響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取枇杷花槲皮素工藝及其對(duì)酒精分解關(guān)鍵酶活性的影響

徐 偉,馬智宇,李佳美,陳 華,范洪臣,張 光

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150076; 2.南通市天籟村農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司,江蘇海門 226100)

枇杷起源于中國(guó),18世紀(jì)傳入歐洲,19世紀(jì)傳入北美洲,在我國(guó)主要分布在浙江、江蘇、福建、四川等長(zhǎng)江以南各省[1-2]。枇杷(EriobotryajaponicaLindl.)為薔薇科枇杷屬植物,枇杷花包括花及花蕾,花蕾被淺棕色或黃色絨毛,花味淡雅清香,花期長(zhǎng)、花量大。枇杷樹的 80%～90%枝條都可形成花穗,并且單支花穗上花朵數(shù)為70～260左右,其中僅有 5%～20%的花可結(jié)成果實(shí),約30%～50% 的花穗因疏花保果而被浪費(fèi)[3]。根據(jù)《本草綱目》記載,枇杷的葉、花等均可以入藥[4],枇杷花富含類黃酮、類胡蘿卜素、三萜類、揮發(fā)油、礦物質(zhì)元素等營(yíng)養(yǎng)成分,姜帆等[5]篩選國(guó)內(nèi)外代表性枇杷種質(zhì)55份,采用分光光度法測(cè)定花中黃酮含量,發(fā)現(xiàn)不同枇杷種質(zhì)之間黃酮含有量范圍在0.44%～2.28%之間,黃酮含量分布在0.98%～1.23%區(qū)間的種質(zhì)較多。

黃酮類化合物有抗氧化以及對(duì)化學(xué)性肝損傷的輔助保護(hù)功能。天然黃酮類化合物主要分為:黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮等,槲皮素(Quercetin)是黃酮醇類化合物的一種,有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗血栓等生物活性[6-7],可有效防治肝損傷,主要體現(xiàn)在抗氧化應(yīng)激、促進(jìn)抗氧化酶合成等方面[8-9],研究表明槲皮素可通過恢復(fù) frataxin 蛋白表達(dá)水平拮抗酒精性肝線粒體損傷[10],以及降低自由基水平和促炎物質(zhì)的釋放水平等[11]。據(jù)研究可知,酒精進(jìn)入人體后90%在肝臟內(nèi)被代謝[12-15]。當(dāng)血液中乙醇濃度不高時(shí),乙醇在乙醇脫氫酶(ADH)催化下被氧化為乙醛;當(dāng)乙醇濃度過高時(shí),ADH代謝系統(tǒng)為乙醇的主要代謝途徑,同時(shí)借助于過氧化氫酶(CAT)系統(tǒng)等進(jìn)行代謝形成乙醛[16];乙醛在乙醛脫氫酶(ALDH)的作用下代謝成乙酸,乙酸分解為水和CO2后排出體外[17],故乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶、過氧化氫酶的活性對(duì)酒精分解起重要作用。

微波輔助提取法高效、環(huán)保[18],近年來在中草藥成分提取中被廣泛應(yīng)用?；趩我蛩睾晚憫?yīng)面分析法,采用微波輔助優(yōu)化枇杷花槲皮素提取工藝,并對(duì)其在體外酒精分解過程中關(guān)鍵酶的影響進(jìn)行初步研究。目前市場(chǎng)上解酒護(hù)肝產(chǎn)品均以藥類為主,本課題利用廢棄的枇杷花資源研究開發(fā)解酒護(hù)肝輔助食品,有廣闊的市場(chǎng)空間,為枇杷花的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枇杷花 江蘇省海門市天籟村古枇杷園;無水乙醇、乙醛 分析純,天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠;槲皮素 色譜純,阿拉丁試劑公司;溴化鉀 光譜純,青島青藥生物工程有限公司;HP20型大孔吸附樹脂 山東摩爾化工有限公司;乙醇脫氫酶(ADH)、乙醛脫氫酶(ADH)、氧化型輔酶I(NAD+) 純度≥98%,美國(guó)Sigma公司;過氧化氫酶(CAT) 北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

