基于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評價(jià)平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基的生長率

郭 蕓,劉思淵,隋志偉,王梓權(quán),王 斌,朱 文,林 婧,李海濤

(1.山西藥科職業(yè)學(xué)院,山西太原 030031; 2.中國計(jì)量科學(xué)研究院前沿計(jì)量科學(xué)中心,北京 100029; 3.南京市計(jì)量監(jiān)督檢測院,江蘇南京 210049 4.山西省生物研究院有限公司,山西太原 030006)

食品是人類生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ),食品安全問題也越來越受到社會(huì)廣泛的關(guān)注。食源性病原微生物是引起食品安全問題的主要因素之一。目前,我國現(xiàn)行的食品微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為GB4789系列《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)》[1],標(biāo)準(zhǔn)中的檢驗(yàn)方法都是以傳統(tǒng)微生物學(xué)培養(yǎng)為基礎(chǔ)的經(jīng)典檢驗(yàn)方法。培養(yǎng)基是方法中所必須采用的生化試劑,其質(zhì)量直接影響食品微生物檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[2],因此,培養(yǎng)基的質(zhì)量控制十分重要[3]。

菌落總數(shù)是食品微生物檢測中最基本、最常見的檢測項(xiàng)目[4]。平板計(jì)數(shù)瓊脂(plate count agar,PCA)培養(yǎng)基作為檢測菌落總數(shù)所用培養(yǎng)基,也廣泛用于我國的微生物實(shí)驗(yàn)室[5-7]。PCA培養(yǎng)基的質(zhì)量控制包括外觀、溶解性能、pH、水分等物理指標(biāo)及生長率等微生物指標(biāo),其中,生長率是PCA培養(yǎng)基質(zhì)量控制的關(guān)鍵指標(biāo)之一[8]。根據(jù)杜宗緒[8]研究,質(zhì)控菌株在不同品牌的PCA培養(yǎng)基上的生長率存在差異。因此,有效的生長率評價(jià)方法是確保菌落總數(shù)檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的有效手段之一。

根據(jù)GB4789.28-2013《培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[9-10],評價(jià)PCA培養(yǎng)基生長率需要使用質(zhì)控菌株。評價(jià)前,質(zhì)控菌株需要復(fù)蘇和培養(yǎng);評價(jià)時(shí)每個(gè)平板的接種水平為20～200 CFU;此外質(zhì)控菌株還需要接種到參比培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。于瑞莉等[8，11-12]參照標(biāo)準(zhǔn),對不同品牌PCA培養(yǎng)基的生長率進(jìn)行了評價(jià)。然而,現(xiàn)行的評價(jià)方法存在四方面的缺陷。第一,質(zhì)控菌株的復(fù)蘇和培養(yǎng)需要較長的時(shí)間。第二,參比培養(yǎng)基的制備和質(zhì)量控制需要花費(fèi)較多的工作量。第三,質(zhì)控菌株的接種量難以做到精確的控制,實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部難以重復(fù),方法的重復(fù)性有待提高。第四,實(shí)驗(yàn)的地點(diǎn)、方法、人員、器具、材料都有可能對生長率評價(jià)結(jié)果產(chǎn)生影響[13-14]。而根據(jù)《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》[15],微生物樣本的運(yùn)輸存在很大的限制。因此,國標(biāo)方法難以用于不同實(shí)驗(yàn)室同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)基評價(jià),方法的再現(xiàn)性有待提高。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是具有均勻且既定的特性值,用以測量裝置校準(zhǔn)、測量方法評價(jià)或材料賦值的一種材料或物質(zhì)[16-17]。目前,微生物領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在能力驗(yàn)證、儀器校準(zhǔn)、方法評價(jià)等方面有著廣泛的用途[18-19],其在培養(yǎng)基生長率評價(jià)方面也有較大的應(yīng)用前景。

綜上所述,本研究選用大腸桿菌作為評價(jià)菌株,將其制備成量值均勻穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),建立一種使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評價(jià)PCA培養(yǎng)基生長率的方法,并對方法的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)室間再現(xiàn)性進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PCA培養(yǎng)基品牌 北京陸橋、廣東環(huán)凱、青島海博、北京奧博星、北京三藥、上海齊一、北京沃凱、美國BD、英國Oxoid(對9個(gè)品牌隨機(jī)編號(hào),為A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9);大腸桿菌(Escherichiacoli,CICC 10389) 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;磷酸鹽緩沖溶液(PBS,phosphate buffered solution,pH7.2±0.2)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;脫脂奶粉 美國BD公司;海藻糖、蔗糖、谷氨酸鈉、麥芽糊、抗壞血酸鈉 分析純,Sigma公司。

