篩選自泡菜的發(fā)酵乳桿菌細(xì)菌素純化及抑菌特性分析

高兆建,張艷秋,宋玉林,趙宜峰

(1.徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,江蘇徐州 221018; 2.長江桂柳食品睢寧有限公司,江蘇徐州 221000)

細(xì)菌素是革蘭氏陽性菌產(chǎn)生、由核糖體合成的小分子抗菌肽[1],具有抑制某些微生物生長的作用,細(xì)菌素產(chǎn)生菌株通過抑制其它微生物生長而使其自身競爭中處于有利地位。產(chǎn)生細(xì)菌素菌株主要來源于乳酸菌并主要分布于乳球菌屬(Lactococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、肉食桿菌屬(Carnobacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)和鏈球菌屬(Streptococcus)[2]。乳酸菌在發(fā)酵中利用原料中的糖發(fā)酵生成乳酸、過氧化氫、雙乙酰、細(xì)菌素和其他有機(jī)酸等產(chǎn)物,這些物質(zhì)特別是細(xì)菌素可有效防止腐敗細(xì)菌的生長、延長食品的貨架期、增加食品的風(fēng)味[3]。從安全性考慮,乳球菌屬和乳桿菌屬的乳酸菌被認(rèn)為是安全性菌株(GRAS)[4],來源于以上種屬的乳酸菌細(xì)菌素比來源于其他微生物的受到更多關(guān)注[5]。

目前已經(jīng)從中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離到大量產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌株,其中深受廣大消費(fèi)者喜歡的傳統(tǒng)發(fā)酵食品泡菜是產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的重要來源,如Gao等[6]從發(fā)酵卷心菜中分離到的清酒乳桿菌所產(chǎn)細(xì)菌素有廣譜抑菌活性,Lv等[7]從中國西北地區(qū)傳統(tǒng)漿水菜中分離到的棒狀乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素有良好的pH穩(wěn)定性,另外還有從發(fā)酵蘿卜[8]、發(fā)酵黃瓜等泡菜中分離產(chǎn)細(xì)菌素菌株的報道。并且所報道細(xì)菌素在某些方面表現(xiàn)出較好的應(yīng)用特性,如耐酸細(xì)菌素[9]、耐高溫細(xì)菌素[5]、廣譜抗性細(xì)菌素[10]、抗真菌細(xì)菌素等。但細(xì)菌素作為一種有潛力的生物防腐劑,若在食品中廣泛使用，必須經(jīng)受住食品加工過程或者食品貯藏過程的環(huán)境因素的考驗,如高溫、氧化、高鹽、蛋白酶解、疏水、高酸高堿等極端環(huán)境。但目前報道的細(xì)菌素單獨應(yīng)用時其在抗菌譜、抗菌效價、穩(wěn)定性等方面仍然存在缺陷,因此進(jìn)一步深入開發(fā)新型細(xì)菌素對食品行業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

本研究從徐州多處采集的泡菜樣品中分離到一株產(chǎn)細(xì)菌素菌株發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum),盡管前期已經(jīng)有多篇文獻(xiàn)報道了從發(fā)酵乳桿菌分離的細(xì)菌素[11-14],但其菌株篩選來源與本研究不同,并且與本研究的發(fā)酵乳桿菌所產(chǎn)細(xì)菌素在抑菌特性方面有差異性。本研究旨在從多樣品中分離具有潛在應(yīng)用價值的產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌菌株,通過乳酸菌發(fā)酵,在分離純化得到單一組分細(xì)菌素基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究細(xì)菌素分子特性及抑菌相關(guān)性能,為細(xì)菌素在食品中開發(fā)應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品 從徐州當(dāng)?shù)囟嗵庌r(nóng)貿(mào)市場購買泡菜用于分離產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸菌株;指示菌株 部分購自中國普通微生物菌種保藏管理中心,部分由徐州工程學(xué)院江蘇省重點建設(shè)實驗室保存,具體見表2;乳酸菌篩選培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加0.5%(w/v)的碳酸鈣;細(xì)菌素發(fā)酵 使用MRS培養(yǎng)基;培養(yǎng)各細(xì)菌指示菌 使用LB培養(yǎng)基;柱層析填充材料Sephadex G-15 美國Pharmacia公司;超小分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白 TaKaRa公司;胰化蛋白胨、酵母粉 英國Oxoid公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR試劑盒 寶生物工程(大連)有限公司;蛋白酶K(30 U/mg)、胃蛋白酶(250 U/mg)、胰蛋白酶(2500 U/mg)、木瓜蛋白酶(30 U/mg)、α-淀粉酶(30 U/mg) 上海源葉生物科技有限公司;三氟乙酸、乙腈 色譜純,美國TEDIA公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

