乳酸鏈球菌素抑菌機(jī)理及在食品保鮮中的研究進(jìn)展

王佳宇,胡文忠,*,管玉格,于皎雪,趙曼如

(1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600; 2.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116024)

微生物是引起食品腐敗變質(zhì)的主要原因,使用防腐劑可以有效減緩食品腐敗變質(zhì)的發(fā)生,延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期。而大多數(shù)研究學(xué)者考慮到仲丁胺、撲海因、抗菌靈等化學(xué)防腐劑的殘留安全性問(wèn)題,綠色、安全、高效的天然生物防腐劑近年來(lái)逐漸成為食品保鮮領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1]。而乳酸鏈球菌素作為一種安全無(wú)毒的天然防腐劑,早于1969年就被世界衛(wèi)生組織(WHO)批準(zhǔn)用作食品防腐劑,并于1988年被美國(guó)食品藥品管理局(FDA)列入一般公認(rèn)安全(Generally Recognized as Safe,GRAS)名單[2]。而且由于乳酸鏈球菌素(Nisin)攝入后可快速被人體中的蛋白酶(如胰蛋白酶、胰酶、唾液酶等)消化分解為各種氨基酸,不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用,因此其近年來(lái)已被商業(yè)化廣泛應(yīng)用于食品保鮮行業(yè)[3-4]。乳酸鏈球菌素又稱為乳鏈菌肽,是由乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcuslactissubsp. Lactis)某些菌株代謝過(guò)程中合成的一種含有34個(gè)氨基酸殘基的多肽型生物防腐劑[5-6]。乳酸鏈球菌素具有良好的抑菌性,可有效地抑制金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌、嗜熱鏈球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng),尤其是細(xì)菌芽孢的生長(zhǎng)[7-9]。本文主要是對(duì)乳酸鏈球菌素的抑菌機(jī)理及其近10年來(lái)在食品保鮮領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)行介紹,并討論了其在今后的發(fā)展方向,以期為乳酸鏈球菌素在食品保鮮應(yīng)用中的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供參考。

1 乳酸鏈球菌素的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)

1.1 結(jié)構(gòu)

乳酸鏈球菌素是由核糖體合成的由34個(gè)氨基酸組成的小蛋白質(zhì)抗菌素,分子式為C143H220N42O37S7,分子量為3510 Da。乳酸鏈球菌素目前的類型主要有 A、B、C、D、E、Z和Q。其中研究最多的就是Nisin A和Nisin Z,二者在組成上只有第27位氨基酸殘基不同,即Nisin A為組氨酸殘基,而Nisin Z為天冬酰胺殘基[10]。而Nisin Q是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的天然異構(gòu)體,其與Nisin A和Nisin Z分別有3個(gè)和4個(gè)氨基酸的差異[11]。

乳酸鏈球菌素分子常以二聚體或四聚體的形式存在,其含有一些修飾性的氨基酸殘基,包括羊毛硫氨酸(Lanthionine)、β-甲基羊毛硫氨酸(β-methyllanthionine)、甲基脫氫丙氨酸(Dehy drobutyrine,Dhb)以及脫氫丙氨酸(Dehydroalanine,Dha)等[12]。乳酸鏈球菌素的分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示[13]。

圖1 乳酸鏈球菌素分子結(jié)構(gòu)[13]Fig.1 The molecular structural formula of nisin[13]

1.2 理化性質(zhì)

乳酸鏈球菌素的溶解度受pH的影響,有結(jié)果表明隨著pH的升高,其溶解度逐漸降低,當(dāng)pH在8.5左右時(shí)乳酸鏈球菌素的溶解度處于較為平穩(wěn)的狀態(tài)[14]。同時(shí)乳酸鏈球菌素的穩(wěn)定性也與pH密切相關(guān),在pH較高即堿性條件下,乳酸鏈球菌素極不穩(wěn)定,容易失活。而當(dāng)乳酸鏈球菌素在酸性條件下,尤其當(dāng)pH<2.0時(shí)可耐受121 ℃滅菌而不失活。同時(shí)也有研究表明,當(dāng)pH為2.2時(shí),在0.5%的三氟乙酸(TFA)環(huán)境下,乳酸鏈球菌素可在低溫下存放數(shù)月,且化學(xué)性質(zhì)和抑菌活性不會(huì)發(fā)生改變[15]。