Genesis SQ eL-85型凍干機(jī) SP Scientific公司;BS224S型電子天平、1-14型離心機(jī) 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;HZQ-X100型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;DNP-9272型恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;去離子水 機(jī)默克化工技術(shù)(上海)有限公司;HG-50型高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室先前的制備工藝[18]制備大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。將大腸桿菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。隨后10000×g離心5 min,棄去上清液,菌泥用PBS重懸并稀釋,得到適宜濃度的大腸桿菌菌液。參考先前的配方[18]配制保護(hù)劑,加入大腸桿菌菌液后,將保護(hù)劑分裝至棕色西林瓶中。分裝完畢后,將西林瓶轉(zhuǎn)移至凍干機(jī)內(nèi)進(jìn)行凍干。凍干結(jié)束將樣品壓蓋密封,得到大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測定方法參考GB4789.2-2016《菌落總數(shù)測定》[5],使用PCA培養(yǎng)基,采用平板計(jì)數(shù)方法進(jìn)行菌落總數(shù)測定。

1.2.2 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性和穩(wěn)定性評估 參考ISO[20],對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性和穩(wěn)定性進(jìn)行評估。均勻性評估中,隨機(jī)抽取11個(gè)單元的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行檢測,每瓶樣品重復(fù)檢測3次;穩(wěn)定性評估中,分別在0、7、38和99 d,每次從-20 ℃隨機(jī)選取3個(gè)單元的樣品進(jìn)行檢測。均勻性評估和穩(wěn)定性評估所使用的PCA培養(yǎng)基均為A8品牌。為了保證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值的準(zhǔn)確可靠,評估前需要參考GB 4789.28-2013《培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》[10],對A8品牌PCA培養(yǎng)基進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制,確保大腸桿菌在該培養(yǎng)基上的生長率大于0.9,高于國標(biāo)中生長率大于0.7的要求。

1.2.3 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值 依據(jù)JJF 1343-2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》[21],標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)由10家通過CNAS認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室合作定值[22]。10家實(shí)驗(yàn)室所使用的PCA培養(yǎng)基包含了A1、A8兩個(gè)國產(chǎn)品牌,A4、A5兩個(gè)進(jìn)口品牌,涵蓋了目前市場上常見的培養(yǎng)基品牌。定值前,各家實(shí)驗(yàn)室參考GB 4789.28-2013《培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》[10],對所用PCA培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)量控制,確保大腸桿菌在培養(yǎng)基上的生長率大于0.9。

1.2.4 PCA培養(yǎng)基生長率評價(jià)方法 使用待評價(jià)的PCA培養(yǎng)基,對一個(gè)單元的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行3次測定。根據(jù)式(1),計(jì)算大腸桿菌在該P(yáng)CA培養(yǎng)基上的生長率。

式(1)

式(1)中,PR為待測PCA培養(yǎng)基的生長率;NS為三次使用待測PCA培養(yǎng)基測定大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)結(jié)果的平均值;N0為大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值,為(7.0±1.2)×103CFU/g(見2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值與不確定度)。使用待測PCA培養(yǎng)基測定大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的結(jié)果NS應(yīng)在5.8×103～8.2×103CFU/g之間,因此待測PCA培養(yǎng)基的生長率需滿足0.83≤PR≤1.17。

式(2)

式(4)

式(5)

1.2.7 不同品牌PCA培養(yǎng)基生長率的評價(jià) A1～A9九個(gè)品牌可以涵蓋國內(nèi)幾乎所有微生物實(shí)驗(yàn)室所用品牌。使用9個(gè)品牌的PCA培養(yǎng)基以及GB 4789.28-2013《培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》中的參比培養(yǎng)基(胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基),分別對3個(gè)單元的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行測定。根據(jù)式(1)進(jìn)行計(jì)算大腸桿菌在PCA培養(yǎng)基的生長率;同時(shí)參考國標(biāo)方法計(jì)算其生長率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22.0,MS Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析、圖表的制作等。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性和穩(wěn)定性

隨機(jī)抽取11個(gè)單元的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性評估。結(jié)果(表1)表明,F=0.89

表1 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性Table 1 Uniformity of reference materials of Escherichia coli

式(6)

圖1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值與時(shí)間的關(guān)系Fig.1 The relationship between the value of reference materials and the time

式(7)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值與不確定度

表2 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果Table 2 Valuing of the reference materials of Escherichia coli

式(8)

大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度由3部分組成:第1部分是A類相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(A),來源于10家實(shí)驗(yàn)室合作定值;第2部分是B類相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(B),包括:移液器帶來的不確定度、樣品稀釋因子帶來的不確定度;第3部分是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不均勻性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(bb)和不穩(wěn)定性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(s)。將這幾部分相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成后計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)值的合成不確定度urel(C),及擴(kuò)展不確定度U(k=2,置信概率95%)。結(jié)果(表3)表明,大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值為(7.0±1.2)×103CFU/g。

表3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度評定Table 3 Uncertainty evaluation of the reference materials

2.3 評價(jià)方法的重復(fù)性

每天使用大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),對A8品牌PCA培養(yǎng)基的生長率進(jìn)行3次重復(fù)獨(dú)立的評價(jià),連續(xù)評價(jià)3 d,進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證。結(jié)果如表4所示,A8品牌PCA培養(yǎng)基的生長率的9個(gè)獨(dú)立結(jié)果均滿足0.83≤PR≤1.17。評價(jià)方法的重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.09%。

