超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉和豬肉中利尿劑殘留量

薛 穎,花 錦,高 浩,杜利君,徐 瑤,黃立亭,王嘉妮

(1.太原海關(guān)技術(shù)中心,山西太原 030024; 2.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院農(nóng)副食品所,陜西西安 710048)

利尿劑是指一類用于治療高血壓及水腫的藥物,如呋塞米、托拉塞米、布美他尼等,能增加鈉鹽和水分的排出量進(jìn)而增加尿量[1]。但是利尿劑如果被長期或者過量使用,可能會(huì)引起血量下降,甚至低血壓、休克、腎衰竭、猝死等副作用[2]。目前,利尿劑會(huì)被當(dāng)成獸藥添加到飼料,用于治療牛乳房炎,或者改善禽蛋蛋白比例等[3]。但一些不法分子會(huì)用利尿劑來掩蓋其他違禁藥物的使用,比如比賽時(shí)運(yùn)動(dòng)員攝入興奮劑等違禁藥物,通過利尿劑,以達(dá)到違禁藥物在尿液中濃度降低并盡快排出體外的目的,從而通過藥檢等。因此,1988年國際奧委會(huì)將利尿劑列為禁用物質(zhì)的興奮劑類。目前被列在國際奧委會(huì)禁用物質(zhì)表內(nèi)的利尿劑主要有15種,分為以下四類:髓襻利尿劑、噻嗪類利尿劑及相關(guān)化合物、保鉀利尿劑、碳酸酐酶抑制劑。呋塞米、螺內(nèi)酯、布美他尼是山西省于2019年舉辦第二屆全國青年運(yùn)動(dòng)會(huì)所檢測的3種利尿劑。呋塞米、布美他尼屬于髓襻利尿劑,螺內(nèi)酯屬于保鉀利尿劑,均屬于禁用物質(zhì)。

目前,關(guān)于利尿劑的檢測方法主要有高效液相色譜法[4-8]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[11-24]等。楊旺火[2]采用了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中利尿劑的含量。王培龍等[3]采用氣相色譜-質(zhì)譜法作為確證方法確證飼料中利尿劑的含量。唐坤等[6-7]采用了高效液相色譜-熒光法測定人血漿和藥品中布美他尼片的含量。謝敏等[8-9]研究了減肥功能食品中非法添加物的檢測方法。歐貝麗等[10-13]研究了功能性食品中利尿劑和非法添加物的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。王旭峰等[14-16]建立了尿液中利尿劑等物質(zhì)的液相色譜-質(zhì)譜檢測方法。許文佳等[17-23]研究了采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測化妝品中利尿劑等物質(zhì)的含量。梁楊等[24]建立了人血漿中6種常用利尿劑的液相色譜-質(zhì)譜法,提出了基于QuEChERS的新方法。

液相色譜法檢測靈敏度較低,檢測利尿劑時(shí)一般是作為初篩,且該方法基質(zhì)復(fù)雜易被干擾;液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法雖然前處理較為復(fù)雜,但靈敏度高,且可以選擇離子,因此具有不易被干擾的特點(diǎn)。因此,液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法一般是作為利尿劑檢測的確證方法。目前,國內(nèi)在動(dòng)物源性食品中檢測的文獻(xiàn)暫無報(bào)道,而且也尚無任何檢測的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),不利于執(zhí)法部門對動(dòng)物源性食品的監(jiān)管。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對雞肉和豬肉中呋塞米、螺內(nèi)酯、布美他尼3種利尿劑藥物的檢測進(jìn)行研究,為監(jiān)管部門對動(dòng)物源性食品的監(jiān)測提供執(zhí)法依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

呋塞米標(biāo)準(zhǔn)品 德國Dr.Ehrensorfer公司,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.7%;螺內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品 北京曼哈格生物科技有限公司,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%;布美他尼標(biāo)準(zhǔn)品 中國食品藥品檢定研究院,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%;甲醇、乙酸乙酯、乙腈 色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;甲酸 色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;C18粉 ODS,50 μm粒徑范圍,60 ?平均孔徑,廣州碩譜生物科技有限公司;豬肉、雞肉 市售。