2 乳酸鏈球菌素的抑菌性及抑菌機(jī)理

2.1 抑菌性

大量研究表明,乳酸鏈球菌素具有良好的抑菌作用。如呂淑霞等[16]以及一些學(xué)者研究結(jié)果表明,乳酸鏈球菌素能夠抑制金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌、嗜熱鏈球菌等大部分革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)和繁殖,特別是對(duì)芽孢的抑制作用明顯。然而雖然乳酸鏈球菌素對(duì)革蘭氏陰性菌、霉菌以及酵母菌無(wú)直接抑制作用,但也有研究表明,在和某些絡(luò)合劑(如EDTA或檸檬酸等)聯(lián)合使用或經(jīng)冷凍、超高壓(UHP)、調(diào)節(jié)pH、脈沖電場(chǎng)(PEF)以及加熱等條件處理下,可有效將乳酸鏈球菌素的抑菌活性譜拓寬到部分革蘭氏陰性菌(比如大腸桿菌、沙門氏菌等)[17]。

2.2 抑菌機(jī)理

對(duì)于乳酸鏈球菌素的抑菌機(jī)理國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了較長(zhǎng)時(shí)間深入研究,但目前對(duì)其機(jī)理還未有明確的定論,許多學(xué)者也在進(jìn)一步研究中。有研究表明,乳酸鏈球菌素可以改變有害微生物細(xì)胞的pH,使細(xì)胞瀕臨死亡[18];也有些學(xué)者認(rèn)為乳酸鏈球菌素之所以可以抑制細(xì)菌生長(zhǎng),是因?yàn)槿樗徭溓蚓胤肿又忻摎浔彼?DHA)和β-甲基脫氫丙氨酸(DHB)可以與細(xì)菌細(xì)胞膜上的某些酶發(fā)生化學(xué)反應(yīng),從而使細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流出,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡[19];而Zhao等[20]分析金黃色葡萄球菌基因表達(dá)譜指出,乳酸鏈球菌素可以通過(guò)阻礙金黃色葡萄球菌中主要功能性基因的轉(zhuǎn)錄,來(lái)抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)和繁殖,從微觀的方面也對(duì)乳酸鏈球菌素的抑菌機(jī)理提供了重要的線索。

而在眾多乳酸鏈球菌素的抑菌機(jī)理中,“孔道理論”[21]得到了較為廣泛的認(rèn)同,并且也是近年來(lái)許多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。“孔道理論”主要是指乳酸鏈球菌素可以使微生物細(xì)胞膜中形成孔道,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷、核苷酸以及氨基酸等小分子物質(zhì)快速流出,導(dǎo)致細(xì)胞的生物合成過(guò)程受阻,從而使微生物細(xì)胞裂解死亡。其主要有兩種模式,第一種是“楔形”模型,是指乳酸鏈球菌素與細(xì)胞膜緊密結(jié)合后,C端與微生物細(xì)胞脂質(zhì)的靜電吸引力會(huì)使得乳酸鏈球菌素慢慢插入到脂質(zhì)雙分子層,從而在膜上形成孔道。而且少量即微摩爾濃度的乳酸鏈球菌素便可形成這種孔道模型,如圖2(a)所示;第二種模式是乳酸鏈球菌素的N端可與微生物細(xì)胞壁的合成前體脂質(zhì)Ⅱ相結(jié)合,將其作為后續(xù)孔形成的對(duì)接分子,阻止前體脂質(zhì)Ⅱ參與肽聚糖的合成,從而破壞細(xì)胞壁并形成高度特異性的孔,而且該孔道比第一種模式形成的孔徑更大且更穩(wěn)定,如圖2(b)所示[22]。

圖2 乳酸鏈球菌素抑菌機(jī)理[22]Fig.2 Antibacterial mechanism of Nisin[22]