GeneAmp 9700 PCR儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;JS-680D凝膠成像系統(tǒng) 上海培清科技有限公司;Sigma3k15冷凍離心機(jī) 德國SIGMA公司;UV-2450紫外可見光分光光度計 日本島津公司;DYY-6B凝膠水平電泳儀 北京市六一儀器廠;AKTA蛋白純化系統(tǒng) 美國GE Healthcare公司;高效液相色譜半制備柱:Zorbax SB-C18(9.4 mm×250 mm,5 μm) 美國安捷倫公司產(chǎn)品;CascadaTM AN超純水系統(tǒng) 美國PALL公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌菌株篩選

1.2.1.1 乳酸菌篩選 參照Martinez等[15]的方法并稍微修改。泡菜水按照10-1濃度依次進(jìn)行梯度稀釋,選取10-1、10-2、10-3三個稀釋度涂布到MRS固體培養(yǎng)基上,34 ℃培養(yǎng)2～4 d。挑取具有溶鈣圈的單個菌落革蘭氏染色,并對菌落滴加3%雙氧水后檢測是否有氣泡形成,有氣泡形成表明細(xì)胞中存在過氧化氫酶。過氧化氫酶陰性且革蘭氏陽性的菌株初始判斷為乳酸菌。將初篩的菌株MRS固體培養(yǎng)基上劃線純化,挑取單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng),在-20 ℃下30%甘油保存待用。

1.2.1.2 乳酸菌的抑菌活性測定 將分離純化的乳酸菌株接種于裝有5 mL MRS液體培養(yǎng)基離心管中并在34 ℃條件下發(fā)酵48 h,10000 r/min,4 ℃離心10 min,上清液pH調(diào)至7.0并100 ℃加熱5 min,使內(nèi)源性蛋白酶失活。用0.22 μm孔徑的醋酸纖維素過濾器過濾,濾液(命名為CFS)-20 ℃保存直到使用。

采用瓊脂孔擴(kuò)散法[1]測定CFS的抑菌活力。于LB培養(yǎng)基平板上涂布指示菌S.aureus菌液,晾干后用打孔器打孔,將150 μL CFS注入于培養(yǎng)基孔中,37 ℃下培養(yǎng)過夜,檢測是否有抑菌圈并測量抑制圈直徑。產(chǎn)生抑菌圈的對應(yīng)CFS中分別加入蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶,酶的終濃度2 mg/mL,在各酶最適pH下,37 ℃保溫2 h,再將pH調(diào)回至7.0,測定蛋白酶和非蛋白酶處理后對S.aureus的抑菌直徑。

抑菌活力單位的定義為:以S.aureus為指示菌,樣品經(jīng)最大稀釋后,打孔檢測仍產(chǎn)生清晰抑菌圈的最大稀釋倍數(shù)的倒數(shù)作為一個抑菌活力單位。

1.2.2 產(chǎn)細(xì)菌素菌株鑒定 篩選到的菌株接種于MRS固體培養(yǎng)基上,34 ℃恒溫培養(yǎng)48 h,對菌落形態(tài)及菌體形態(tài)鏡檢觀察。進(jìn)一步通過一系列生理生化試驗進(jìn)行分析。各生理生化指標(biāo)測定參照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實驗方法》及《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》進(jìn)行。

