全譜解卷積核磁共振定量法測定嬰幼兒配方乳粉中23種小分子有機(jī)物

李 瑋,王奕寒,姜 潔,林 立

(北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評估中心,北京 100094)

嬰幼兒配方乳粉是以母乳組成的營養(yǎng)元素為標(biāo)準(zhǔn),以牛乳、羊乳等為原料,適當(dāng)添加營養(yǎng)素使其組成在數(shù)量上、質(zhì)量和生物學(xué)功能上都無限接近于母乳,符合嬰兒消化吸收和營養(yǎng)需要的特殊食品。為最大程度地模擬母乳,滿足嬰幼兒的生長發(fā)育需要,生產(chǎn)廠商會按照配方設(shè)計(jì)添加核苷酸、有機(jī)酸、氨基酸等添加劑,這些小分子物質(zhì)在嬰幼兒的免疫調(diào)節(jié)、提高記憶力、改善腸道菌群及促進(jìn)機(jī)體代謝等方面都發(fā)揮重要的作用[1-5]。因此,對配方乳粉中多種小分子物質(zhì)的測定對乳粉的質(zhì)量評價(jià)和精確模擬母乳成分具有重要意義。

核磁共振定量(Quantitative Nuclear Magneticresonance,qNMR)分析方法以結(jié)構(gòu)測定為基礎(chǔ),是一種可以從整體角度對食品的化學(xué)成分進(jìn)行定性、定量綜合分析的現(xiàn)代分析方法。因其非靶向、無偏向的分析特點(diǎn),qNMR分析方法在食品生產(chǎn)中原料的質(zhì)量控制、產(chǎn)品穩(wěn)定性、生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的新物質(zhì)成分及產(chǎn)品研發(fā)過程中品質(zhì)的鑒別等領(lǐng)域,具有很好的檢測優(yōu)勢[6-9]。

與目前國標(biāo)及文獻(xiàn)中報(bào)道的分光光度法[10-11]、液相[12-14]、氣相[15]、質(zhì)譜[16]等傳統(tǒng)檢測方法相比,qNMR法能夠同時(shí)測定多種小分子物質(zhì),具有前處理過程簡單、取樣量小、專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)的qNMR法是在樣品中加入已知量的化合物作為校正參比內(nèi)標(biāo),將被測樣品定量質(zhì)子的信號峰面積與內(nèi)標(biāo)物定量信號峰面積進(jìn)行比較,最終確定樣品的濃度[17]。因此,qNMR法的準(zhǔn)確性依賴于完整清晰的定量信號峰和準(zhǔn)確的定量峰積分面積。然而,嬰幼兒配方乳粉的成分復(fù)雜,小分子水溶性成分結(jié)構(gòu)相似、含量不高,1H-NMR信號峰會出現(xiàn)信號峰重疊,難以辨認(rèn)。采用傳統(tǒng)qNMR方法進(jìn)行定量分析時(shí),會遇到無法得到完整信號積分,受相位、基線調(diào)節(jié)影響大等問題,從而影響定性、定量的準(zhǔn)確性。全譜解卷積(Global Spectral Deconvolution,GSD)是一種NMR的信號處理方法,能夠在幾秒鐘內(nèi)對整個(gè)圖譜進(jìn)行解卷積處理,整合復(fù)雜峰重疊信號,從而提供完整的峰形、化學(xué)位移、耦合常數(shù)及積分信息,非常適合1H-NMR信號重疊、信噪比不高的物質(zhì)定量分析。同時(shí),GSD處理可以降低1H-NMR圖譜積分對基線和相位調(diào)節(jié)的要求,使積分值更加穩(wěn)定和準(zhǔn)確[18]。目前,關(guān)于NMR的乳品研究報(bào)道多集中在牛乳、人乳的代謝輪廓研究[19-22],少量的嬰幼兒配方乳粉NMR定量研究也都采用傳統(tǒng)qNMR方法進(jìn)行定量[23-25]。

本研究首先對嬰幼兒配方乳粉水溶液的1H-NMR圖譜中的核苷酸、核苷、有機(jī)酸、氨基酸等23個(gè)小分子水溶性物質(zhì)進(jìn)行信號歸屬,在此基礎(chǔ)上,建立了無需對照品的快速、專屬、簡單的嬰幼兒配方乳粉中23個(gè)小分子化合物含量的GSD-qNMR同時(shí)測定方法。采用建立的定量方法對實(shí)際樣品進(jìn)行了測定,以期為今后嬰配乳粉的配方研發(fā)、產(chǎn)品生產(chǎn)、質(zhì)量質(zhì)控、安全檢測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