3 乳酸鏈球菌素在食品保鮮中的應(yīng)用

乳酸鏈球菌素因其具有良好的抑菌防腐功能,且安全無(wú)毒的特點(diǎn),目前已被廣泛應(yīng)用于果蔬、乳制品、肉制品和酒制品等防腐保鮮中。

3.1 在采后果蔬中的應(yīng)用

果蔬,尤其是對(duì)于含水量較高的果蔬在運(yùn)輸、貯藏以及銷售過(guò)程中極易遭受微生物的侵染,導(dǎo)致果蔬發(fā)生腐敗變質(zhì),從而降低其商品價(jià)值,縮短貨架期[23-24]。

3.1.1 完整果蔬 研究發(fā)現(xiàn),甜櫻桃經(jīng)乳酸鏈球菌素溶液清洗后,使致腐微生物沙門氏菌的菌液濃度大大降低。同時(shí)研究者還發(fā)現(xiàn),使用乳酸鏈球菌素與檸檬酸復(fù)配處理甜櫻桃,可更加有效地抑制沙門氏菌的生長(zhǎng),將其菌落濃度降至檢測(cè)限以下[25]。而且近年來(lái),研究者重點(diǎn)開發(fā)了乳酸鏈球菌素與其它制劑聯(lián)合使用的技術(shù)。使用結(jié)冷膠、瓜爾豆膠與乳酸鏈球菌素制備的食用復(fù)合膜可有效地抑制荸薺貯藏過(guò)程中枯草芽孢桿菌、大腸桿菌以及面包酵母的生長(zhǎng),將貯藏期內(nèi)荸薺果實(shí)的好果率提高了30%,并且也發(fā)現(xiàn)隨著乳酸鏈球菌素濃度的增加,食用復(fù)合膜的抑菌性也隨之增強(qiáng)[26]。除此之外,使用殼聚糖、異硫氰酸烯丙酯與乳酸鏈球菌素復(fù)配處理哈密瓜后,發(fā)現(xiàn)同樣可以有效抑制哈密瓜中沙門氏菌的生長(zhǎng),提高其在貯藏期間的食品安全性[27]。

3.1.2 鮮切果蔬 鮮切果蔬是指以新鮮果蔬為原料,經(jīng)分級(jí)、清洗、去皮、切分、包裝等一系列處理后,再進(jìn)入貨架銷售的即食或即用的果蔬制品[28-29]。但是鮮切果蔬由于加工過(guò)程中造成的機(jī)械損傷,會(huì)使果肉與空氣的接觸面積增大,增加微生物侵染的機(jī)率,導(dǎo)致鮮切果蔬失去新鮮產(chǎn)品特征的同時(shí)也增加了潛在的食品安全問(wèn)題[30-31]。

研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)或與有機(jī)鹽(檸檬酸鈉或乙酸鈉)復(fù)合使用乳酸鏈球菌素處理鮮切番茄,均可顯著地降低單增李斯特菌的數(shù)量,尤其是與5%檸檬酸鈉復(fù)合處理可將單增李斯特菌的數(shù)量減2.56～3.48 log CFU/mL[32]。在鮮切皇冠梨上,同樣使用檸檬酸與乳酸鏈球菌素復(fù)配溶液處理可有效抑制單增李斯特菌的生長(zhǎng)[33]。此外,含有乳酸鏈球菌素的纖維素膜可使鮮切芒果中單核細(xì)胞增生李斯特菌的活菌數(shù)量、金黃色葡萄球菌數(shù)量大大降低,而且不會(huì)對(duì)芒果果實(shí)的外觀、質(zhì)地以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值產(chǎn)生不良的影響[34]。

此外,乳酸鏈球菌素還研究用于生菜[35]、苦瓜[36]、白玉枇杷[37-38]、采后杏鮑菇[39]、鮮切蓮藕[40]、鮮切蘋果[41]、鮮切胡蘿卜[42]以及鮮切洋蔥[43]等方面,同樣具有良好的保鮮效果。