通過16S rDNA分析進(jìn)一步鑒定菌株。以目標(biāo)菌株的基因組DNA為模板,選取通用引物(16S-F:5′-AGTTTGATCCT-GGCTCAG-3′;16S-R:5′-CTTGTTACGACTT-CACCC-3′)進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s,53 ℃退火45 s,72 ℃延伸1.5 min,共30個循環(huán);最后72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物連接克隆載體后測序。所得序列BLAST比對,用ClustalX 1.83與MEGA 5.1軟件,采用NJ法(Neighbor-Joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 乳酸菌細(xì)菌素發(fā)酵 菌株劃線活化兩次后,接種于20 mL MRS液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)12～16 h按照1%(v/v)接種量接種于250 mL三角瓶裝有80 mL MRS的培養(yǎng)基中,34 ℃發(fā)酵36 h,間隔一定時間取樣,測定其吸光度(600 nm),并以S.aureus為指示菌株,瓊脂孔擴(kuò)散法測定細(xì)菌素的抑菌活力。

1.2.4 細(xì)菌素的純化

1.2.4.1 硫酸銨鹽析 將硫酸銨粉末以85%的飽和度加入CFS中,4 ℃靜置過夜,再以10000 r/min、4 ℃下離心15 min。棄上清,沉淀回收,少量去離子水溶解,轉(zhuǎn)入透析袋內(nèi)4 ℃去離子水透析脫鹽,并超濾濃縮后進(jìn)一步層析純化。

1.2.4.2 分子篩凝膠過濾層析 采用Sephadex G-15葡聚糖凝膠柱(1.5 cm×80 cm)層析,用20 mmol/L、pH6.5的磷酸緩沖液充分平衡后,將超濾濃縮后的樣品(1.5 mL)上樣層析柱,相同緩沖液洗脫,流速1 mL/min。檢測每管收集液抑菌活性,合并有活性的收集管超濾濃縮后進(jìn)一步純化。

1.2.4.3 高效液相色譜制備 采用半制備高效液相色譜(HPLC)梯度洗脫分離細(xì)菌素。洗脫體系流動相A為含0.1%三氟乙酸和5%乙腈的水溶液,流動相B為含0.1%三氟乙酸的90%乙腈溶液。檢測波長為215 nm,流速為1 mL/min。線性梯度洗脫過程為80 min內(nèi)流動相A由80%到20%,柱溫25 ℃維持在一個恒定水平。

1.2.4.4 細(xì)菌素的Tricine-SDS-PAGE分子量測定與凝膠原位檢測 經(jīng)系列純化后的活性組分通過Tricine-SDS-PAGE電泳測定細(xì)菌素分子量。電泳完成后將凝膠切成2份,1份用于考馬斯亮藍(lán)染色,另外1份先浸泡于含有25%異丙醇和10%乙酸的溶液中,洗滌6～8 h以洗去凝膠中的SDS,再浸泡于1% Triton X100溶液中30 min,再無菌水洗6 h,最后轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)皿中,覆蓋上一層20 mL的LB固體培養(yǎng)基,涂布S.aureus37 ℃培養(yǎng)12 h,觀察抑菌條帶位置,分析細(xì)菌素分子量大小。

1.2.5 細(xì)菌素穩(wěn)定性的測定 酶對細(xì)菌素的影響:部分純化的細(xì)菌素中分別加入終濃度為2 mg/mL的木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和α-淀粉酶,調(diào)節(jié)體系pH至各酶最適作用pH,37 ℃孵育2 h,再80 ℃加熱15 min以酶活酶。測定細(xì)菌素對S.aureus的抑菌活性。

溫度對細(xì)菌素的影響:部分純化的細(xì)菌素分別于40、60、80、100 ℃水浴中處理30 min,121 ℃高壓滅菌鍋15 min,冷卻后,以S.aureus為指示菌檢測抑菌活性。

pH對細(xì)菌素的影響:部分純化的細(xì)菌素用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)其pH分別至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,20 ℃保持2 h后,再將不同樣品的pH調(diào)回至7.0,以S.aureus為指示菌檢測抑菌活性。

以上實驗均以不經(jīng)酶處理、pH6.0、20 ℃保存的細(xì)菌素抑菌活性為空白對照。以最高細(xì)菌素活性為100%,相對活性(%)=(各條件下測得的活性/最高活性)×100。