不同批次廠家的嬰幼兒配方乳粉 購于本市超市,均在保質(zhì)期內(nèi),開啟后密閉容器內(nèi)4 ℃保存;重水(D2O,氘代度:99.8%)、3-(三甲基硅基)氘代丙酸鈉(TMSP) 美國CIL公司;PBS溶液(pH=7.4) 美國Thermo Fisher公司;超濾離心管(3KD) 美國Millipore公司;Norell 5 mm核磁管 美國Norell公司。

Bruker AVANCE 600 MHZ超導(dǎo)傅立葉變換核磁共振儀(配有CPBBO探頭,Topspin 3.2處理軟件及60位自動(dòng)進(jìn)樣器) 美國Bruker公司;XS204電子天平 瑞士Mettler Toledo公司;Centrifuge 5424R離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品溶液的制備 稱取2.00 g奶粉樣品于10 mL帶蓋離心管中,加入純凈水5 mL,渦旋3 min,超聲15 min后,再渦旋1 min。取渦旋后的液體3 mL于3 kDa的超濾離心管中,9500 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min。取超濾離心得到的樣品液體420 μL于5 mm核磁管中,再加入60 μL的重水溶液(含186.8 μg/mL的TMSP)和120 μL的PBS(pH=7.40)溶液,混勻后待測。

1.2.2 儀器條件 定性測定:1H-NMR實(shí)驗(yàn)使用Bruker儀器脈沖程序noesypr1d,檢測溫度25 ℃,設(shè)定參數(shù)1H的90°脈沖寬度為11.90 μs,譜寬為12019.230 Hz,中心頻率為2811.01 Hz,掃描次數(shù)為32次。J-分辨、1H-1H COSY、HSQC、HMBC使用Bruker標(biāo)準(zhǔn)脈沖程序,檢測溫度均為25 ℃,掃描次數(shù)分別為 32、16、8、16次。

定量測定:1H-NMR實(shí)驗(yàn)使用Bruker儀器脈沖程序noesypr1d,檢測溫度25 ℃,設(shè)定參數(shù)1H的90°脈沖寬度為11.90 μs,譜寬為12019.230 Hz,中心頻率為2811.01 Hz。脈沖脈沖延遲時(shí)間為4 s,掃描次數(shù)為96。

1.2.3 樣品測定及譜圖處理 在1.2.2項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件下,調(diào)整儀器參數(shù)、調(diào)諧、控溫、勻場、采樣及傅里葉變換,得到1H-NMR圖譜。測得的1H-NMR譜使用Bruker Topspin 3.2軟件處理,變換點(diǎn)數(shù)為64 K,LB為1.00 Hz,用指數(shù)窗函數(shù)處理,基線和相位校正均采用手動(dòng)方式進(jìn)行,TMSP為內(nèi)標(biāo)信號(δ0.00)。

1.2.4 GSD數(shù)據(jù)處理 處理后的圖譜導(dǎo)入MestReNova(version 12.0,Spain)軟件,選擇積分校正方法為信號峰校正(Peaks),設(shè)置細(xì)化等級為等級1,對23個(gè)定量物質(zhì)和定量內(nèi)標(biāo)TMSP的定量峰進(jìn)行解卷積處理,獲取各定量峰的峰面積。

1.2.5 定量計(jì)算公式 以TMSP為定量內(nèi)標(biāo),分別采用傳統(tǒng)的積分方法和解卷積處理后的圖譜積分方法按以下公式計(jì)算樣品中各物質(zhì)的含量。

式(1)

式中:W為各物質(zhì)的含量;A為定量峰積分面積;N為定量峰所包含的質(zhì)子數(shù);M為物質(zhì)相對分子質(zhì)量;下標(biāo)u及t分別為分析物和內(nèi)標(biāo)物。

1.2.6 方法學(xué)考察

1.2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 稱取適量23種標(biāo)準(zhǔn)品置于燒杯中,加水溶解后轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中,加水至刻度線后搖勻,配制成混標(biāo)儲備液?；鞓?biāo)溶液中各物質(zhì)濃度分別為:纈氨酸1.18 mg/mL、乳酸1.75 mg/mL、丙氨酸1.12 mg/mL、乙酸47.5 mg/mL、檸檬酸35.72 mg/mL、肌酸3.07 mg/mL、肌酐0.83 mg/mL、膽堿6.51 mg/mL、L-左旋肉堿0.85 mg/mL、胞嘧啶核苷0.69 mg/mL、腺嘌呤核苷0.73 mg/mL、次黃嘌呤核苷0.55 mg/mL、乳清酸2.17 mg/mL、馬尿酸1.96 mg/mL、尿嘧啶核苷0.31 mg/mL、鳥嘌呤核苷0.66 mg/mL、胞嘧啶核苷酸2.67 mg/mL、尿嘧啶核苷酸2.34 mg/mL、鳥嘌呤核苷酸3.26 mg/mL、甲酸0.13 mg/mL、次黃嘌呤核苷酸0.73 mg/mL、腺嘌呤核苷酸1.79 mg/mL、煙酸0.89 mg/mL。吸取100 μL的混標(biāo)儲備液,加純凈水900 μL后混勻,取500 μL稀釋后儲備液,在再加500 μL純凈水,依次對倍稀釋為5個(gè)濃度的混標(biāo)溶液。取混標(biāo)溶液420 μL于5 mm核磁管中,再加入60 μL的重水溶液(含186.8 μg/mL的TMSP)和120 μL的PBS(pH=7.40)溶液,混勻。以1.2.2節(jié)中的測定條件進(jìn)行1H-NMR圖譜,以積分得到的標(biāo)準(zhǔn)品定量峰面積為Y軸,以加入標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量為X軸做線性回歸。

