不同種源綠色型香椿特征風(fēng)味的分析

孔 宇,許雅薈,張 旭,韓 冉,王汝華,劉常金,*

(1.天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室,天津 300457; 2.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,天津 300457)

香椿,又名香椿芽、椿樹、香椿頭等[1-2],在我國種植面積非常廣泛,主要分布在中部地區(qū)。香椿嫩芽中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、揮發(fā)油、維生素等營養(yǎng)物質(zhì),具有較高的食用價值和保健作用,是一種高檔特產(chǎn)蔬菜。另外,香椿嫩芽中含有豐富的黃酮、鞣質(zhì)、生物堿、萜類等成分,可以抗菌、消炎、抗氧化、消除自由基、調(diào)節(jié)血脂等,具有顯著的藥用價值[3-4]。

除了保健作用和藥用價值以外,香椿獨特的風(fēng)味使其深受廣大群眾的喜愛。香椿濃郁的香味是其最重要的品質(zhì)特性,同時也是決定香椿經(jīng)濟價值和食用價值的重要因素。近年來,隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展,對香椿香氣成分的研究也在不斷深入[5]。前人的研究結(jié)果表明,香椿嫩芽中的揮發(fā)性化合物主要包括萜烯類化合物、醛類化合物、醇類化合物以及含硫類化合物四種[6-9]。在果蔬香氣成分的提取過程中,由于提取方法不同,香氣成分的損失和品質(zhì)也會有所不同,因此,選擇一種合適的提取方法是實驗的關(guān)鍵步驟。目前應(yīng)用最為廣泛的提取方法為頂空固相微萃取法(HS-SPME)[10-12],相比于傳統(tǒng)方法,該法測量誤差小,操作簡便,成本低,集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體[13],不需要有機溶劑和高溫環(huán)境,操作條件溫和,有效地提高了萃取效率,可以與氣相質(zhì)譜儀聯(lián)用,簡化實驗過程[14-17]。

陳叢瑾等[18]采用HS-SPME提取香椿芽、葉中的揮發(fā)性成分,通過氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀進行分析鑒定,用峰面積歸一化法測定了各揮發(fā)性物質(zhì)的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果在香椿芽中鑒定出了26種成分,香椿葉中鑒定出46種成分。孫曉健等[19]利用HS-SPME結(jié)合GC-MS分析了新鮮和凍干香椿的揮發(fā)性成分,共檢測出72種、66種揮發(fā)性物質(zhì),并發(fā)現(xiàn)含硫類化合物是香椿的主要呈味物質(zhì),而且凍干后的香椿風(fēng)味沒有發(fā)生很大改變。

通過GC-MS聯(lián)用儀[20]能夠分析出某種物質(zhì)中揮發(fā)性化合物的種類和含量,但由于沒有直觀的感官嗅聞,很難確定該物質(zhì)的特征香氣成分。而氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜(GC-O-MS)[21]添加了嗅聞技術(shù),實驗人員就能夠直觀地感受到某種化合物的風(fēng)味強度。Lan-Phi等[22]在香氣提取物AEDA技術(shù)的基礎(chǔ)上,通過GC-O技術(shù)檢測出了柚子的特征香氣成分。因此,GC-O技術(shù)可以將食品香氣的關(guān)鍵成分檢測出來[23-24]。本實驗選用了四種不同種源表型為綠色的香椿嫩芽,采用HS-SPME結(jié)合GC-MS聯(lián)用儀對揮發(fā)性成分進行檢測,再用GC-O鑒定出香椿芽的特征香氣成分,分析不同種源香椿的風(fēng)味差異,為進一步開發(fā)香椿資源,促進香椿在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗香椿 均來源于天津科技大學(xué)生物技術(shù)實習(xí)基地,香椿的具體來源和品種包括安徽省阜陽市太和縣青油椿、山西省永濟香椿、湖北省十堰香椿、陜西省安康市嵐皋香椿,香椿采收時間為2018年4月份,將采摘的香椿清洗干凈后曬干,粉碎,過40目篩,置于密封袋內(nèi)保存,備用。