1.2.6 細(xì)菌素抗菌譜 指示菌株充分活化后液體培養(yǎng)至對數(shù)期,菌液稀釋至1.0×106CFU/mL,吸取150 μL涂布于各指示菌對應(yīng)的固體培養(yǎng)基,再按照1.2.1.2的瓊脂孔擴(kuò)散法測定抑菌活性,所用指示菌見表2。

表2 細(xì)菌素BLF52抑菌譜Table 2 Antibacterial spectrum of bacteriocin BLF52 against bacterial strains

1.2.7 細(xì)菌素對S.aureus的抑菌情況 參考文獻(xiàn)[16]報道的方法并稍作修改,S.aureusLB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)2 h分別按照10%和20%(v/v)的量分別添加發(fā)酵培養(yǎng)30 h的CFS,然后繼續(xù)培養(yǎng)至26 h。培養(yǎng)過程每2 h取樣測定OD600吸光值,分別繪制生長曲線,以不添加CFS 的S.aureus培養(yǎng)液為空白對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有檢測實驗均設(shè)置3個平行實驗,實驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。實驗數(shù)據(jù)用Excel 2010整理,SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對試驗結(jié)果差異顯著性分析,比較試驗中不同處理間差異。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)細(xì)菌素菌株篩選鑒定

總共從不同泡菜水中分離得到180株乳酸菌,其中進(jìn)一步篩選獲得16株菌有抑菌圈,排除乳酸及過氧化氫作用得到11株菌,進(jìn)一步蛋白酶敏感性檢測,8株菌所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對蛋白酶敏感,再次檢測以上菌株對常見食源性致病菌的抑菌性能,篩選得到一株抑菌性能較好的菌株深入研究,該菌株命名為CH-16。菌株菌落形態(tài)(圖1)及生理生化試驗(表1)顯示:菌落較小、表面濕潤、乳白色、表面光滑、邊緣整齊;接觸酶陰性、硝酸鹽還原陰性、明膠液化陰性、吲哚試驗陰性、V-P試驗陰性、淀粉水解陰性、運(yùn)動性試驗陰性;可利用葡萄糖、乳糖、麥芽糖,不能利用阿拉伯糖、木糖、棉子糖,參照《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》及《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》初步判斷菌株CH-16為發(fā)酵乳桿菌。

圖1 發(fā)酵乳桿菌菌體形態(tài)(1000×)Fig.1 Thallus appearance of strain CH-16(1000×)

表1 菌株CH-16的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characters of strain CH-16

注意:“+”表示呈現(xiàn)陽性,“-”表示呈陰性。

菌株CH-16克隆獲得的16S rDNA序列在NCBI中用BLAST搜索比對,得到與其同源的基因序列,并用MEGA軟件對這些序列進(jìn)行分析,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖2可知,該菌株與發(fā)酵乳桿菌處于同一進(jìn)化分支,菌株CH-16 16S rDNA序列同L.fermentum有99%的同源性。綜合生理生化鑒定與菌體形態(tài)進(jìn)一步確定菌株為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)。目前,國內(nèi)外已報道了從泡菜、發(fā)酵肉、發(fā)酵魚、奶酪、動物腸道等材料中分離到產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌,如Gao等[6]從發(fā)酵黃瓜中分離出一種產(chǎn)細(xì)菌素LactococcusgarvieaeLG34菌株;Hu等從發(fā)酵肉[1]類中分離產(chǎn)細(xì)菌素LactobacillusalimentariusFM-MM4;Pei等[17]從康普茶中分離出細(xì)菌素產(chǎn)生菌株Lactobacillusplantarum。乳酸菌屬早已被證實是安全無毒的菌種,發(fā)酵乳桿菌也已經(jīng)被確認(rèn)為GRAS(Generally Recognized as Safe)物質(zhì)[11]。目前雖然從泡菜中分離出多種產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌菌株,但發(fā)酵乳桿菌鮮有報道。

圖2 基于發(fā)酵乳桿菌CH-16 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree drived from the 16S rDNA sequence of L. fermentum CH-16 strain