1.2.6.2 精密度 按1.2.1節(jié)方法制備供試品一份,將制備好的供試品在1.2.2節(jié)下條件平行測定6次,計(jì)算樣品中23個(gè)化合物定量峰積分面積的RSD。

1.2.6.3 重復(fù)性 取同一品牌、同一批次的奶粉樣品,按1.2.1節(jié)下方法平行制備6份供試品溶液,在1.2.2節(jié)條件下測定1H-NMR圖譜,計(jì)算樣品中23個(gè)化合物定量峰積分面積的RSD。

1.2.6.4 穩(wěn)定性 取同一供試品溶液,分別在制備后0、2、4、8、12、24 h,在1.2.2節(jié)條件下測定1H-NMR圖譜,計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)圖譜的23個(gè)化合物定量峰面積的RSD。

1.2.6.5 回收率 平行稱取同一品牌的奶粉樣品9份,按照1.2.1項(xiàng)下制備供試品溶液,其中3份作為對照,另外6份各加入100 μL稀釋后的混標(biāo)溶液,其中混標(biāo)溶液中含纈氨酸59.00 μg/mL、乳酸87.75 μg/mL、丙氨酸56.25 μg/mL、乙酸23.75 μg/mL、檸檬酸1786.25 μg/mL、肌酸153.60 μg/mL、肌酐1.75 μg/mL、膽堿325.75 μg/mL、L-左旋肉堿42.5 μg/mL、胞嘧啶核苷34.5 μg/mL、腺嘌呤核苷36.75 μg/mL、次黃嘌呤核苷27.85 μg/mL、乳清酸108.65 μg/mL、馬尿酸98.00 μg/mL、尿嘧啶核苷15.45 μg/mL、鳥嘌呤核苷32.95 μg/mL、胞嘧啶核苷酸113.65 μg/mL、尿嘧啶核苷酸116.95 μg/mL、鳥嘌呤核苷酸163.25 μg/mL、甲酸6.75 μg/mL、次黃嘌呤核苷酸36.75 μg/mL、腺嘌呤核苷酸89.85 μg/mL、煙酸44.65 μg/mL。在1.2.2項(xiàng)下條件測定1H-NMR圖譜,計(jì)算各化合物的加標(biāo)回收率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

樣品檢測結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 信號峰定性歸屬結(jié)果

嬰幼兒配方乳粉水提物的1H-NMR圖譜見圖1A。根據(jù)圖譜中質(zhì)子信號的化學(xué)位移、耦合常數(shù)等信號特征,結(jié)合2D-NMR數(shù)據(jù)及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[19-20,25]等信息,共對1H-NMR圖譜中23個(gè)小分子水溶性成分進(jìn)行信號歸屬,它們是纈氨酸、乳酸、丙氨酸、檸檬酸、肌酸、肌酐、膽堿、L-左旋肉堿、胞嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷、乳清酸、馬尿酸、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鳥嘌呤核苷酸、甲酸、次黃嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷酸、煙酸,數(shù)據(jù)歸屬詳見表1,其中表中加粗?jǐn)?shù)據(jù)為用于定量計(jì)算的定量峰化學(xué)位移。

圖1 嬰幼兒配方乳粉水提物1H-NMR圖譜(A); 解卷積信號提取后得到的23種 小分子化合物的定量峰圖譜(B)Fig.1 1H-NMR spectra of infant formulas(A); Quantitative peaks selected by global spectral deconvolution(GSD)in1H-NMR spectrum of 23 low-molecular-weight organic components content注:1.纈氨酸;2.乳酸;3.乙酸;4.丙氨酸;5.檸檬酸;6.肌酸;7.肌酐;8.膽堿;9.L-左旋肉堿;10.胞嘧啶核苷;11.腺嘌呤核苷;12.次黃嘌呤核苷;13.乳清酸;14.馬尿酸;15. 尿嘧啶核苷;16.鳥嘌呤核苷;17.胞嘧啶核苷酸;18.尿嘧啶核苷酸;19.鳥嘌呤核苷酸;20.甲酸;21.次黃嘌呤核苷酸;22.腺嘌呤核苷酸;23.煙酸。

