不同可食階段蠶豆結(jié)合酚抗氧化活性的研究

張?zhí)礻?陳友霞,劉珍珍,林 琳,洪 玥,高春燕

(大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,云南大理 671000)

蠶豆(ViciafabaL.)別名胡豆、南漢豆和利馬豆等,豌豆屬,起源于非洲北部和亞洲西南部,最早可追溯到公元前6250年,我國已有2000多年的栽培史[1]。蠶豆是世界上重要栽培的豆科植物之一,在中國種植廣泛,中國西南部和西北部是主要種植地區(qū)[2]。蠶豆含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)(如鈣、磷)、維生素,人們常以蠶豆作為蛋白補(bǔ)充劑,在貧窮國家是動物蛋白質(zhì)的有效替代品[3-4]。此外,蠶豆中還包含大量的生物活性物質(zhì),如原花青素、酚類化合物、黃酮類化合物等[5]。

氧化應(yīng)激是心血管疾病、神經(jīng)障礙性疾病(如阿爾茨海默病和帕金森病)、糖尿病、高血壓和癌癥等相關(guān)疾病的標(biāo)志[6-7]。植物性食品中的天然酚類化合物作為抗氧化劑,可以延緩或抑制氧化損傷,從而防止人體內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的發(fā)生[8]。植物多酚通常以游離和結(jié)合形式存在,與游離酚相比,結(jié)合酚是與其他物質(zhì)結(jié)合而存在的酚類化合物,較難萃取[9],但同樣具有很強(qiáng)的抗氧化活性。目前,關(guān)于蠶豆的研究主要以成熟的干蠶豆為主,且對其酚類化合物以及抗氧化活性的研究主要集中在游離酚部分[10-13]。然而,在云南,未完全成熟的蠶豆種子作為一種蔬菜被廣泛食用。

本文以五個品種的未成熟蠶豆為原料,通過測定種皮和胚在三個不同可食階段結(jié)合酚提取物總酚、黃酮、縮合單寧含量和抗氧化活性,以期為云南蠶豆品種的選擇、培育、采收、推廣及消費(fèi)者科學(xué)選購和食用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠶豆 鳳豆6號(FD6)、鳳豆13號(FD13)、鳳豆15號(FD15)、鳳豆17號(FD17)、鳳豆18號(FD18),均種植于大理州農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶豆研究基地,三個可食階段分別為S1(138 DAS)、S2(156 DAS)和S3(173 DAS);乙二胺四乙酸(EDTA) 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;抗壞血酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;AB-8大孔吸附樹脂 滄州寶恩吸附材料科技有限公司;2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、四氮唑紅(TPTZ)、Trolox、Folin酚 Sigma試劑公司;沒食子酸 成都市科龍化工試劑廠;兒茶素 晶博生物科技有限公司;無水乙醇、香草醛、濃鹽酸、甲醇等 均為國產(chǎn)分析純。

Scientz-ND型系列真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;DFY-600搖擺式高速萬能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司;JA3003電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;SHZ-DⅢ予華牌循環(huán)水真空泵 鞏義市予華儀器有限公司;RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司;HZS-HA水浴振蕩器 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠;722N可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司;恒溫水浴箱 金壇市大地自動化儀器廠;SK8210HP超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的前處理 蠶豆手工去除豆莢后,冷凍干燥。將干燥后的蠶豆手工分為種皮和胚兩部分,粉碎,過60目篩,儲存至-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蠶豆結(jié)合酚的提取 參考文獻(xiàn)[14]的方法稍作修改,分別準(zhǔn)確稱取種皮3.0 g、胚5.0 g,按料液比1∶10加入80%甲醇,室溫下50 kHz超聲輔助提取10 min,抽濾,留殘?jiān)?此步驟重復(fù)3次,向剩余殘?jiān)蟹謩e加入適量含有EDTA和抗壞血酸的NaOH溶液,避光反應(yīng)4 h,用6 mol/L HCl調(diào)至pH=1,抽濾,濾液乙酸乙酯萃取5～6次(每次30 mL乙酸乙酯),收集乙酸乙酯相于35 ℃旋蒸至無乙酸乙酯滴下,用甲醇溶解并定容至5 mL,得蠶豆種皮和胚結(jié)合酚提取液。

