沙棘多酚提取純化工藝研究

呂佳瑋,王 頡,劉亞瓊,孫劍鋒,王文秀,龔 慧,牟建樓

(河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,河北保定 071000)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)是胡頹子科沙棘屬[1],又被稱為醋柳、黑刺,我國是世界上沙棘資源蘊藏量最豐富的國家[2],素有“沙棘”王國之稱。沙棘為藥食同源的植物,沙棘的根、莖、葉、花、果,特別是沙棘果實富含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)[3],可以廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[3]。據(jù)測定沙棘果實含有維生素、脂肪酸、多酚等營養(yǎng)物質(zhì)[5]。

沙棘中含有黃酮類、多酚類、甾醇類及微量元素等功能活性物質(zhì)[6],其中多酚類化合物是其主要的功能性成分[6]。目前,沙棘多酚的提取方式主要有超臨界流體萃取法和常規(guī)溶劑提取法,常規(guī)溶劑提取法效率低,耗時長,而超臨界流體萃取法則存在設(shè)備成本大以及產(chǎn)品回收率低等缺點[8],超聲波輔助提取法具有效率高、節(jié)省溶劑、時間短、對有效成分影響小等特點[9],被廣泛應(yīng)用于食品中活性成分的提取。雖然越來越多的提取方法被優(yōu)化,但是多酚粗提物中仍含有大量的蛋白質(zhì)、糖、酯類等,沙棘多酚純化的方法有離子沉淀法、大孔樹脂吸附法和膜過濾法等,其中膜過濾法存在膜容易受到外界雜質(zhì)的影響、純化速度慢等缺點,離子沉淀法存在某些有毒金屬離子在產(chǎn)品中有殘留、對設(shè)備耐腐蝕性較高等缺點,而大孔樹脂吸附法具有選擇性高、可重復(fù)利用等特點,目前已有研究表明用大孔樹脂純化后的多酚純度以及抗氧化性都有明顯提高,但不同的大孔樹脂對沙棘多酚的純化效果也不相同[10-12],所以大孔樹脂的選擇也是值得關(guān)注的問題。

沙棘的營養(yǎng)價值和藥用價值極高,但我國對沙棘的研究開發(fā)起步較晚,缺少高附加值、精深加工產(chǎn)品,如果能有效利用沙棘中的營養(yǎng)物質(zhì),則可以很大程度上推動我國西部地區(qū)的發(fā)展,創(chuàng)造更高的經(jīng)濟和社會效益。本試驗以沙棘凍干粉為主要原料,通過響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助溶劑提取工藝參數(shù),并采用大孔樹脂對多酚進行純化,旨在為沙棘的高質(zhì)化利用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阿勒泰大果沙棘凍干粉 采自新疆維吾爾自治區(qū)阿泰勒地區(qū);無水乙醇、福林酚、碳酸鈉、沒食子酸標品 天津天利化學試劑有限公司,分析純;2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)、2,2-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS) 廣州偉伯科技有限公司,分析純;D101大孔樹脂(非極性)、AB-8大孔樹脂(弱極性)、NKA-9大孔樹脂(極性) 東鴻化工有限公司。

ID5002C型電子天平 天津天馬橫基儀器有限公司;TU-1810型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;15R型高速冷凍離心機 力康生物醫(yī)療科技控股有限公司;RHCX-100W型超聲清洗機 濟寧榮匯超聲波設(shè)備有限公司;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州世紀雙科試驗儀器有限公司;RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海精密儀器儀表有限公司;DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱 廣東精華智能裝備有限公司;Multiskan FC全自動酶標儀 濟南銘倍醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沙棘多酚提取 準確稱取1 g沙棘凍干粉,置于100 mL錐形瓶中,按照試驗設(shè)計加入一定濃度的乙醇溶液,混合均勻后,在300 W功率和一定溫度的超聲輔助下提取一定時間,將得到的粗提液在5000 r/min下離心10 min,得到沙棘多酚提取液[13]。