HX-MC-1實(shí)驗(yàn)室微波合成儀 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司;723N UV5100型紫外可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;FT-IRC97951傅立葉變換紅外光譜儀 Sartorius公司;VERSA max酶標(biāo)儀(配有SoftMax Pro標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)分析和儀器控制軟件) Molecular Devices公司;3590酶標(biāo)板 美國(guó)Corning公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微波輔助提取枇杷花槲皮素工藝 枇杷花自然風(fēng)干至恒重,粉碎過60目篩備用。精確稱取2 g枇杷花粉末于三口燒瓶中,將三口燒瓶及冷凝裝置安裝至微波合成儀中,加入適當(dāng)濃度的乙醇溶液在一定微波功率下提取,靜置冷卻,真空抽濾得到含有槲皮素的枇杷花提取液。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定溶劑乙醇濃度為60%,設(shè)定溫度為固定值60 ℃。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 料液比對(duì)槲皮素提取量的影響 稱取2 g枇杷花粉末,按照料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 (g/mL)),在微波功率600 W,微波時(shí)間25 min條件下提取,靜置冷卻,真空抽濾備用,研究料液比對(duì)槲皮素提取量的影響。

1.2.2.2 微波時(shí)間對(duì)槲皮素提取量的影響 稱取2 g枇杷花粉末,按照微波時(shí)間(10、15、20、25、30 min),在料液比1∶10 (g/mL),微波功率600 W條件下提取,靜置冷卻,真空抽濾備用,研究微波時(shí)間對(duì)槲皮素提取量的影響。

1.2.2.3 微波功率對(duì)槲皮素提取量的影響 稱取2 g枇杷花粉末,按照微波功率(300、400、500、600、700 W),在料液比1∶10 (g/mL),微波時(shí)間25 min條件下提取,靜置冷卻,真空抽濾備用,研究微波功率對(duì)槲皮素提取量的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用Box-Behnken組合設(shè)計(jì),以枇杷花槲皮素提取量為響應(yīng)值進(jìn)行提取條件優(yōu)化,見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levelsTable of response surface experiments

1.2.4 枇杷花槲皮素提取量的測(cè)定 精確稱取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,使用60%乙醇定容至50 mL,得到濃度為0.2 mg/mL的槲皮素溶液,分別取2、3、4、5、6、7 mL至100 mL容量瓶中,60%乙醇定容。在波長(zhǎng)374 nm處,使用紫外分光光度法測(cè)量槲皮素質(zhì)量濃度(y)與吸光度(x)之間的關(guān)系,得到方程y=0.0161x+0.0006(R2=0.9994),槲皮素含量在4～14 μg/mL之間線性關(guān)系良好。

將微波提取得到的枇杷花槲皮素提取液,離心取1 mL清液以60%乙醇稀釋100倍,以乙醇作為空白對(duì)照組進(jìn)行校正,于波長(zhǎng)375 nm下測(cè)定吸光度,試驗(yàn)測(cè)定3次,對(duì)所得結(jié)果取平均值。枇杷花槲皮素提取量計(jì)算公式如下:

式中:m為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的槲皮素質(zhì)量濃度(mg/mL);V為提取液即溶劑的體積(mL);N為稀釋倍數(shù);M為枇杷花粉取樣量(g)。

1.2.5 枇杷花槲皮素的分離純化及紅外光譜分析 將枇杷花槲皮素提取物經(jīng)減壓濃縮至體積恒定,約為原體積的15%,使用60%乙醇溶液稀釋濃度至0.2 mg/mL,取50 mL為上樣溶液,調(diào)至 pH=8,稱取預(yù)處理過的HP-20型樹脂10 g,濕法裝柱,以上樣流速為2 mL/min過HP-20型樹脂進(jìn)行富集純化,使用95%乙醇洗脫,洗脫流速為2 mL/min,收集洗脫液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味,進(jìn)行真空冷凍干燥(真空度-0.8 MPa,溫度-80 ℃)后使用研缽研磨成粉末。使用KBr壓片法進(jìn)行紅外光譜分析。