1.2.3 總酚含量(TPC)測定 參考黃菊華[15]的方法,取100 μL結(jié)合酚提取液與等體積Folin-酚反應(yīng)3 min,加入2 mL 7.5% Na2CO3,蒸餾水定容至5 mL,避光反應(yīng)40 min,在波長760 nm處測吸光度值。以沒食子酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:y=0.073x+0.0621,R2=0.9946。蠶豆種皮和胚中總酚含量測定結(jié)果以mg GAE/g DW表示。

1.2.4 黃酮含量(FC)測定 參考文獻(xiàn)[11],稍加修改,取一定體積結(jié)合酚提取液,用純甲醇補(bǔ)足至2.5 mL,加入0.15 mL 5% NaNO2,搖勻靜置6 min,加入0.15 mL 10%AlCl3,搖勻靜置6 min,加入2 mL 4% NaOH,蒸餾水定容至5 mL,避光15 min,于波長510 nm處測吸光度值。以兒茶素做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:y=0.00062x+0.0062,R2=0.9976。蠶豆種皮和胚中黃酮含量測定結(jié)果以mg CAE/g DW表示。

1.2.5 縮合單寧含量(CTC)測定 參考劉婷婷等[16]的方法,取一定體積結(jié)合酚提取液,加入1.5 mL 4%香草甲醇溶液,再加入0.75 mL濃HCl,純甲醇定容至5 mL,避光反應(yīng)20 min,在波長為510 nm處測吸光度值。以兒茶素做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:y=0.0032x+0.0117,R2=0.9967。蠶豆種皮和胚中縮合單寧含量測定結(jié)果以mg CAE/g DW表示。

1.2.6 DPPH自由基清除能力測定 根據(jù)Lu等[17]的方法進(jìn)行測定,酚提取物稀釋至合適濃度,將150 μL酚溶液與3.5 mL DPPH(60 μmol/L)的甲醇溶液混合,在室溫條件下,避光靜置30 min,于517 nm處記錄吸光度值。DPPH清除率公式如下:

式中:A2為0.15 mL酚提取液+3.5 mL DPPH溶液的吸光度值;A1為0.15 mL酚提取液+3.5 mL甲醇溶液的吸光度值;A0為0.15 mL甲醇+3.5 mL DPPH溶液的吸光度值。

以Trolox(50～400 μmol/L)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得曲線方程為y=0.1681x+7.8795(R2=0.9991),蠶豆結(jié)合酚DPPH自由基清除能力以μmol Trolox等量每克蠶豆種皮和胚干重表示(μmol TE/g DW)。

1.2.7 Trolox等量抗氧化活性(TEAC)測定 參照Lu等[17]描述的方法,ABTS工作液是將ABTS用蒸餾水配成7 mmol/L的溶液,與終濃度為2.45 mmol/L的過硫酸鉀混合,室溫下暗反應(yīng)12～16 h,以產(chǎn)生ABTS自由基,用甲醇溶液稀釋,使在734 nm處的吸光度達(dá)到0.7±0.02。將25 μL各稀釋液蠶豆結(jié)合酚與2 mL ABTS工作液混合,室溫下靜置6 min,在734 nm處測吸光度值。以Trolox(100～1000 μmol/L)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為y=-0.0004x+0.6684(R2=0.9997),蠶豆結(jié)合酚Trolox等量抗氧化活性結(jié)果以μmol Trolox等量每克蠶豆種皮和胚干重表示(μmol TE/g DW)。