1.2.2 單因素實驗 在乙醇濃度為50%,超聲時間為50 min,超聲溫度為50 ℃,考察料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g/mL)對沙棘多酚提取量的影響;在料液比為1∶20 g/mL,超聲時間為50 min,超聲溫度為50 ℃時,考察乙醇溶液濃度為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%對沙棘多酚提取量的影響;在料液比為1∶20 g/mL,乙醇濃度為50%,超聲溫度為50 ℃時,考察超聲時間為20、30、40、50、60 min對沙棘多酚提取量的影響;在料液比為1∶20 g/mL,乙醇濃度為50%,超聲時間為50 min時,考察超聲溫度為30、40、50、60、70 ℃對沙棘多酚提取量的影響。

1.2.3 沙棘多酚提取條件優(yōu)化 在單因素實驗礎(chǔ)上,選擇料液比、乙醇濃度、超聲時間和超聲溫度四個因素,多酚提取量為指標,進行Box-Behnken響應(yīng)面試驗,優(yōu)化提取參數(shù),響應(yīng)面試驗因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Factors and levelsTable of response surface experiment

1.2.4 沒食子酸標曲繪制 參照蘇海蘭等[14]的方法,用移液槍移取沒食子酸工作液(10、20、40、60、80 μg·mL-1)、去離子水各1.0 mL加入到10 mL容量瓶中,再分別在容量瓶中加入1.0 mL的10%福林酚試劑,搖勻,反應(yīng)5 min,之后再分別在容量瓶中加入2.0 mL 7.5% Na2CO3溶液,加去離子水定容至刻度,放在室溫下反應(yīng)60 min,在765 nm波長下測定吸光度(A)。以沒食子酸濃度(C)為橫坐標,吸光度(A)為縱坐標,作沒食子酸標準曲線,得回歸方程為Y=0.7547X+0.0396(R2=0.9972),表明沒食子酸在0.01～0.08 μg/mL呈良好線性關(guān)系。

1.2.5 沙棘多酚提取量測定 用1.2.1中得到的沙棘提取液代替沒食子酸工作液,測定吸光值,代入標準曲線中,按照下式計算多酚提取量。

式(1)

其中:C為待測液中多酚濃度(μg/mL),V為提取液的體積(mL),N為稀釋倍數(shù),W為稱取沙棘凍干粉的質(zhì)量(g),EGCG為沒食子酸當量。

1.2.6 沙棘多酚的純化

1.2.6.1 大孔樹脂預(yù)處理 參照何婷等[15]的方法,用95%乙醇溶液浸泡24 h,再用1 mol/L HCl溶液浸泡8 h,用去離子水沖洗大孔樹脂,再用1 mol/L NaOH溶液浸泡8 h,用去離子水沖洗樹脂。

1.2.6.2 大孔樹脂選擇 參照楊美蓮等[16]的方法,采用靜態(tài)吸附-解析方法選擇合適的大孔樹脂,準確稱取1 g處理好的大孔樹脂,置于100 mL容量瓶中,20 mL加入0.6 mg/mL沙棘多酚粗提液放置于25 ℃下振蕩24 h,并通過下式計算吸附率(2)。

式(2)

將1.2.6.2中吸附完全的大孔樹脂洗凈濾干,加入20 mL 50%乙醇溶液,放置于25 ℃下振蕩24 h進行解析,并通過下式計算解析率(3)。

式(3)

其中:A0為吸附前吸光度,A1為吸附后吸光度,A2為解析后吸光度[17]。

1.2.7 沙棘多酚體外抗氧化性測定 利用選擇的樹脂對沙棘多酚進行純化,將純化前后的沙棘多酚進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),以除去乙醇,然后進行冷凍干燥,測定純化前后沙棘多酚對DPPD自由基清除率和ABTS+·清除率。