1.2.6 枇杷花槲皮素對(duì)體外解酒過程中關(guān)鍵酶的活性影響實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 ADH激活率的測(cè)定 體外測(cè)定在瓦勒-霍赫法(Valle & Hoch)[19]基礎(chǔ)上稍作改動(dòng)。在96孔板中分別依次加入75 μL pH為8.8的焦磷酸鈉緩沖溶液、50 μL的27 mmol/L氧化型輔酶I溶液(NAD+)、25 μL的12%體積比的乙醇溶液為底物溶液,兩個(gè)樣品組分別添加1.0 mg/mL枇杷花槲皮素溶液和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL。對(duì)照組用10 μL蒸餾水代替枇杷花槲皮素溶液;空白組用25 μL蒸餾水代替11.5%的乙醇溶液,10 μL蒸餾水代替枇杷花槲皮素溶液;其他條件相同?；旌虾竺芊庥?5 ℃水浴5 min。然后立即加入0.3 U/mL的ADH溶液5 μL并搖勻,于340 nm處每10 s記錄一次吸光度值,連續(xù)測(cè)定5 min。

ADH酶活的計(jì)算公式如下:

式中:E-ADH 酶活力(U/mL),A-吸光度每分鐘的增大值,V-反應(yīng)液的總體積(mL),EW-加入的ADH酶液活性(U/mL),6.22-NADH在340 nm下的摩爾消光系數(shù),Q-ADH的激活率(%),E0-空白組酶活力。

1.2.6.2 ALDH激活率的測(cè)定 在96孔板中分別依次加入30 μL的pH為8.0的磷酸鈉緩沖液、200 μL的氧化型輔酶I溶液(NAD+)、10 μL底物溶液;兩個(gè)樣品組分別添加1.0 mg/mL枇杷花槲皮素溶液和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液2 μL后加入2 μL ALDH酶溶液,25 ℃保溫5 min。對(duì)照組用2 μL蒸餾水代替枇杷花槲皮素溶液;空白組用10 μL蒸餾水代替底物溶液;2 μL蒸餾水代替枇杷花槲皮素溶液;其他條件相同?；旌虾竺芊庥?5 ℃水浴5 min。然后立即加入0.3 U/mL的ALDH溶液2 μL,搖勻后于340 nm每10 s記錄一次吸光度值,連續(xù)測(cè)定5 min。計(jì)算方法同1.2.5.1。

1.2.6.3 CAT激活率的測(cè)定 具塞試管中分別依次加入0.4 mL的pH為7.4的鈉-鉀磷酸鹽緩沖液、2 mL的65 μmol/L的H2O2底物溶液,37 ℃溫育5 min,0.4 mL的CAT酶溶液[20],37 ℃準(zhǔn)確溫育60 s后加入枇杷花槲皮素溶液和鉬酸銨溶液;其中標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照組使用槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液代替枇杷花槲皮素溶液;空白組用蒸餾水代替枇杷花槲皮素溶液;空白二組用蒸餾水代替底物溶液,室溫10 min后測(cè)定405 nm下吸光度值。

CAT酶活的計(jì)算公式如下:

式中:E-CAT酶活力(U/mL),A-樣液吸光度每分鐘的增大值,A0-空白組吸光度每分鐘的增大值,A2-空白二組吸光度每分鐘的增大值,Q-CAT 的激活率(%),E0-空白組酶活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016和SPSS軟件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理,Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)枇杷花槲皮素提取量的影響 料液比對(duì)枇杷花槲皮素提取量的影響見圖1。由圖1可知,枇杷花槲皮素的提取量隨提取溶劑比例的增大而增大,當(dāng)料液比為1∶10 (g/mL)時(shí),枇杷花槲皮素的提取量到達(dá)了最高值6.831 mg/g,可能是由于此時(shí)提取溶劑與枇杷花細(xì)胞已經(jīng)充分接觸[21],槲皮素浸出基本達(dá)到最大值;當(dāng)溶劑的比例繼續(xù)增大時(shí),枇杷花槲皮素的提取量降低,因此確定料液比為1∶10 (g/mL)。

圖1 料液比對(duì)枇杷花槲皮素提取量的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction yield of quercetin注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05);圖2～圖3同。