表1 不同可食階段蠶豆結(jié)合酚TPC、FC和CTCTable 1 TPC、FC and CTC of bound phenolics from broad beans at different edible stages

1.2.8 鐵還原抗氧化能力(FRAP)測定 參考文獻(xiàn)[17],FRAP工作液是用300 mmol/L乙酸鈉緩沖液(pH3.6)、10 mmol/LTPTZ溶液(用40 mmol/L HCl溶液配制)和20 mmol/L FeCl3溶液按10∶1∶1的體積制備。取100 μL各濃度蠶豆結(jié)合酚與1.4 mL新鮮制備的FRAP工作液以及2 mL蒸餾水,混合搖勻,37 ℃下水浴30 min,在593 nm處測定吸光度。以FeSO4做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為y=0.0006x-0.0119(R2=0.9987),蠶豆結(jié)合酚鐵還原抗氧化能力結(jié)果以μmol Fe(Ⅱ)每克蠶豆種皮和胚干重表示(μmol Fe(II)/g DW)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同可食階段蠶豆結(jié)合酚TPC、FC和CTC

不同可食階段蠶豆種皮和胚結(jié)合酚提取物TPC、FC和CTC如表1所示。就種皮而言,TPC、FC和CTC范圍分別為1.03～2.23、1.72～3.98和0.71～1.47 mg CAE/g DW。就胚而言,未檢測到CTC,TPC和FC范圍分別為0.01～0.43和0.02～0.23 mg GAE/g DW。蠶豆種皮和胚結(jié)合酚提取物TPC總和與FC總和低于程安瑋[10]等人的研究結(jié)果(10.11、5.08 mg CAE/g)。這可能與品種、產(chǎn)地、培育條件以及提取方法有關(guān)[11,18]。

在種皮中,FD17的S1階段TPC、FC和CTC最低,FD18的S2階段TPC、FC和CTC最高。在胚中,FD18的S2階段TPC和FC最高。因此,可選擇食用S2階段的FD18,以攝入較多的酚類化合物。不同品種和各可食階段含量差異可能與基因型、土壤成分、文化、氣候和遺傳因素有關(guān)[19]。采用析因分析檢驗(yàn)了品種和可食階段對TPC的交互作用,結(jié)果顯示P<0.01,說明蠶豆種皮和胚結(jié)合酚提取物TPC含量受到品種和可食階段兩因素的共同作用。

此外,五種蠶豆種皮結(jié)合酚提取物中的TPC、FC、CTC均明顯高于胚,說明種皮是蠶豆中酚類物質(zhì)的主要合成部分,這與Selen等[20]的研究結(jié)果一致。酚類化合物通常會在特定的細(xì)胞中積累,并根據(jù)其作為屏蔽紫外線和抗氧化劑的作用,這些化合物可以被很好地儲存在表皮層[21]或葉子和果實(shí)的表皮中[22],這與蠶豆酚類物質(zhì)的分布結(jié)果一致。蠶豆種皮和胚結(jié)合酚提取物中TPC、FC和CTC均低于Lu等[23]報道的游離酚提取物中的含量,說明在蠶豆中酚類物質(zhì)主要以游離態(tài)的形式存在。

2.2 不同可食階段蠶豆結(jié)合酚抗氧化能力

表2 不同可食階段蠶豆種皮和胚結(jié)合酚的抗氧化能力Table 2 Antioxidant activity of bound phenolic extracts of seed coats and cotyledons at different edible stages

表3 酚類化合物與抗氧化能力的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of phenolic compounds and antioxidant capacity

采用DPPH自由基清除能力,Trolox等量抗氧化能力(TEAC)和鐵還原抗氧化能力(FRAP)評價蠶豆種皮和胚中結(jié)合酚的抗氧化能力,結(jié)果見表2。在種皮部分,DPPH自由基清除能力、TEAC和FRAP的范圍分別為7.02～13.70、12.54～36.57 μmol TE/g DW和21.12～51.35 μmol Fe(II)/g DW;在胚部分,DPPH自由基清除能力、TEAC和FRAP的范圍分別為0.01～2.70、0.23～4.57 μmol TE/g DW和0.08～11.31 μmol Fe(II)/g DW。