表1 嬰幼兒配方乳粉中23個(gè)小分子有機(jī) 成分1H-NMR圖譜信號歸屬表Table 1 1H-NMR data for 23 low-molecular-weight organic components in infant formulas extracts

2.2 GSD提取定量峰

采用1.2.4中GSD數(shù)據(jù)處理方法提取出嬰幼兒配方乳粉水提物中纈氨酸、乳酸、丙氨酸、檸檬酸、肌酸、肌酐、膽堿、L-左旋肉堿、胞嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷、乳清酸、馬尿酸、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鳥嘌呤核苷酸、甲酸、次黃嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷酸、煙酸，23種小分子化合物的定量特征信號,見圖1(B),具體化學(xué)位移見表1中加黑數(shù)據(jù)。以內(nèi)標(biāo)化合物TMSP為定量內(nèi)標(biāo)物,計(jì)算23種化合物的含量。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

采得圖譜經(jīng)過傅里葉變換、定標(biāo)、相位和基線調(diào)整后,分別采用GSD法和傳統(tǒng)積分兩種方式對內(nèi)標(biāo)和化合物的定量峰進(jìn)行積分,按照1.2.5公式計(jì)算結(jié)果。分別按照1.2.6中方法學(xué)考察內(nèi)容進(jìn)行方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn),兩種積分方式的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果見表2、表3。

表2 采用傳統(tǒng)積分方法處理圖譜后的23種化合物定量方法考察學(xué)結(jié)果Table 2 The results of methodological study for 23 compounds after dealing with the atlas by the traditional integral method

表3 采用GSD方法處理圖譜后的23種化合物定量方法學(xué)考察結(jié)果Table 3 The results of methodological study for 23 compounds after dealing with the atlas by the GSD method

續(xù)表

結(jié)果顯示,采用傳統(tǒng)積分方式定量方法的相關(guān)系數(shù)在0.9843～0.9990之間,精密度的RSD在2.03%～8.28%之間,重復(fù)性的RSD在2.53%～7.23%之間,穩(wěn)定性的RSD在2.19%～5.93%之間,回收率在72.60%～129.41%之間;采用GSD積分方式定量方法的相關(guān)系數(shù)在0.9960～0.9997之間,精密度的RSD在1.02%～3.72%之間,重復(fù)性的RSD在1.34%～3.68%之間,穩(wěn)定性的RSD在1.62%～3.20%之間,回收率在85.02%～110.00%之間。由此可見,GSD定量方法的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和回收率都要優(yōu)于傳統(tǒng)的積分方法,因此,基于GSD處理的qNMR法更適用于嬰幼兒配方乳粉中小分子水溶性物質(zhì)的全面檢測。特別是采用了這種積分方式可以減少定量對基線調(diào)整的依賴,當(dāng)內(nèi)標(biāo)定量峰與化合物定量峰化學(xué)位移相差較大時(shí),效果更為明顯。

2.4 樣品檢測

精密稱取6個(gè)品牌的乳粉樣品,按照1.2.1項(xiàng)下制備供試品,按照1.2.2項(xiàng)下條件測定樣品的1H-NMR圖譜,采用GSD方法對定量峰進(jìn)行積分,按照式(1)計(jì)算各定量物質(zhì)的含量,結(jié)果見表4。結(jié)果顯示兩種檢測方法的測定數(shù)值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.32%～12.42%,結(jié)果較為一致。

表4 6個(gè)品牌乳粉樣品中23種小分子化合物的含量(mg/100 g,n=3)Table 4 Determination of 23 low-molecular-weight organic components content in infant formulas extracts from 6 manufacturers

3 結(jié)論

本研究采用GSD結(jié)合qNMR技術(shù)建立了嬰幼兒配方乳粉水提物中23個(gè)小分子水溶性物質(zhì)的含量測定方法,解決了傳統(tǒng)qNMR方法受基線調(diào)整及內(nèi)標(biāo)峰化學(xué)位移影響較大的問題。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明,23種化合物的線性線性相關(guān)系數(shù)在0.9960～0.9997之間,平均加樣回收率為85.02%～110.00%,且精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性的RSD值均小于4%,均優(yōu)于傳統(tǒng)qNMR方法。在對實(shí)際樣品的檢測中,膽堿測定含量與國標(biāo)法測定數(shù)值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.32%～12.42%,較為一致,進(jìn)一步說明了本方法的可靠性。因此,GSD-qNMR法具有準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好優(yōu)點(diǎn),適用于復(fù)雜食品基質(zhì)中小分子物質(zhì)的定量檢測。