2.1.2 微波提取時(shí)間對(duì)枇杷花槲皮素提取量的影響 微波提取時(shí)間對(duì)枇杷花槲皮素提取量的影響見圖2。當(dāng)提取時(shí)間在10～20 min范圍內(nèi),枇杷花槲皮素提取量逐漸增大,20～25 min時(shí)枇杷花槲皮素提取量增加幅度大,提取時(shí)間為25 min時(shí)枇杷花槲皮素提取量出現(xiàn)最大值;提取時(shí)間為25～30 min時(shí)枇杷花槲皮素提取量無明顯變化,可能是因?yàn)殚纹に亟?jīng)長(zhǎng)時(shí)間的高溫浸泡,分子結(jié)構(gòu)遭到破壞,雜質(zhì)溶出,體系黏度增加[22]。因此,提取量近似時(shí),在節(jié)省溶劑的前提下確定25 min為最佳提取時(shí)間。

圖2 微波提取時(shí)間對(duì)枇杷花槲皮素提取量的影響Fig.2 Effect of time on the extraction yield of quercetin

2.1.3 微波功率對(duì)枇杷花槲皮素提取量的影響 微波功率對(duì)枇杷花槲皮素提取量的影響見圖3。隨著微波功率增加,槲皮素提取量逐漸增加,在微波功率600 W時(shí),槲皮素提取量達(dá)到最高值,功率越高,萃取時(shí)溶劑擴(kuò)散速度越快,溫度升高,對(duì)枇杷花細(xì)胞的破壞作用越大,有利于槲皮素溶出,功率與提取量呈線性正相關(guān);隨著微波功率增加,提取量略有降低,這

圖3 微波功率對(duì)枇杷花槲皮素提取量的影響Fig.3 Effect of microwave power on the extraction yield of quercetin

可能是由于此時(shí)槲皮素分子的溶出基本達(dá)到最大值,溶出與擴(kuò)散的速率和量已基本達(dá)到平衡[23]。從節(jié)能和提取效率等因素綜合考慮,選擇600 W為最佳提取功率。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2,分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果得回歸方程為:Y=8.17-0.42A+0.39B+0.48C-0.22AB+0.16AC+0.45BC-1.27A2-0.12B2-0.62C2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface experiments design and results

圖5 微波提取時(shí)間和功率對(duì)槲皮素提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Plots for the effects of time and microwave power on the yield of quercetin

2.2.1 方差分析及顯著性檢驗(yàn) 方差分析及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表 3?？梢钥闯鲈撃Ｐ突貧w極顯著,失擬項(xiàng)不顯著,決定系數(shù)R2=0.9986,說明該模型能解釋99.86%的響應(yīng)值變化,因而該模型擬合程度比較好,可以用此模型對(duì)槲皮素提取進(jìn)行分析和預(yù)測(cè),建模成功。各因素對(duì)枇杷花槲皮素提取量的影響從大到小依次為:C微波提取功率(W)>A微波提取時(shí)間(min)>B料液比(g/mL)。

表3 方差分析及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Analysis of variance and significance test of the regression model

2.2.2 因素交互作用分析 交互作用對(duì)槲皮素提取量的影響見圖4～圖6。固定微波功率,隨著微波提取時(shí)間和液固比的增大,槲皮素提取量有先增大后減小的趨勢(shì)。固定料液比,隨著微波提取時(shí)間和功率的增大,槲皮素提取量有先增大后減小的趨勢(shì)。固定提取時(shí)間,槲皮素提取量隨著功率和液固比的增大呈先升高再降低的趨勢(shì);曲面坡度陡峭程度明顯。

圖4 微波提取時(shí)間和液固比對(duì)槲皮素提取量的影響Fig.4 Plots for the effects of time and liquid/solid ratio on the yield of quercetin

圖6 微波功率和液固比對(duì)槲皮素提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Plots for the effects of microwave power and liquid/solid ratio on the yield of quercetin

響應(yīng)面優(yōu)化分析得到的最優(yōu)條件為:微波提取時(shí)間23.49 min、微波提取功率603.93 W、液固比12.64 mL/g,在此條件下模型預(yù)測(cè)槲皮素提取量為8.29 mg/g;考慮到實(shí)際操作,以上條件優(yōu)化為:微波提取時(shí)間25 min、微波提取功率600 W、料液比1∶15 g/mL;在此條件下進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn),平均提取量為8.26 mg/g,與預(yù)測(cè)值接近。