2.2 乳酸菌生長動力學(xué)及細(xì)菌素合成

結(jié)果如圖3所示。菌株接種后3 h進(jìn)入指數(shù)生長期,快速生長至12 h后菌株生長減緩,從24 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期,OD600在2.2左右維持穩(wěn)定?？咕镔|(zhì)BLF52在發(fā)酵9 h即指數(shù)中后期開始合成,從抑菌活力曲線來看隨著菌體量增長,BLF52的產(chǎn)量也在不斷增加,BLF52活力和菌體密度呈現(xiàn)密切正相關(guān)。當(dāng)發(fā)酵時間達(dá)到21～30 h時,即菌株對數(shù)期的后期、穩(wěn)定期的前期,發(fā)酵液中BLF52活力達(dá)到最大875 AU/mL。在30～36 h這段時間里BLF52抑菌活性有所下降,推測菌體釋放的蛋白酶降解了部分細(xì)菌素。從菌體生長曲線和細(xì)菌素合成量判斷,BLF52為初級代謝產(chǎn)物。細(xì)菌素產(chǎn)量高低是評價其是否具有開發(fā)應(yīng)用價值的重要指標(biāo)。以S.aureus為指示菌株BLF52最大活力為875 AU/mL,相比來源于LeuconostocmesenteroidesE131[18](1280 AU/mL)、Lactobacillusparacasei[19](1800 AU/mL)、StaphylococcushaemolyticusMSM[20](2500 AU/mL)等微生物的細(xì)菌素產(chǎn)量略低,但考慮到本研究的菌株為初步篩選獲得的野生菌株,還未經(jīng)過誘變篩選,也未經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化,故抗菌物質(zhì)BLF52發(fā)酵活力還有較高的提升空間。

圖3 發(fā)酵乳桿菌CH-16生長動力學(xué)及細(xì)菌素BLF52合成Fig.3 Growth kinetics of L. fermentum CH-16 and bacteriocin BLF52 production

2.3 細(xì)菌素分離純化

發(fā)酵上清液CFS經(jīng)硫酸銨鹽析、透析和超濾后上樣Sephadex G-15層析柱進(jìn)一步純化,經(jīng)洗脫得到68管收集洗脫液,每管收集4 mL,所有洗脫管分為7組樣品分別以S.aureus檢測抑菌活性,結(jié)果顯示第5組樣品含有抑菌活性,其它無活性顯示。硫酸銨鹽析、透析及超濾去除了部分色素及雜蛋白,并有效濃縮樣品為后續(xù)高效柱層析提供基礎(chǔ)。凝膠過濾層析去除了大量殘余色素,并將細(xì)菌素同大分子蛋白高效分離。經(jīng)過前期純化后的細(xì)菌素樣品合并濃縮后進(jìn)一步通過半制備液相色譜純化,液相色譜圖如圖4所示,在80 min的洗脫時間中共洗脫出9個峰,且第9峰以后無洗脫峰出現(xiàn),表明洗脫完全,分別對這九個峰值洗脫液通過濾紙片法檢測抑菌活性,如圖4中所示,第6峰可以觀察到明顯的抑菌圈,其他八個峰沒有抑菌圈出現(xiàn)。由此表明,前期的分離純化雖然去除了大量蛋白、多糖及色素等雜質(zhì),但不能得到單一組分,半制備液相分離出很多雜質(zhì)峰,將細(xì)菌素和雜質(zhì)實現(xiàn)了較好的分離。目前,國內(nèi)外文獻(xiàn)報道了細(xì)菌素多種純化方法,如陰離子交換層析、凝膠過濾層析[21]、硫酸銨沉淀[21]、陽離子交換層析及RP-HPLC等。同文獻(xiàn)報道的純化方法相比,本研究純化步驟相對簡單,特別是半制備高效液相色譜法純化效率高,可以借鑒使用。