QTRAP 4500型全自動(dòng)固相萃取超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國AB SCIEX公司;XP404S型電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多集團(tuán);EOFO-945616型食品攪拌機(jī) 美國TALLBOYS公司;DTA-27型超聲波清洗器 湖北鼎泰恒勝科技設(shè)備有限公司;Milli-Q型超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司;HC-3518型離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司;N-EVAP型氮吹儀 美國ORGANOMATION ASSOCINTES INC公司;GM 200型刀式混合研磨儀 弗爾德(上海)儀器設(shè)備有限公司;0.22 μm尼龍濾膜 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:分別稱取螺內(nèi)酯、呋塞米、布美他尼標(biāo)準(zhǔn)品0.010 g于10 mL容量瓶中,用50%甲醇水溶液溶解,超聲30 min后定容到10 mL,得到1000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

中間標(biāo)準(zhǔn)溶液:精密量取螺內(nèi)酯、呋塞米、布美他尼標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL,置10 mL容量瓶中,用甲醇配制成10 mg/L中間標(biāo)準(zhǔn)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:稱取5個(gè)雞肉樣品和5個(gè)豬肉樣品,經(jīng)1.2.2得到的5個(gè)雞肉空白基質(zhì)的5個(gè)豬肉空白基質(zhì)。用空白基質(zhì)分別配制成濃度為1、10、30、250、500 μg/L的雞肉標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和豬肉標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,臨用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品處理 本試驗(yàn)參考梁楊[24]對血漿中利尿劑的提取方法和凈化方法。在此基礎(chǔ)上,本試驗(yàn)還考慮了基質(zhì)效應(yīng),采用基質(zhì)配標(biāo)消除基質(zhì)的影響。

將市售雞肉和豬肉在-20 ℃的冰箱內(nèi)密封保存。取適量新鮮或者冷凍解凍的樣品,去筋、搗碎均勻。準(zhǔn)確稱取2 g樣品(精確至0.01 g),置于50 mL聚乙烯離心管中,加入10 mL乙酸乙酯溶液,渦旋1 min,超聲提取10 min,超聲頻率為32 kHz,4000 r/min離心10 min,吸取上清液于15 mL離心管中,氮吹吹至近干,加入100 mg C18粉末,用1 mL甲醇∶水(1∶1)溶液溶解,渦旋1 min,過0.22 μm尼龍濾膜,供超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀分析測定。

1.2.3 檢測條件 液相色譜條件:色譜柱為Hypersil GOLD C18色譜柱(1.9 μm,2.1 mm×50 mm);流動(dòng)相:A相為0.1%甲酸水溶液,B相為乙腈;流速為0.4 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量為10 μL;梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相比例Table 1 The proportion of mobile phase

質(zhì)譜條件:離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:正負(fù)離子同時(shí)掃描;監(jiān)測方式:多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM);氣簾氣(Curtain Gas):30 psi;噴霧氣(Gas1):50 psi;輔助霧化氣(Gas2):60 psi;離子源溫度:600 ℃;電離電壓:5500 V/-4500 V;碰撞氣:氮?dú)?。其它質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 3種化合物的質(zhì)譜條件Table 2 MS/MS parameters for three compounds

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)所得圖譜均由數(shù)據(jù)處理軟件MultiQuant 3.0.2處理所得。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別用甲醇∶水(1∶1)溶液配制濃度均為0.5 μg·mL-1的螺內(nèi)酯、呋塞米、布美他尼標(biāo)準(zhǔn)溶液。將這3種利尿劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入ESI離子源,針泵速度設(shè)置為10 μL/min。通過對3種利尿劑的進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描,發(fā)現(xiàn)螺內(nèi)酯在正離子模式得到的信號高且穩(wěn)定;呋塞米在正離子模式下,未找到明顯的正離子峰,而在負(fù)離子模式下得到的信號高且穩(wěn)定;布美他尼正負(fù)離子均可檢測到,但在負(fù)離子模式下,低豐度離子碎片干擾更少。因此,本試驗(yàn)采用正離子模式掃描螺內(nèi)酯,負(fù)離子模式掃描呋塞米和布美他尼。