Agilent7890氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司;SPME手動進樣器 HT200H美國Supelco公司;30/50 μm PDMS/DVB、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS萃取頭 美國Supelco公司;40 mL頂空萃取瓶 上海安普公司;FA1104A電子天平 上海精天電子儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州普天儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 用電子天平準(zhǔn)確稱量不同種源綠香椿芽1.0 g置于研缽中,將其充分破碎,直到散發(fā)出濃郁的香氣,然后將樣品轉(zhuǎn)移至40 mL的頂空瓶中,加入10 mL蒸餾水,用封口膜密封,在50 ℃的恒溫水浴中靜置一段時間使其達到平衡后,再將老化后的萃取頭插入到頂空瓶中進行萃取,萃取完成后,利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對萃取物進行解吸。每個樣品需要做三次平行實驗,最后取其平均值。

1.2.2 GC-MS條件 氣相色譜條件:選用色譜柱HP-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣為高純氦氣;進樣溫度為250 ℃,載氣流速為1.0 mL/min;分流比為20∶1;升溫程序:初始溫度60 ℃保持5 min,以5 ℃/min升溫到150 ℃,保持1 min,再以10 ℃/min升溫到250 ℃,保持5 min,溶劑延遲1.5 min。

質(zhì)譜條件:電離方式選用電子轟擊源(EI),接口溫度為230 ℃,離子源溫度為210 ℃,電子能量70 eV,掃描范圍35～500 aum。

1.2.3 HS-SPME條件的優(yōu)化 影響頂空固相微萃取技術(shù)的因素包括萃取頭類型、萃取溫度、萃取時間[25]。本實驗采用單因素實驗對其進行優(yōu)化。根據(jù)極性和涂層厚度的不同,選用30/50 μm PDMS/DVB、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS四種類型的萃取頭對香椿特征香氣物質(zhì)的萃取;選用的萃取時間分為10、20、30、40、50、60 min六個梯度;萃取溫度為10、20、30、40、50、60 ℃六個梯度。不同萃取梯度所得的色譜峰的總面積有所不同,根據(jù)最大的色譜峰面積來確定最佳的萃取頭類型、萃取溫度和萃取時間。

1.2.4 GC-O實驗 嗅聞實驗由六人組成的聞香小組進行,而且聞香員必須提前進行氣味分辨的培訓(xùn)。六人各進行三次嗅聞,記錄員需要記錄每個嗅聞員對聞到氣味的語言描述、氣味強度與色譜峰保留的時間。氣味強度分為5個標(biāo)準(zhǔn),用“+”表示香氣強度最弱,“+++++”表示香氣強度最強。

1.2.5 定性與定量分析 利用計算機檢索與質(zhì)譜檢索庫NIST11進行化合物的定性分析,再對照已發(fā)表的人工質(zhì)譜圖,確定其中的香氣成分。采用峰面積歸一化法進行化合物的定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和Origin軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 頂空固相微萃取條件的優(yōu)化

由于萃取頭涂層纖維的厚度對萃取效率影響重大,因此需要選取合適的萃取頭來確保實驗的準(zhǔn)確性[26]。本實驗選用30/50 μm PDMS/DVB、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS四種類型的萃取頭進行萃取,圖1結(jié)果表明,相比于其他三種萃取頭,65 μm PDSM/DVB的萃取頭所萃取的揮發(fā)性成分的色譜峰面積最大,由此可見,該萃取頭對香椿揮發(fā)性成分的萃取效率最高,故選擇該萃取頭進行進一步的研究。

圖4 四個不同種源香椿揮發(fā)性成分GC-MS色譜圖Fig.4 The GC-MS chromatogram of the volatile components of 4 different provenances of Toona sinensis注:A:安徽太和青油椿;B:山西永濟香椿;C:湖北鄖西十堰香椿;D:陜西安康嵐皋香椿。