2.3 枇杷花槲皮素提取物的紅外光譜分析

經(jīng)過HP-20型樹脂純化后的枇杷花槲皮素(純度為64.87%)經(jīng)過真空冷凍干燥后制成粉末,使用KBr壓片法進(jìn)行紅外光譜分析。

紅外光譜分析結(jié)果見圖7。1663 cm-1處出現(xiàn)C=O拉伸振動(dòng)峰,1611 cm-1處出現(xiàn)苯環(huán)骨架C=C伸縮振動(dòng)吸收峰,1382 cm-1處出現(xiàn)C-OH羥基面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰,以上均為槲皮素分子官能團(tuán)的主要吸收峰,可初步推測(cè)提取物中含有槲皮素單體[26]。

圖7 枇杷花槲皮素提取物的紅外光譜Fig.7 Infrared spectra of quercetin extract from loquat flower

此外,3336～3468 cm-1出現(xiàn)較寬較強(qiáng)的吸收峰,是羥基的伸縮振動(dòng)峰,表明存在較大量的酚羥基或糖上的羥基;在2853 cm-1出現(xiàn)-CH2的伸縮振動(dòng),吸收峰的強(qiáng)度較小,說明飽和碳上的氫較少;1525 cm-1處有吸收峰,處于紅外光譜圖的第三、四峰區(qū),表征為苯環(huán)的伸縮振動(dòng),說明芳環(huán)結(jié)構(gòu)的存在;在1093 cm-1左右出現(xiàn)較強(qiáng)吸收峰,是C-O的伸縮振動(dòng)峰;綜上,初步推測(cè)枇杷花槲皮素提取物中含有槲皮素等黃酮醇單體存在。

2.4 體外解酒酶活實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,結(jié)果取平均值。采取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn),探究枇杷花槲皮素對(duì)酒精分解中關(guān)鍵酶的激活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,純化后的枇杷花槲皮素提取物對(duì)解酒過程中三種關(guān)鍵酶ADH、ALDH、CAT的活性均有一定提高，激活率分別為:24.83%、29.18%、22.36%。枇杷花槲皮素有助于酒精分解,其降低乙醇濃度的機(jī)制之一是通過提高ADH、ALDH、CAT的活性,加速乙醇和乙醛的分解;現(xiàn)有研究表明,葛花人參合煎液對(duì)ADH的激活率為21.3%,其中葛花中含有槲皮素及多種化合物[27];非水相中制備的玉米肽在體外試驗(yàn)中對(duì)ADH 激活率為27.1%,ALDH 激活率為 50.0%[28];枇杷花槲皮素對(duì)ADH的激活率較低,這可能是由于枇杷花槲皮素成分較單一、含有一定雜質(zhì)以及純度不夠高等原因造成的。

表4 枇杷花槲皮素對(duì)ADH、ALDH、CAT激活率的影響Table 4 Effects of quercetin from loquat flower on activation rates of ADH,ALDH and CAT

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)考察料液比、微波時(shí)間、微波功率對(duì)枇杷花槲皮素提取量的影響,響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化枇杷花槲皮素的最佳提取工藝,實(shí)驗(yàn)擬合性好,得到最佳提取工藝條件為微波提取時(shí)間25 min、微波提取功率600 W、料液比1∶15 g/mL;在該條件下枇杷花槲皮素的提取量為8.26 mg/g。HP-20型大孔樹脂純化后的枇杷花槲皮素提取物對(duì)解酒過程中三種關(guān)鍵酶ADH、ALDH、CAT的活性均有一定提高;激活率分別為:24.83%、29.18%、22.36%。枇杷花槲皮素的微波輔助提取可為廢棄枇杷花資源化、高值化轉(zhuǎn)化提供一定技術(shù)參考,同時(shí)也為開發(fā)解酒護(hù)肝輔助食品提供有效的生物活性物質(zhì),若能進(jìn)一步提高枇杷花槲皮素純度以及與其他產(chǎn)品進(jìn)行復(fù)配等,該類產(chǎn)品將有廣闊的應(yīng)用價(jià)值及市場(chǎng)空間。