主成分分析通常用于解釋樣本之間的差異,并獲取主要影響樣本異同的變量信息[24]。應(yīng)用主成分分析比較五種蠶豆總抗氧化能力強(qiáng)弱,結(jié)果用得分排序的方式呈現(xiàn),見表2。在種皮中,FD17的S1階段總抗氧化能力最弱;在胚中,FD17的S3階段總抗氧化能力最弱;無論種皮還是胚,FD18的S2階段總抗氧化能力最強(qiáng)。另外,種皮的抗氧化能力明顯高于胚。Peng等[25]研究發(fā)現(xiàn)黑豆種皮中總酚含量、DPPH、TEAC和FRAP值均高于胚,這與本文研究結(jié)果一致。

2.3 酚類化合物含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

蠶豆種皮和胚結(jié)合酚TPC、FC、CTC相關(guān)性分析結(jié)果見表3。結(jié)果表明,在種皮部分,TPC和CTC呈顯著相關(guān)(P<0.05)、與FC呈極顯著相關(guān)(P<0.01),CTC和FC呈極顯著相關(guān)(P<0.01);在胚部分,TPC和FC呈極顯著相關(guān)(P<0.01)。這表明在種皮中,黃酮和縮合單寧是主要的酚類化合物,對總酚含量都具有顯著的貢獻(xiàn),而在胚中,僅黃酮是主要的酚類化合物,且無論是種皮還是胚,在整個可食過程中,總酚含量與黃酮、縮合單寧含量的變化趨勢一致。

酚類化合物與抗氧化活性相關(guān)性分析結(jié)果見表3。在種皮中,TPC和FC與DPPH、FRAP呈極顯著相關(guān)(P<0.01),與TEAC無顯著相關(guān)性(P>0.05),CTC與DPPH、TEAC、FRAP呈極顯著相關(guān)(P<0.01);在胚中,TPC和FC與DPPH、TEAC、FRAP均呈極顯著相關(guān)(P<0.01)。Benarfa等[26]和Valente等[27]研究發(fā)現(xiàn)酚類化合物含量越高,抗氧化能力越強(qiáng),與本文研究結(jié)果一致。酚類化合物含量和抗氧化能力之間相關(guān)性的差異可能歸因于品種、測定原理、溶劑提取系統(tǒng)以及含有兩種或多種抗氧化物質(zhì)的復(fù)雜提取物等方面。同時,研究發(fā)現(xiàn)非酚類化合物對抗氧化能力也有很大貢獻(xiàn),提取物的抗氧化活性不僅與酚含量有關(guān),還與酚類成分的類型有關(guān)[23]。

不同抗氧化能力相關(guān)性分析結(jié)果顯示,除種皮中TEAC與FRAP無相關(guān)性外,其余均具有顯著或極顯著的相關(guān)性,這與其原理都是電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)有關(guān)[28]。

3 結(jié)論

對五個不同品種蠶豆在三個可食階段結(jié)合酚的總酚含量、黃酮含量、縮合單寧含量、抗氧化活性進(jìn)行了測定,并分析了總酚、黃酮和縮合單寧含量與抗氧化活性的相關(guān)性。結(jié)果表明,五個品種的蠶豆中酚類物質(zhì)和抗氧化活性在不同可食階段具有差異,FD18在S2階段酚含量最高,總抗氧化能力也最強(qiáng),可選擇食用S2階段的FD18,以攝入較多的抗氧化物質(zhì)。就同一品種而言,可選擇總酚含量最高的食用階段進(jìn)行采收。此外,蠶豆種皮的酚類化合物含量和抗氧化活性高于胚,這表明應(yīng)高度重視種皮的開發(fā)利用。