1.2.7.1 純化前后沙棘多酚對DPPD自由基清除率的測定[18]準確吸取200 μL 0.1 mmol/L的DPPH溶液置于96孔板中,分別加入100 μL不同稀釋倍數(shù)的沙棘多酚樣液(50、100、200、500、1000 μg/mL),充分混合均勻后,避光反應(yīng)30 min,在517 nm下測定吸光度值A(chǔ)1,相同的方法測定100 μL不同濃度的樣液和200 μL無水乙醇的吸光度值A(chǔ)2以及測定200 μL DPPH溶液和100 μL無水乙醇的吸光度值A(chǔ)3,按照公式(4)計算DPPH自由基清除率。

式(4)

1.2.7.2 純化前后沙棘多酚對ABTS+·清除率的測定[18]ABTS工作液配制:配制7.4 mmol/L的ABTS溶液和2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液,然后將兩種溶液等體積混合,并使其在黑暗中反應(yīng)14 h后,在734 nm處調(diào)整吸光度A約為0.7。

準確吸取250 μL ABTS工作液置于96孔板中,分別加入50 μL不同稀釋倍數(shù)的沙棘多酚樣液(10、20、50、100、200 μg/mL),充分混合均勻后,避光反應(yīng)60 min,在743 nm下測定吸光度值A(chǔ)i,相同的方法測定50 μL不同濃度的樣液和250 μL無水乙醇的吸光度值A(chǔ)j以及測定250 μL BTS工作液和50 μL無水乙醇的吸光度值A(chǔ)0,按照公式(5)計算ABTS+·清除率。

式(5)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 料液比對多酚提取量的影響 料液比對多酚提取量的影響如圖1所示,多酚的提取量隨著料液比的增加呈現(xiàn)先上升后保持穩(wěn)定的趨勢,料液比為1∶20 g/mL多酚提取量最大,達到8.13 EGCGmg/g。料液比在1∶10～1∶20之間時沙棘多酚的提取量差異性顯著(P<0.05),可能是因為溶劑的增加提高了多酚物質(zhì)與溶劑的濃度差,從而使提取的多酚提取量上升,料液比1∶20～1∶30之間,多酚的提取量差異不顯著,可能是因為多酚的溶出量達到了最大[20-21],在實際生產(chǎn)中,料液比的高低和生產(chǎn)效益密切相關(guān),乙醇用量越大,相對效益減少,因此,為盡量減少生產(chǎn)成本,1∶20 g/mL為較適宜的料液比。

圖1 不同料液比對多酚提取量的影響Fig.1 Effect of different feed-liquid ratio on polyphenol extraction注:不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著；圖2～圖4同。

2.1.2 乙醇濃度對多酚提取量的影響 乙醇濃度對多酚提取量的影響如圖2所示,多酚提取量隨著乙醇濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,乙醇濃度為50%時沙棘多酚的提取量達到最大,達到8.80 mgEGCG/g。50%的乙醇濃度與其他濃度相比存在顯著性差異(P<0.05),40%和60%差異不顯著,當乙醇濃度增大時,溶劑的極性降低,更容易破壞植物體內(nèi)多酚類物質(zhì)與多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)間的氫鍵,促使多酚類物質(zhì)的溶出增加,繼續(xù)增加乙醇濃度時,溶劑極性較弱,增加了沙棘中的其他醇溶性物質(zhì)與多酚的競爭性溶出[22],從而使多酚的提取量下降,所以50%為較合適的乙醇濃度。

圖2 不同乙醇濃度對提取多酚提取量的影響Fig.2 Effect of different ethanol concentrations on polyphenol extraction

2.1.3 超聲時間對多酚提取量的影響 超聲時間對多酚提取量的影響如圖3可示,沙棘多酚的提取量隨著超聲時間的增加呈現(xiàn)先增加后不變的趨勢,超聲時間為50 min時,多酚提取量達到最大,為8.46 mgEGCG/g。50 min的超聲時間與其他超聲時間(20～40 min)相比存在顯著性差異(P<0.05),50和60 min之間沒有顯著性差異,由于時間的增加,導(dǎo)致其他的物質(zhì)的溶出,從而抑制多酚的溶出,從而使多酚的提取量不變,所以50 min為較合適的超聲時間。

