為8.0的250 mL的三角瓶中,180 r/min,在溫度35 ℃下發(fā)酵24、36、48、60、72 h后,平行發(fā)酵3次,按照1.2.2方法制備成待測(cè)樣品,按照1.2.3方法測(cè)試對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率。

1.2.4.2 培養(yǎng)溫度對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響 將菌株MK15活化后的種子液按3%的量接種到裝有50 mL,且米糠添加量為5%,發(fā)酵培養(yǎng)基pH為8.0的250 mL的三角瓶中,180 r/min,在溫度25、30、35、37、40 ℃下發(fā)酵48 h后,平行發(fā)酵3次,按照1.2.2方法制備成待測(cè)樣品,按照1.2.3方法測(cè)試對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1.2.4.3 培養(yǎng)基初始pH對(duì)α-葡萄糖苷酶活性影響 將發(fā)酵培養(yǎng)基pH分別調(diào)至6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0,菌株MK15活化后的種子液按3%的量接種到裝有50 mL,且米糠添加量為5%的發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中,180 r/min,在溫度35 ℃下發(fā)酵48 h后,平行發(fā)酵3次,按照1.2.2方法制備成待測(cè)樣品,按照1.2.3方法測(cè)試對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率。

1.2.4.4 米糠添加量對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響 發(fā)酵培養(yǎng)基中的米糠添加量分別為0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%,pH為8.0,將菌株MK15活化后的種子液按3%的量接種到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中,180 r/min,在溫度35 ℃下發(fā)酵48 h后,平行發(fā)酵3次,按照1.2.2方法制備成待測(cè)樣品,按照1.2.3方法測(cè)試對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率。

1.2.4.5 裝液量對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響 發(fā)酵培養(yǎng)基中的米糠添加量分別為5%,pH為8.0,將菌株MK15活化后的種子液按3%的量接種到裝有20、30、40、50、60、70、80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中,180 r/min,在溫度35 ℃下發(fā)酵48 h后,平行發(fā)酵3次,按照1.2.2方法制備成待測(cè)樣品,按照1.2.3方法測(cè)試對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率。

1.2.4.6 轉(zhuǎn)速對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響 將菌株MK15活化后的種子液按3%的量接種到裝有50 mL,且米糠添加量為5%,發(fā)酵培養(yǎng)基pH為8.0的250 mL的三角瓶中,將搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為120、140、160、180、200、220 r/min,在溫度35 ℃下發(fā)酵48 h后,平行發(fā)酵3次,按照1.2.2方法制備成待測(cè)樣品,按照1.2.3方法測(cè)試對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化 米糠發(fā)酵工藝在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基初始pH三個(gè)因素,α-葡萄糖苷酶抑制率為響應(yīng)值,結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn),因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平表Table 1 Response surface factors and levels

1.2.6 米糠發(fā)酵產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征

1.2.6.1 米糠發(fā)酵產(chǎn)物的細(xì)微結(jié)構(gòu)觀察 將米糠發(fā)酵產(chǎn)物的凍干粉取微量固定于觀察臺(tái)上,鍍金后,置于掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)下觀察分析[25]。

1.2.6.2 米糠發(fā)酵產(chǎn)物的紅外光譜分析 將米糠發(fā)酵產(chǎn)物凍干粉在80 ℃下烘干,在紅外燈下,將微量樣品和干燥的KBr粉末混合并研磨充分后,用真空的壓片機(jī)壓片,然后用傅里葉紅外光譜儀(Fourier Infrared Chromatography,FT-IR)進(jìn)行掃描,掃描范圍為4000～400 cm-1[26]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 10.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面、數(shù)據(jù)分析及建立回歸模型,用Origin Pro 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 米糠發(fā)酵的單因素實(shí)驗(yàn)

發(fā)酵過(guò)程中影響菌株生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的主要影響因素為培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基初始pH、米糠添加量、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量等,對(duì)以上因素進(jìn)行考察,確定米糠發(fā)酵產(chǎn)Α-葡萄糖苷酶抑制劑的最佳條件。