呋塞米的分子量為330.74,在高溫源內(nèi)易脫去氫。故條件優(yōu)化時(shí),理論上將母離子m/z設(shè)置為329.7。圖1為呋塞米的一級質(zhì)譜掃描圖。如圖1所示,母離子的峰強(qiáng)度達(dá)到107,根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,將母離子的m/z確定為328.9。圖2為呋塞米碎片離子質(zhì)譜掃描圖。如圖2所示,應(yīng)選擇峰強(qiáng)度最高的m/z為284.8和204.9作為呋塞米的特征子離子。與伍麗萍等[12]研究結(jié)果一致。

布美他尼的分子量為364.42,它在高溫源內(nèi)易脫去氫,結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果,將母離子m/z設(shè)置為363.0。圖3是布美他尼的一級質(zhì)譜掃描圖,由圖3可見該化合物的母離子強(qiáng)度達(dá)到109以上。圖4為布美他尼的碎片離子質(zhì)譜掃描圖。由圖4可知,應(yīng)選擇峰強(qiáng)度達(dá)到105的m/z為319.1和206.9作為布美他尼的特征子離子。與伍麗萍等[12]研究結(jié)果一致。

圖3 布美他尼一級質(zhì)譜掃描圖Fig.3 The full-scan mass spectrum charts of parentions of Bumetanide

圖4 布美他尼碎片離子質(zhì)譜掃描圖Fig.4 The full-scan mass spectrum charts of fragment ions of Bumetanide

楊旺火[2]研究發(fā)現(xiàn),雖然螺內(nèi)酯的分子量為416.57,但它在高溫源內(nèi)易脫去乙?；鶐€基,得到341.2的正離子峰。該峰其信號穩(wěn)定,可作為螺內(nèi)酯的一級質(zhì)譜信號,且二級特征離子信號重現(xiàn)性好,可滿足監(jiān)測要求,因此,本試驗(yàn)條件優(yōu)化時(shí)將m/z為341.2作為母離子。圖5為螺內(nèi)酯的一級質(zhì)譜描圖。如圖5所示,m/z為341.2的峰強(qiáng)度達(dá)到107以上。圖6為螺內(nèi)酯的碎片離子質(zhì)譜掃描圖。如圖6所示,選擇二級碎片離子中強(qiáng)度最高的m/z為107.0和187.0,可將其作為螺內(nèi)酯的特征子離子。與楊旺火[2]對于螺內(nèi)酯子離子的選擇一致。

圖5 螺內(nèi)酯一級質(zhì)譜掃描圖Fig.5 The full-scan mass spectrum charts of parentions of Spironolactone

圖6 螺內(nèi)酯碎片離子質(zhì)譜掃描圖Fig.6 The full-scan mass spectrum charts of fragment ions of Spironolactone

得到3種化合物的子離子后,分別進(jìn)行去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)的優(yōu)化。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

色譜常用的作為流動(dòng)相的有機(jī)試劑是乙腈和甲醇,而水相一般為甲酸水或乙酸銨。因此,考察了不同水相和有機(jī)相對目標(biāo)化合物的影響。本試驗(yàn)用流動(dòng)相初始比例配制1 μg/L的三種利尿劑混標(biāo),在對應(yīng)流動(dòng)相條件下在超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀器上進(jìn)行檢測。試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 3種利尿劑在不同流動(dòng)相條件下的峰面積Table 3 Peak area of three diuretics in different mobile phase

試驗(yàn)表明,用乙腈和0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí),三種化合物的峰面積都是最大。因此,本試驗(yàn)的流動(dòng)相確定為乙腈和0.1%甲酸水溶液。

2.3 提取溶劑的選擇

螺內(nèi)酯、呋塞米、布美他尼均不溶于水,因此選用提取試劑時(shí)選擇用有機(jī)試劑來進(jìn)行提取,一般選用的提取試劑有甲醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯。試驗(yàn)考察了甲醇、乙腈、二氯甲烷和乙酸乙酯溶液對三種利尿劑的回收率影響,試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 不同溶劑提取得到的利尿劑的回收率(%)Table 4 Recovery of diuretics extracted by different solvent(%)

由表4可知,乙酸乙酯溶液對化合物提取回收率是最好的,二氯甲烷的是最差的。因此,確定乙酸乙酯為提取溶劑,與梁楊關(guān)于血漿中利尿劑的提取效果一致[24]。

2.4 方法的線性范圍和檢出限

按照2.1、2.2和2.3所優(yōu)化的條件進(jìn)行試驗(yàn),用空白雞肉基質(zhì)配制濃度均為1.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,上機(jī)分析,得到3種利尿劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖,見圖7～圖12。