圖3 不同超聲時間對多酚提取量的影響Fig.3 Effect of different ultrasonic time on the extraction of polyphenols

2.1.4 超聲溫度對多酚提取量的影響 超聲溫度對多酚提取量的影響如圖4所示,多酚的提取量隨著超聲溫度的增加呈現(xiàn)先增加后不變的趨勢,超聲溫度在50 ℃時,多酚的提取量達到8.53 mgEGCG/g。50 ℃的超聲溫度與60和70 ℃之間沒有顯著性差異,與其他溫度之間有顯著性差異(P<0.05),這是可能是由于隨著溫度的升高,沙棘粉的顆粒運動加快,有利于沙棘多酚的溶出,當溫度過高時,沙棘多酚被分解,而且有利于油溶性物質(zhì)溶出[23],與多酚產(chǎn)生競爭,從而影響了多酚的提取量,所以50 ℃為較合適的超聲溫度。

圖4 不同超聲溫度對多酚提取量的影響Fig.4 Effect of different ultrasonic temperatures on polyphenol extraction

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化沙棘多酚提取試驗結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立與分析 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,進行響應(yīng)面試驗,試驗方案及結(jié)果如表2所示。以多酚含量(y)為響應(yīng)值,建立與自變量料液比(A)、乙醇濃度(B)、超聲時間(C)、超聲溫度(D)的四因素回歸模型,通過Design-Expert 8.0軟件對試驗結(jié)果進行分析,得到的多元二次回歸方程分別為:y=8.80+0.18A-0.097B+0.069C-0.015D-8.490E-003AB+0.018AC-0.26AD-0.032BC-6.569E-003BD-0.039CD-0.69A2-0.41B2-0.31C2-0.52D2。

表2 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

表3 響應(yīng)面模型方差分析結(jié)果Table 3 Response surface model analysis of variance

2.2.2 響應(yīng)交互作用圖及等高線分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件對回歸模型進行響應(yīng)面優(yōu)化,得到料液比、乙醇濃度、超聲時間和超聲溫度四個因素交互影響對沙棘多酚提取的響應(yīng)曲面圖和等高線圖。運用響應(yīng)面回歸方程模型和各因素交互作用三維曲面圖進行分析[23]。

料液比、乙醇濃度、超聲時間和超聲溫度對響應(yīng)值多酚提取量的影響如圖5所示,等高線的趨勢和形狀可以代表各因素間交互作用的強弱,等高線偏向橢圓代表二者交互作用顯著,圓形則代表交互作用不顯著。在圖中可以看出,料液比與超聲溫度交互作用對多酚提取量的影響顯著,其它因素交互作用對多酚提取量的影響不顯著,這與方差分析結(jié)果一致。

圖5 料液比、乙醇濃度、超聲時間和超聲溫度對響應(yīng)值多酚提取量的影響Fig.5 Effect of material-liquid ratio,ethanol concentration,ultrasonic time and ultrasonic temperature on response polyphenol content

2.2.3 回歸模型驗證 根據(jù)回歸模型預(yù)測最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為:料液比為1∶23.56 g/mL,乙醇濃度為48.71%,超聲時間為51.50 min,超聲溫度為48.02 ℃,在此條件下響應(yīng)值最大,預(yù)測值為(8.61±0.25) EGCGmg/g,考慮到實際生產(chǎn)的操作性,將提取工藝參數(shù)修正為料液比為1∶24 g/mL,乙醇濃度為49%,超聲時間為52 min,超聲溫度為48 ℃,為驗證該模型的預(yù)測是否正確,在修正后的參數(shù)下進行3次試驗,得到的多酚提取量為(8.60±0.14) EGCGmg/g,與預(yù)測值接近,表明該模型有效。

2.3 沙棘多酚的純化

2.3.1 大孔樹脂的篩選 如表4所示,AB-8、D101和NAK-9的吸附率有顯著差異(P<0.05),其中AB-8的吸附率最高,D101的解析率最高,綜合吸附率和解析率來看,選擇AB-8為純化沙棘多酚的合適的樹脂。