圖1 不同萃取頭對揮發(fā)性物質(zhì)成分萃取效果的影響Fig.1 Effects of different extraction heads on the extraction of volatile components

一般來說,最佳的萃取時間應(yīng)該接近達到吸附平衡的時間。圖2結(jié)果表明,在40 min之前,萃取時間與色譜峰面積成正比關(guān)系,當(dāng)萃取時間達到40 min時,色譜峰面積也達到最大,若繼續(xù)延長萃取時間,色譜峰面積則會逐漸下降,可能是因為萃取時間過長發(fā)生競爭吸附而導(dǎo)致小分子物質(zhì)脫附[6]。此結(jié)果表明萃取40 min時,萃取纖維上吸附的揮發(fā)性成分與樣品頂空瓶內(nèi)氣體的成分基本達到了相對平衡的狀態(tài)。因此,最佳的萃取時間為40 min。

圖2 萃取時間對色譜峰面積的影響Fig.2 Effects of extraction times on chromatographic peak area

萃取溫度不僅會對揮發(fā)性化合物的性質(zhì)產(chǎn)生影響,還會影響化合物的吸附時間和速度[25]。由圖3可知,萃取溫度達50 ℃時,色譜峰面積最大。在10～50 ℃范圍內(nèi),色譜峰面積隨著溫度的升高而增大,繼續(xù)升溫后,色譜峰面積反而減小,這可能是因為溫度過低無萃取效果差,溫度過高而會導(dǎo)致已經(jīng)吸附的物質(zhì)發(fā)生解析[6]。因此,最佳的萃取溫度為50 ℃。

圖3 萃取溫度對色譜峰面積的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on chromatographic peak area

2.2 綠香椿揮發(fā)性香氣成分的鑒定

根據(jù)4種綠香椿的總離子流圖,再結(jié)合分析軟件分析可以在綠香椿檢測出46種揮發(fā)性香氣成分,如表1所示,其中包括27種萜烯類化合物、12種含硫類化合物、5種醇類化合物、1種醛類化合物、1種酸類化合物。與之前張杰[6]的實驗結(jié)果相比,本研究檢測出了一些新的化合物,如:二烯丙基三硫醚、α-律草烯、2-甲基辛酸、醇類物質(zhì)等,出現(xiàn)不同結(jié)果的原因可能是HS-SPME萃取技術(shù)能夠使萃取的揮發(fā)性成分的提取率達到最大,也可能是質(zhì)譜檢索庫新增了一些新的化合物[27-28]等。由表1可知,四種香椿分布的地區(qū)不同,其中的揮發(fā)性成分也會有所不同,青油椿中含36種,永濟香椿中含40種,十堰香椿中含26種,嵐皋香椿中含32種。明顯可以看出,永濟香椿所含化合物種類最多,十堰香椿所含化合物最少,這種差距主要體現(xiàn)在萜烯類化合物上,永濟香椿中的萜烯類物質(zhì)最多(23種),而十堰香椿只含10種萜烯類物質(zhì)。在四種綠香椿中,β-石竹烯的含量均為最高,在12.46%～13.63%之間,其次為2-巰基-3,4-二甲基-2,3-二氫噻吩,含量在10%左右。

表1 GC-MS分析四種綠色表型香椿揮發(fā)性香氣物質(zhì)Table 1 GC-MS analysis of volatile aroma compounds of four green phenotypes Toona sinensis

采用峰面積歸一化法對四個不同種源綠香椿揮發(fā)性香氣物質(zhì)的含量進行分析,由圖5可知,萜烯類化合物相對含量均最高,其次是含硫類化合物,醇類、醛類、酸類物質(zhì)含量均較低,因此,萜烯類化合物和含硫類化合物可以作為綠香椿風(fēng)味的主要成分。此外,圖5中還可以看出,青油椿與永濟香椿中化合物相對含量大致相同,嵐皋香椿與十堰香椿中化合物相對含量差距很小,因此可以將四種香椿大致分為兩類,青油椿與永濟香椿為一類,十堰香椿與嵐皋香椿為一類,這兩大類在萜烯類化合物的含量上區(qū)別較為明顯。