2.1.1 培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基初始pH、米糠添加量、轉(zhuǎn)速、裝液量對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響 在發(fā)酵前期(24～48 h),隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),發(fā)酵程度加深,α-葡萄糖苷酶抑制劑逐步積累,當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至60 h時(shí),α-葡萄糖苷酶抑制率開始下將(圖1A),到發(fā)酵后期培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)開始貧乏,積累的α-葡萄糖苷酶抑制劑被細(xì)菌當(dāng)做營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)加以利用[4],所以選取48 h作為最適培養(yǎng)時(shí)間。當(dāng)培基溫度較低時(shí),生成α-葡萄糖苷酶的抑制劑較少,當(dāng)發(fā)酵米糠的培養(yǎng)溫度為35 ℃時(shí),對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率最高,培養(yǎng)溫度高于35 ℃時(shí),對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率開始下降,因此選擇35 ℃作為最佳培養(yǎng)溫度(圖1B)。在35 ℃發(fā)酵48 h測(cè)定pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響。發(fā)酵培養(yǎng)基的pH在偏堿性情況下,有利于產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑,當(dāng)pH為8.0時(shí),對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率達(dá)到最好,所以選擇8.0為最佳培養(yǎng)基的pH(圖1C)。

圖1 培養(yǎng)溫度(A)、時(shí)間(B)、pH(C) 對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.1 Effects of culture temperature(A),time(B), pH(C)on α-glucosidase inhibition rate

將培養(yǎng)基中米糠量調(diào)為0～9%,在最優(yōu)條件下發(fā)酵,當(dāng)培養(yǎng)基中不添加米糠時(shí),對(duì)α-葡萄糖苷酶活性沒(méi)有起到抑制的能力,說(shuō)明米糠在發(fā)酵中起到重要作用,在添加量為5%時(shí),對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率最高,表明此時(shí)最有利于生產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑,因此選擇5%米糠添加量最為合適(圖2A)。如圖2B所示,MK15菌株是典型的好氧菌,因此,發(fā)酵時(shí)的通氣狀態(tài)直接影響菌株MK15的生長(zhǎng)狀態(tài)和目的產(chǎn)物,選取裝液量50 mL/250 mL時(shí)是最優(yōu)的。在最優(yōu)條件下,將搖床的轉(zhuǎn)速調(diào)到120～220 r/min,培養(yǎng)48 h后,測(cè)量對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響,結(jié)果如圖2C顯示,搖床轉(zhuǎn)速過(guò)低或過(guò)高均不利于菌株生長(zhǎng),在轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí),對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率最高。

圖2 米糠添加量(A)、搖床轉(zhuǎn)速(B)、裝液量(C) 對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.2 Effects of rice bran addition(A), shaker transformation(B),and liquid loading(C) on α-glucosidase inhibition rate

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和回歸分析 以發(fā)酵體系中的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基初始pH為自變量,α-葡萄糖苷酶抑制率為響應(yīng)值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示;利用Design Expert 8.0.6對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得到的方差分析結(jié)果如表3所示。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Experimental design scheme and results Box-Behnken

多項(xiàng)式的次數(shù)越高,趨勢(shì)值與實(shí)測(cè)值之間的擬合度越好,本文采用多元三次方程對(duì)各因素的相互作用進(jìn)行擬合和預(yù)測(cè)[27]。由表3可見,模型P<0.0001,三次方程模型非常顯著,并且失擬項(xiàng)P=0.9709>0.05不顯著,表明回歸模型的擬合度比較好,誤差較小,R2=0.998>90%,關(guān)聯(lián)性較好,表示該模型可以反映響應(yīng)值變化,該模型能用于分析及預(yù)測(cè)米糠發(fā)酵工業(yè)工藝。得到各因素與響應(yīng)值關(guān)系的多元三次響應(yīng)面回歸模型:抑制率(%)=75.96+3.45A+6.68B-3.29C-13.86AB+1.34AC+2.09BC-30.29A2-21.62B2-29.68C2-17.89A2B+5.53AB2。由表3可得出三因素對(duì)米糠發(fā)酵工藝的影響大小的順序?yàn)?培養(yǎng)時(shí)間>培養(yǎng)基初始pH>培養(yǎng)溫度;兩因素交互對(duì)產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響分析,根據(jù)AB、AC、BC各因素的P值表明,培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的交互作用較為顯著。

表3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance of response surface quadratic regression model

圖3 培養(yǎng)pH與溫度的交互作用對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.3 Effect of the interaction of culture pH and temperature onα-glucosidase inhibition rate

圖4 培養(yǎng)時(shí)間與溫度的交互作用對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.4 Effect of the interaction of culture time and temperature on α-glucosidase inhibition rate