表4 不同大孔樹脂對多酚吸附率和解析率的影響Table 4 Effect of different macroporous resins on polyphenol adsorption and resolution

2.3.2 純化前后多酚含量 沙棘多酚純化前后多酚含量如圖6所示,純化后的多酚含量顯著高于未純化的多酚(P<0.05),純化前多酚含量為(36.07±2.61) mgEGCG/g,純化后為(62.40±3.20) mgEGCG/g,經(jīng)過純化后的沙棘多酚含量增加了41.20%。

圖6 沙棘多酚純化對沙棘含量的影響Fig.6 Effects of seabuckthorn polyphenol purification on seabuckthorn content

2.4 沙棘多酚抗氧化活性分析

2.4.1 DPPH自由基清除效果 沙棘多酚純化前后對DPPH自由基清除效果如圖7所示,在試驗濃度內(nèi),隨著沙棘多酚濃度的增加,DPPH自由基的清除率不斷增加,當多酚濃度為500 μg/mL時,純化后的多酚清除率達到了92.24%±1.39%,而純化前的多酚的清除率為43.46%±0.98%,純化前后沙棘多酚清除DPPH自由基的IC50值分別為(713.22±5.92)、(142.53±3.65) μg/mL,經(jīng)過純化后的沙棘多酚的DPPH自由基清除率顯著高于純化前(P<0.05),所以純化后的沙棘多酚有較強的DPPH自由基清除率。

圖7 沙棘多酚純化前后對DPPH自由基清除曲線Fig.7 Scavenging curve of DPPH free radicals before and after seabuckthorn polyphenol purification

2.4.2 ABTS+·清除效果 沙棘多酚純化前后對ABTS+自由基清除效果如圖8所示,在試驗濃度內(nèi),隨著沙棘多酚濃度的增加,ABTS+·的清除率不斷增加,當多酚濃度為200 μg/mL時,純化后的清除率達到了94.05%±1.98%,而純化前的多酚的清除率為66.67%±1.39%,純化前后沙棘多酚清除ABTS+·的IC50值分別為(61.92±0.29)、(8.68±1.03) μg/mL,經(jīng)過純化后的沙棘多酚的ABTS+·清除率顯著高于純化前(P<0.05),所以純化后的沙棘多酚有較強的ABTS+·清除率,可能由于大孔樹脂對沙棘多酚起到了富集的作用[25-26],也可能由于多酚的純度的提高增加了沙棘多酚的抗氧化能力[27],也還與酚羥基的數(shù)量和所在的位置有很大的關(guān)系[28]。

圖8 沙棘多酚純化前后對ABTS自由基清除曲線Fig.8 ABTS free radical scavenging curve before and after seabuckthorn polyphenol purification

3 結(jié)論

用響應(yīng)面法考察了超聲輔助溶劑提取法中料液比、乙醇濃度、超聲時間、超聲溫度對沙棘多酚提取量的影響,確定了最佳工藝參數(shù):料液比為1∶24 g/mL,乙醇濃度為49%,超聲時間為52 min,超聲溫度為48 ℃,此條件下沙棘多酚的提取量為8.60 mgEGCG/g,并通過篩選得到AB-8為沙棘多酚合適的純化樹脂,純化后的多酚含量提高了41.20%,純化前清除DPPH·和ABTS+·的IC50值分別為713.22、61.92 μg/mL,純化后清除DPPH·和ABTS+·的IC50值分別為142.53、8.68 μg/mL,經(jīng)過純化后的沙棘多酚抗氧化性明顯升高。利用超聲輔助法提取沙棘多酚,提高了提取效率,同時節(jié)約了成本,經(jīng)過大孔純化后的沙棘多酚中多酚的含量和抗氧化性有了明顯的升高,但對于沙棘多酚的組成有待進一步研究。以上研究內(nèi)容為沙棘多酚進一步的研究與開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。