表4 評價(jià)方法的重復(fù)性Table 4 Repeatability of the evaluation method

2.4 評價(jià)方法的再現(xiàn)性

評價(jià)方法的再現(xiàn)性經(jīng)由6家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行驗(yàn)證。每家實(shí)驗(yàn)室使用3個(gè)單元的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),對A8品牌PCA培養(yǎng)基的生長率進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果如表5所示,測定結(jié)果均滿足0.83≤PR≤1.17。評價(jià)方法的再現(xiàn)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為14.42%。

表5 評價(jià)方法的再現(xiàn)性Table 5 Reproducibility of the evaluation method

2.5 不同品牌PCA培養(yǎng)基生長率

使用大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),對A1～A9九個(gè)品牌PCA培養(yǎng)基的生長率進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果如圖2所示,使用本研究所建方法進(jìn)行評價(jià)時(shí),待測PCA培養(yǎng)基的生長率均滿足0.83≤PR≤1.17的要求;使用國標(biāo)方法進(jìn)行評價(jià)時(shí),待測PCA培養(yǎng)基的生長率均大于0.7。本研究所建立的評價(jià)方法和國標(biāo)方法有很好的相關(guān)性(R2=1)。此外,不同品牌PCA培養(yǎng)基的生長率存在差異。

圖2 九種品牌PCA培養(yǎng)基的生長率Fig.2 The productivity ratio of nine brands of PCA

3 討論

生長率是PCA培養(yǎng)基質(zhì)量控制的關(guān)鍵指標(biāo)之一[25]。因此,建立快速高效的生長率評價(jià)方法是確保菌落總數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確性的有效手段。本研究基于微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),建立了一種新的PCA培養(yǎng)基生長率的評價(jià)方法。

評價(jià)方法所用的大腸桿菌質(zhì)控菌株以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的形式存在,并且標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制過程中采用了特定的培養(yǎng)基策略。第一,研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的用途為評價(jià)PCA培養(yǎng)基的生長率,因此選擇PCA培養(yǎng)基作為測定培養(yǎng)基,而非GB 4789.38-2016《大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)》規(guī)定的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基[26]。第二,合作定值使用了多個(gè)品牌的PCA培養(yǎng)基。第三,均勻性和穩(wěn)定性評估使用了單個(gè)品牌PCA培養(yǎng)基。第四,所用PCA培養(yǎng)基均經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制(參考GB 4789.28-2013《培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》的方法進(jìn)行評價(jià),生長率大于0.9)?；谒玫呐囵B(yǎng)基選擇策略,研制的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不僅均勻穩(wěn)定、易于運(yùn)輸,其標(biāo)準(zhǔn)值還具有PCA培養(yǎng)基依賴性,這些特點(diǎn)可以滿足PCA培養(yǎng)基生長率評價(jià)中對質(zhì)控菌株的要求。

因此,建立的評價(jià)方法可以實(shí)現(xiàn)質(zhì)控菌株接種量的精確控制,解決了現(xiàn)行方法無法實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不同時(shí)間驗(yàn)證的缺陷,具有重復(fù)性;可以實(shí)現(xiàn)多家實(shí)驗(yàn)室間的同時(shí)評價(jià),具有再現(xiàn)性。此外,相比于現(xiàn)行方法(表6),本研究建立的基于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的評價(jià)方法無需使用參比培養(yǎng)基、無需事先培養(yǎng)質(zhì)控菌株、無需控制接種量,使得工作量顯著減少,所需時(shí)間僅為1 d,具有方便快捷的優(yōu)點(diǎn)。微生物實(shí)驗(yàn)室可以實(shí)現(xiàn)快速高效的PCA培養(yǎng)基質(zhì)量控制。

表6 評價(jià)方法與現(xiàn)行方法的比較Table 6 Repeatability of the evaluation method

評價(jià)PCA培養(yǎng)基生長率所用質(zhì)控菌株通常包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等[10-12]。本研究僅對大腸桿菌在PCA培養(yǎng)基上的生長率進(jìn)行了討論,所做工作尚不完善。但本研究對培養(yǎng)基生長率的評價(jià)提出了一個(gè)新的思路,相信隨著微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制水平的不斷進(jìn)步[27-32],本方法所適用的培養(yǎng)基范圍將會(huì)進(jìn)一步提升。

4 結(jié)論

本研究建立了一種基于大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的PCA培養(yǎng)基生長率的評價(jià)方法。評價(jià)方法的重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.09%,再現(xiàn)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為14.42%,具有方便快捷的優(yōu)點(diǎn),有望解決現(xiàn)行生長率評價(jià)方法的缺陷。相信隨著微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究的不斷推進(jìn),培養(yǎng)基的質(zhì)量控制與監(jiān)測會(huì)越來越標(biāo)準(zhǔn)化和精確化,我國微生物領(lǐng)域與公共衛(wèi)生領(lǐng)域的研究水平也會(huì)不斷提高。