3.2 在乳制品中的應(yīng)用

菌落總數(shù)是用于判定乳制品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。乳制品經(jīng)過(guò)巴氏殺菌后仍會(huì)有部分致病菌存活,對(duì)人體存在安全危害[44],而目前乳酸鏈球菌素作為食品防腐劑現(xiàn)已在乳制品保鮮中廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn),添加乳酸鏈球菌素可以有效地抑制奶酪中金黃色葡萄球菌以及李斯特菌的生長(zhǎng)[45]。益生菌乳飲料經(jīng)添加乳酸鏈球菌素不僅可有效地降低其活菌數(shù),而且還可以影響益生菌乳飲料的后酸化[46]。此外,也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌素與有機(jī)酸鹽聯(lián)合使用可抑制硬質(zhì)奶酪中李斯特菌的生長(zhǎng),同時(shí)該學(xué)者還發(fā)現(xiàn)山梨酸鉀、丙酸鈣、乳酸鈉和乳酸鏈球菌素還具有協(xié)同抗菌的作用[47]。

3.3 在肉制品中的應(yīng)用

在肉制品保鮮中常添加硝酸鹽或亞硝酸鹽抑制肉毒梭狀芽孢桿菌的生長(zhǎng),但是亞硝酸鹽的存在會(huì)進(jìn)一步產(chǎn)生有致癌性的亞硝胺,對(duì)人體產(chǎn)生危害。而在肉制品中添加乳酸鏈球菌素后可以降低亞硝酸鹽的添加量,且同樣可起到良好保鮮效果。在新鮮的瘦牛肉里添加乳酸鏈球菌素可有效地抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌和芽孢桿菌等的生長(zhǎng),延長(zhǎng)瘦牛肉的貯存期[48]。使用花椒提取物和乳酸鏈球菌素復(fù)配處理冷鮮肉,可有效地降低菌落總數(shù),將冷鮮肉的貨架期延長(zhǎng)6 d[49]。此外,乳酸鏈球菌素與乙二胺四乙酸(螯合劑EDTA)聯(lián)合使用同樣也有助于肉制品的保存[50]。

3.4 在酒制品中的應(yīng)用

在啤酒釀造過(guò)程中很容易受到革蘭氏陽(yáng)性菌(如啤酒片球菌或乳桿菌)的影響,如果長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存,啤酒會(huì)出現(xiàn)渾濁、發(fā)酸等現(xiàn)象。而一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)由于乳酸鏈球菌素其既可以抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng),又不會(huì)影響酵母菌的活性,因此被較為廣泛的應(yīng)用于啤酒生產(chǎn)中[51]。除此之外,學(xué)者們也研究發(fā)現(xiàn)了乳酸鏈球菌素在葡萄酒、藍(lán)莓果酒等酒精飲品保鮮中的應(yīng)用[52-53],且均可有效地提高商品價(jià)值,延長(zhǎng)其貨架期。

除上述之外,目前乳酸鏈球菌素也有在即食制品(桶子雞[54]、紅酸湯[55]、中式臘腸[56]、軟耗牛肉干[18]、低鹽醬菜[57]、糕點(diǎn)[58])、豆制品(豆腐[59]、大豆分離蛋白[60]、鹵豆干[61])、罐藏制品(雞汁鮑魚罐頭[62]、牛排罐頭[63])以及水產(chǎn)制品(狹鱈魚片[64])等保鮮中應(yīng)用研究,且均呈現(xiàn)了較為理想的保鮮效果。

4 展望

乳酸鏈球菌素作為國(guó)際公認(rèn)的一種天然、高效、安全的生物防腐劑,已被多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛應(yīng)用于果蔬、乳制品、肉制品、酒制品、即食制品以及豆制品等食品保鮮行業(yè)中。但由于其市場(chǎng)價(jià)格昂貴、抑菌圖譜較窄等因素,在一定程度上限制了乳酸鏈球菌素的發(fā)展,因此今后的研究重點(diǎn)可以通過(guò)基因工程等生物技術(shù)手段提高乳酸鏈球菌素的抑菌譜,制造出更加適合食品保鮮的生物防腐劑。另一方面,雖然乳酸鏈球菌素在各個(gè)食品保鮮領(lǐng)域中的應(yīng)用效果較好,但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其抑菌機(jī)理的研究還不明晰。因此,今后應(yīng)著重研究乳酸鏈球菌素保鮮機(jī)理,為其指導(dǎo)商業(yè)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。