圖5 四個不同種源香椿揮發(fā)性物質(zhì)含量對比圖Fig.5 Volatile matter content comparisons of four Toona sinensis samples in different provenances注:圖中同類化合物不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 綠香椿特征風(fēng)味物質(zhì)的鑒定

4個不同種源綠香椿經(jīng)過GC-O分析,結(jié)果如表2所示,共鑒定出18個特征香氣成分,包括8種含硫化合物、9種萜烯類化合物、1種醛類化合物,其中2-巰基-3,4-二甲基-2,3-二氫噻吩的香氣強度最高(5級),其次是β-石竹烯(4級),2,5-二甲基噻吩、二烯丙基三硫醚、α-律草烯香氣強度均為3級,由此可以發(fā)現(xiàn),香椿的特征香氣成分主要是萜烯類和含硫類化合物。有文獻表明[29],含硫化合物一般表現(xiàn)出大蒜、韭菜、硫磺等刺激性氣味,在表2的綠香椿特征香氣中,2-巰基-3,4-二甲基-2,3-二氫噻吩表現(xiàn)出煮熟的香椿味,是綠香椿中最主要呈香味成分。而萜烯類化合物一般表現(xiàn)出藥草味、花香味、果香等氣味,能夠調(diào)和含硫化合物的刺激性氣味,從而使香椿表現(xiàn)出其特有的風(fēng)味。由圖5可知,青油椿和永濟香椿中的萜烯類化合物含量較高,揮發(fā)性香氣成分的種類也比較多,這可能是青油椿和永濟香椿的風(fēng)味比十堰香椿和嵐皋香椿更豐富的原因。

表2 GC-O分析綠色表型香椿共有特征香氣物質(zhì)Table 2 GC-O analysis of common characteristic aroma compounds of green phenotype Toona sinensis

3 結(jié)論

本研究選用頂空固相微萃取技術(shù)對四個不同種源綠香椿進行萃取,并對萃取條件進行優(yōu)化,再結(jié)合GC-O-MS對香氣成分進行鑒定和分析。實驗結(jié)果表明,HS-SPME的最佳萃取條件為:在50 ℃的條件下,采用65 μm PDSM/DVB的萃取頭萃取40 min,揮發(fā)性成分損失最小。萃取之后,對其進行GC-MS檢測,在四種綠香椿中共鑒定出46種香氣成分,其中包括27種萜烯類化合物、12種含硫類化合物、5種醇類化合物、1種醛類化合物、1種酸類化合物。而且四種綠香椿中,永濟香椿中檢測出的香氣成分最多(40種),十堰香椿中最少(26種),這種差距主要體現(xiàn)在萜烯類化合物的種類上。為了檢測到香椿中的特征香氣成分,進行了GC-O分析,共鑒定出了18種特征揮發(fā)性成分,其中有8種含硫化合物,9種萜烯類化合物,1種醛類化合物,2-巰基-3,4-二甲基-2,3-二氫噻吩、β-石竹烯、2,5-二甲基噻吩、二烯丙基三硫醚、α-律草烯這5種成分的香氣強度較高,因此,萜烯類和含硫類化合物為綠香椿的主要特征香氣成分,這一結(jié)果與孫曉健等[19]報道的研究結(jié)果有很大的相似之處。在4種綠香椿中,青油椿和永濟香椿的萜烯類化合物的含量較十堰香椿和嵐皋香椿高,因此在風(fēng)味上,青油椿與永濟香椿更加溫和與豐富。這一研究結(jié)果為香椿香氣在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ),從而擴大了香椿市場的發(fā)展。