圖4 細(xì)菌素BLF52的高效液相色譜純化Fig.4 Purification of bacteriocin BLF52 by HPLC

2.4 Tricine-SDS-PAGE分子量測定

將經(jīng)過85%硫酸銨飽和度沉淀、透析、超濾濃縮、Sephadex G-15凝膠分子篩層析及HPLC等各純化步驟后收集的抑菌活性組分進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE檢測,結(jié)果如圖5所示,1號泳道顯示清晰的單一蛋白條帶,基本無雜質(zhì)蛋白。2號為凝膠原位抑菌實驗結(jié)果,顯示明顯的抑菌帶,其位置同1號泳道蛋白條帶位置一致,表明純化得到的條帶為細(xì)菌素樣品。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白相對遷移率計算得到細(xì)菌素分子量5.6 kDa,處于大部分報道的細(xì)菌素分子量范圍內(nèi)。不同來源的細(xì)菌素分子量往往不同,源自LactobacillusacidophilusMS1細(xì)菌素為6.5 kDa[21];PediococcusacidilacticiHW01的細(xì)菌素為6 kDa[22];Lysinibacillussp.的細(xì)菌素為51 kDa[23],均高于本研究細(xì)菌素分子量。而源自LactobacillusalimentariusFM-MM4的細(xì)菌素為1.104 kDa[1],Lactobacillusplantarum細(xì)菌素3.4 kDa[24],均小于本實驗的細(xì)菌素。而且本研究的細(xì)菌素分子量同最近報道的源于LactobacillusfermentumBZ532(1.105 kDa)細(xì)菌素分子量差異顯著,故BLF52可能是一種新型的細(xì)菌素。

圖5 純化的細(xì)菌素BLF52 Tricine-SDS-PAGE分析Fig.5 Tricine-SDS-PAGE of purified bacteriocin BLF52注:M:超小標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白Marker; 1:HPLC活性峰樣品;2:凝膠原位抑菌實驗。

2.5 細(xì)菌素BLF52穩(wěn)定性

2.5.1 細(xì)菌素的蛋白酶敏感性 熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性是細(xì)菌素能否作為食品防腐劑應(yīng)用的重要指標(biāo)之一。部分純化的BLF52經(jīng)蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶處理后,細(xì)菌素活性完全喪失,表明純化的抑菌物質(zhì)是具有蛋白質(zhì)特性結(jié)構(gòu),而α-淀粉酶處理后,抑菌活性基本無變化,由此表明抑菌物質(zhì)結(jié)構(gòu)中不存在與其活性重要相關(guān)的淀粉鏈。文獻(xiàn)報道的LactobacillusplantarumMBSa4[25]、LactobacillussakeiGM3[26]等乳酸菌細(xì)菌素在蛋白酶作用后失去全部活性,但Perumal等[27]報道的EnterococusfaecalisCV7細(xì)菌素活性幾乎不受多種蛋白酶的影響,表明不同細(xì)菌素其氨基酸組成和結(jié)構(gòu)不同,則對不同蛋白酶的敏感性有差別。

2.5.2 細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性 BLF52在溫度40～80 ℃之間穩(wěn)定性較好(圖6),相對活性均保持在90%以上,80 ℃以后抑菌活性開始出現(xiàn)明顯下降,但在100 ℃抑菌活性仍保持86.2%,在121 ℃處理15 min后,抑菌活性在43.5%,這與EnterococcusfaecalisKT2W2G[15]細(xì)菌素相似,其在100 ℃附近較為穩(wěn)定,在121 ℃加熱30 min后,其活性降低至50%。不同來源的細(xì)菌素的溫度穩(wěn)定性不同[5,28],說明不同微生物菌株所合成的細(xì)菌素結(jié)構(gòu)不同,氨基酸的構(gòu)成存在差異。

圖6 細(xì)菌素BLF52熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermostability of bacteriocin BLF52

2.5.3 細(xì)菌素的酸堿穩(wěn)定性 細(xì)菌素BLF52在pH2.0～7.0之間,相對活性都保持在90%以上(圖7);pH8.0～10.0穩(wěn)定性逐漸降低,pH10時活性保持在43.6%。由此看出BLF52更適合弱酸性或中性環(huán)境下使用,這與其他文獻(xiàn)報道的細(xì)菌素穩(wěn)定性相類似但又不完全相同,Wen等[29]從LactobacillusplantarumK25中分離的細(xì)菌素pH穩(wěn)定性在2.0～8.0之間;Lv等[5]研究的細(xì)菌素pH穩(wěn)定性在2.5～5.5之間。細(xì)菌素BLF52在使用環(huán)境pH7.0以下的酸性范圍效果更佳。