2.2.2 交互效應(yīng)分析 在培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基初始pH某一因素固定不變的情況下,考察了交互項(xiàng)對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響,且對(duì)模型進(jìn)行分析。所得的響應(yīng)面圖和等高線圖如圖3～圖5所示,α-葡萄糖苷酶抑制率隨其中任意兩個(gè)變量的增加均呈上升趨勢(shì),達(dá)到某一定值時(shí),曲面趨于平緩或稍下降,其中圖4曲面陡峭,說(shuō)明時(shí)間和溫度之間交互作用較明顯,與表3中方差分析結(jié)果相符。當(dāng)溫度比較低時(shí),α-葡萄糖苷酶抑制率隨發(fā)酵時(shí)間的增加呈先上升后平緩下降的趨勢(shì),溫度比較高時(shí),抑制率隨著時(shí)間增加先上升,達(dá)到某一定值時(shí)趨于平緩;固定發(fā)酵時(shí)間不變時(shí),α-葡萄糖苷酶抑制率隨溫度增加呈先上升后趨于平緩的趨勢(shì)。綜合響應(yīng)面圖可以看出,發(fā)酵時(shí)間上升的幅度較溫度陡峭,說(shuō)明發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響較大。

圖5 培養(yǎng)pH與時(shí)間的交互作用對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.5 Effect of the interaction of culture pH and timeon α-glucosidase inhibition rate

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為了響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果可靠性,進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。通過(guò)對(duì)模型進(jìn)行分析確定了最適米糠的發(fā)酵工藝條件是:溫度35.1 ℃,時(shí)間49.7 h,pH8.0,在此條件下,對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的理論值為76.6%。選取溫度35 ℃,時(shí)間50 h,pH8.0進(jìn)行驗(yàn)證,重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次并取平均值,所得α-葡萄糖苷酶抑制率是88.8%,基本與模型預(yù)測(cè)值保持同一水平,上述結(jié)果表明響應(yīng)面法對(duì)米糠發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化是有效的。

2.3 米糠發(fā)酵產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 米糠發(fā)酵產(chǎn)物的超微結(jié)構(gòu) 掃描電鏡觀察是研究多糖聚合物形態(tài)結(jié)構(gòu)的重要手段[28]。米糠發(fā)酵產(chǎn)物的SEM形貌如圖6所示,從圖6中可以看到米糠發(fā)酵產(chǎn)物呈現(xiàn)片狀多孔結(jié)構(gòu)。

圖6 米糠發(fā)酵產(chǎn)物的SEM圖像(5000×)Fig.6 SEM image of rice bran fermentation product(5000×)

2.3.2 米糠發(fā)酵產(chǎn)物的紅外光譜分析 FT-IR光譜法通常用于鑒定多糖中糖鏈上的糖鍵結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)[29]。圖7為米糠發(fā)酵產(chǎn)物紅外光譜圖。多糖中含有大量的羥基(O-H),O-H伸縮振動(dòng)在3200～3600 cm-1之間通常表現(xiàn)為強(qiáng)而寬的吸收峰。因此,在米糠發(fā)酵產(chǎn)物FT-IR光譜中3424 cm-1處的峰值可以歸因?yàn)镺-H伸縮振動(dòng)[30]。2938.06cm-1處的強(qiáng)峰是由C-H伸縮振動(dòng)引起的[28],1650～1540 cm-1區(qū)域的吸收度是由于烯醇和酰胺基團(tuán)的伸縮振動(dòng)[31]。1200～1400 cm-1吸收峰是C-H變角振動(dòng)引起的。1076 cm-1處的吸收峰是呋喃糖環(huán)C-O-C的C-O伸縮振動(dòng)引起,且是多糖類的另外一個(gè)特征吸收峰。872 cm-1是α-1,3、α-1,4和α-1,6糖苷鍵的特征吸收蜂,756 cm-1是α-1,6糖苷鍵的吸收峰,結(jié)果表明米糠發(fā)酵產(chǎn)物含有不同糖苷支鏈的多糖。

圖7 米糠發(fā)酵產(chǎn)物的紅外光譜圖(500～4000 cm-1)Fig.7 FT-IR spectrum of purified rice bran fermentation products(500～4000 cm-1)

3 結(jié)論

本研究用枯草芽孢桿菌MK15發(fā)酵米糠,其產(chǎn)物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性有較強(qiáng)抑制作用。采用響應(yīng)面法對(duì)米糠產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。最佳條件為:培養(yǎng)溫度35 ℃、培養(yǎng)時(shí)間50 h、培養(yǎng)基初始pH為8.0。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率為88.8%,與理論預(yù)測(cè)值接近,比優(yōu)化前提高了25.1%。通過(guò)SEM對(duì)米糠發(fā)酵產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征,米糠發(fā)酵產(chǎn)物脫水后可形成多孔塊狀結(jié)構(gòu);FT-IR的結(jié)果表明發(fā)酵產(chǎn)物為含有側(cè)鏈的多糖類物質(zhì)。研究結(jié)果為提高米糠的綜合利用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供了科學(xué)依據(jù)。