圖7 螺內(nèi)酯的選擇離子流圖(341.2/187.0)Fig.7 Selected ion flow charts of Spironolactone(341.2/187.0)

圖8 螺內(nèi)酯的選擇離子流圖(341.2/107.0)Fig.8 Selected ion flow charts of Spironolactone(341.2/107.0)

圖9 呋塞米的選擇離子流圖(328.9/204.9)Fig.9 Selected ion flow charts of Furosemide(328.9/204.9)

圖10 呋塞米的選擇離子流圖(328.9/284.8)Fig.10 Selected ion flow charts of Furosemide(328.9/284.8)

圖7～圖12表明,本試驗(yàn)3中利尿劑的標(biāo)準(zhǔn)品的峰形很好,且無干擾,信噪比也均滿足(S/N)≥10的要求。

圖12 布美他尼的選擇離子流圖(363.0/319.1)Fig.12 Selected ion flow charts of Bumetanide(363.0/319.1)

本試驗(yàn)考慮到基質(zhì)效應(yīng),選擇用雞肉和豬肉的空白樣品稀釋中間標(biāo)準(zhǔn)液,配制1.0～500.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定,以各個(gè)化合物的峰面積的平均值為縱坐標(biāo)y,質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其相關(guān)系數(shù)均大于0.996。以信噪比(S/N)≥3為標(biāo)準(zhǔn),確定方法的檢出限(LOD),以信噪比(S/N)≥10為標(biāo)準(zhǔn),確定方法的定量限(LOQ),結(jié)果見表5。

圖11 布美他尼的選擇離子流圖(363.0/206.9)Fig.11 Selected ion flow charts of Bumetanide(363.0/206.9)

表5 3種化合物的線性范圍、檢出限和定量限Table 5 Linear range,limits of detection and limits of quantification of three compounds

由表5可知,螺內(nèi)酯、呋塞米、布美他尼標(biāo)準(zhǔn)溶液在濃度1.0～500.0 μg/L范圍內(nèi)線性良好。3種化合物的線性方程及相關(guān)系數(shù)見表6。

表6 3種化合物的回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 6 Regression equation and correlation coefficient of three compounds

2.5 回收率和精密度

在空白豬肉和雞肉樣品中添加這3種利尿劑定量限的1倍、2倍、10倍,每個(gè)濃度進(jìn)行6個(gè)平行,按照1.2進(jìn)行檢測。結(jié)果表明3種利尿劑在豬肉中的回收率為67.3%～109.8%之間,RSD在1.7～5.8之間;在雞肉中的回收率為77.7%～111.6%,RSD在1.2～5.6之間,具體見表7、表8。

表7 豬肉的平均回收率和精密度(n=6)Table 7 Average recoveries and precisions of swine(n=6)

表8 雞肉的平均回收率和精密度(n=6)Table 8 Average recoveries and precisions of chicken(n=6)

3 結(jié)論

本文建立了同時(shí)檢測雞肉和豬肉中螺內(nèi)酯、呋塞米、布美他尼的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。通過優(yōu)化液相和質(zhì)譜的相關(guān)檢測參數(shù),使得3種化合物的檢出限均達(dá)到0.5 μg/kg,定量限均達(dá)到1.0 μg/kg。本方法前處理過程較為簡單,采用了多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM),正負(fù)離子可同時(shí)采集。本方法靈敏度高,排除了干擾物;重現(xiàn)性好,六次平行的偏差滿足相關(guān)要求;準(zhǔn)確度高,試驗(yàn)的回收率滿足《GB/T 27404-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》的相關(guān)要求。因此,該方法能夠?qū)@3種化合物同時(shí)進(jìn)行準(zhǔn)確的定性、定量分析。目前,國內(nèi)尚未有雞肉和豬肉中利尿劑的檢測標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)。本文的研究擴(kuò)大了利尿劑的檢測范圍,為監(jiān)管部門對雞肉和豬肉的監(jiān)管提供了一定的技術(shù)支持。但本方法適用范圍只有雞肉和豬肉,還需進(jìn)一步分析其他動(dòng)物源性食品中利尿劑的檢測方法,為利尿劑檢測提供更多的技術(shù)支撐。