圖7 細(xì)菌素BLF52 pH穩(wěn)定性Fig. 7 pH stability of bacteriocin BLF52

2.6 細(xì)菌素BLF52抑菌譜

細(xì)菌素BLF52抑菌情況如表2所示,對革蘭氏陽性菌如單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌及蠟樣芽胞桿菌有非常強(qiáng)的抑菌活性,對糞腸球菌稍弱,對乳酸乳球菌、保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌無抑菌活性;對革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌、銅綠假單胞菌、傷寒沙門氏菌、副溶血性弧菌有較弱的抑菌活性,對志賀氏菌無抑菌活性。整體看,指示菌對BLF52的敏感性存在差異,革蘭氏陽性菌相比革蘭氏陰性菌對BLF52更敏感,BLF52對所試的全部乳酸菌無作用,這與目前國內(nèi)外所研究的乳酸菌素對乳酸菌類基本無抑制作用的特性相一致[30]。但BLF52對常見的食源性致病菌表現(xiàn)出廣譜抑菌特性,如對單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌菌有抑菌活性,這對其在食品中作為防腐劑使用對食品安全性具有重要意義。根據(jù)以往的文獻(xiàn)報道,乳酸菌抑菌物質(zhì)的抑菌譜較窄[31],對革蘭氏陰性菌沒有明顯的抑制作用,而且不同菌種產(chǎn)生的細(xì)菌素抑制譜不同[1,5],同報道的文獻(xiàn)相比,BLF52在抑制食源性致病菌方面更有優(yōu)勢,其有潛力開發(fā)為天然食品防腐劑。

2.7 細(xì)菌素對S. aureus的抑制作用

細(xì)菌素BLF52對S.aureus生長抑制情況如圖8所示,從不加BLF52的曲線來看,0～2 h菌體處于延遲期,生長緩慢;在2～8 h內(nèi),菌體生物量增長迅猛,曲線較陡,吸光度值從0.045升至1.797,而在8 h之后,菌體生物量增長速率逐漸緩慢。在菌體生長2 h后添加不同量的細(xì)菌素,2～4 h,菌體生長依然均呈現(xiàn)延遲期的特征,生長緩慢,但4 h后,兩者菌體量都開始逐漸增加,但同空白對照相比,菌體繁殖速度顯著緩慢;指示菌培養(yǎng)12 h后,添加10% CFS的指示菌培養(yǎng)液吸光值達(dá)到0.602,且12～24 h吸光值無明顯變化,24 h后開始增加;添加20% CFS的培養(yǎng)液菌體生長情況較10%的抑制作用更為強(qiáng)烈,14 h后菌體量逐漸減少,26 h吸光值達(dá)到最低0.125。整體表明細(xì)菌素對生長中的S.aureus有顯著的抑制作用,并通過殺菌模式達(dá)到抑菌作用。本研究細(xì)菌素對指示菌的抑制情況同文獻(xiàn)報道的EnterococcusfaeciumAQ71[16]細(xì)菌素相似。

圖8 發(fā)酵乳桿菌CH-16發(fā)酵液CFS 對S. aureus的抑制作用Fig.8 Effect of cell-free supernatant(CFS)of strain L. fermentum CH-16 on the growth of S. aureus

3 結(jié)論

本研究從傳統(tǒng)泡菜中分離到一株產(chǎn)細(xì)菌素菌株L.fermentumCH-16。通過分子篩凝膠層析和HPLC純化到單一組分細(xì)菌素,其分子量同已報道發(fā)酵乳桿菌細(xì)菌素有顯著區(qū)別,推測BLF52為一種新型細(xì)菌素。BLF52對G+菌及G-菌均有抑菌活性,但對G+菌抑制活性更強(qiáng),對常見的食源性致病菌如單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌菌有抑菌活性,但對所試乳酸菌無抑菌活性。BLF52熱穩(wěn)定性好,100 ℃加熱30 min,活性扔接近80%;且具有良好的酸堿耐受性,pH2.0～7.0環(huán)境下2 h活性保持80%以上。細(xì)菌素BLF52有潛力在食品特別是酸性食品中作為生物防腐劑使用。