菱角梗、菱角殼提取物抑菌活性及其活性成分分析

王洪斌,陳云舒,嚴(yán)守雷,3,*,梅大佐,趙道華,張劍雄,王清章,李 潔,3

(1.武昌工學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)院,湖北武漢 430065; 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430070; 3.湖北省水生蔬菜保鮮加工工程技術(shù)研究中心,湖北武漢 430070; 4.湖北華貴食品有限公司,湖北洪湖 433200; 5.湖北天井湖農(nóng)業(yè)科技服務(wù)有限公司,湖北黃岡 438203)

菱角(TrapabispinosaRoxb.)屬菱科,是一種一年生自由漂浮的植物[1]。原產(chǎn)于歐洲和亞洲的溫和地域,在中國(guó)主要種植于南方,特別是太湖地區(qū)和長(zhǎng)江下游的珠江三角洲[2]。成熟的菱角外果皮堅(jiān)硬,內(nèi)有白色果實(shí),口感甘甜[3-5],菱角中含有淀粉、膳食纖維、必需氨基酸、多酚、多糖等物質(zhì)具有抗癌、抗腫瘤和抗氧化等一系列生物活性[6-8],因此菱角作為一種藥食兩用的果實(shí)一直以來(lái)受到中國(guó)人的青睞。

農(nóng)產(chǎn)品加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量副產(chǎn)物,這些副產(chǎn)物中很多都含有豐富的酚類物質(zhì),并被證明是酚類抗氧化劑的有效來(lái)源[9-10]。菱角殼是菱角加工進(jìn)程中的主要副產(chǎn)物,約占菱角總量的25%[11-12]。各種研究發(fā)現(xiàn),菱角殼提取物具有降血糖[13-14]、保護(hù)肝臟細(xì)胞[15-16]、抗癌[17]等作用,這都?xì)w因于菱角殼中含有生物堿、酚酸類、萜類和甾體、多糖類、黃酮類以及苯丙素類等活性物質(zhì)[18-19]。有研究人員[9]從菱角殼中提取了抑菌活性物質(zhì),發(fā)現(xiàn)其中主要發(fā)揮抑菌作用的成分為沒(méi)食子酸以及阿魏酸,并且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有良好的抑制效果,然而,對(duì)菱角殼提取物的抑菌穩(wěn)定性以及成分鑒定方面的研究較少。同樣作為菱角加工過(guò)程中的副產(chǎn)物,菱角梗中的多糖被證明具有良好的抗氧化活性[20]。但菱角梗引發(fā)科學(xué)界關(guān)注的最神奇之處在于,其可以在炎炎夏日保持多日不腐,而菱角梗提取物的抑菌活性及成分分析情況鮮有報(bào)道。

目前對(duì)于菱角加工生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的大量副產(chǎn)物——菱角梗和菱角殼,只有極少一部分用作中藥材,大部分仍然是作為垃圾丟棄,這造成了極大的資源浪費(fèi)。本實(shí)驗(yàn)選擇菱角梗和菱角殼為材料制備天然抑菌劑,全面系統(tǒng)地研究這些抑菌物質(zhì)的抑菌活性以及成分,為其作為抑菌劑在各種食品保鮮中的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菱角梗和菱角殼 選材于湖北省洪湖市的二角菱;供試微生物金黃色葡萄球菌(AB 99002)、蠟樣芽孢桿菌(AB 2011085)、枯草芽孢桿菌(AB 90008)、大腸桿菌(AB 208270)、銅綠假單胞菌(AB 93066)、釀酒酵母(AY 92003) 由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供;培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 北京路橋技術(shù)有限公司;所用試劑 均為分析純。

SPX-250B型生化培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司;SB-5200DNT超聲波清洗儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;UV-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津有限公司;ME104電子天平 梅特勒-托多利儀器上海有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;RE52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;安捷倫1260高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司;Q-Exactive超高效液相色譜質(zhì)譜儀 賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乙醇提取液的制備 新鮮菱角梗、菱角殼經(jīng)洗凈整理后,在日光下曬干,切分成1 cm長(zhǎng)度,粉碎后,用60目篩進(jìn)行處理,得到的粉末低溫冷藏備用。

稱取一定量的菱角梗、菱角殼粉末,料液比1∶30 (g∶mL),提取劑95%乙醇溶液,水浴溫度50 ℃,在功率500 W、振動(dòng)頻率40 kHz條件下超聲波輔助提取20 min,采用布氏漏斗抽濾,得濾液[21-22]。將上述步驟重復(fù)2～3次,把濾液合并后即可得到乙醇提取液。

1.2.2 各溶劑萃取物的制備 將1.2.1中獲得的提取液,在溫度45 ℃的條件下,使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收全部提取劑,得到乙醇提取物粉末。乙醇提取物粉末用10倍量蒸餾水懸浮,依次用等體積的有機(jī)試劑石油醚、乙酸乙酯、正丁醇[23]萃取,各萃取液在溫度45 ℃的條件下,使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收全部萃取劑,得到各萃取部分粉末。

1.2.3 菌種活化 待測(cè)細(xì)菌于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37 ℃下培養(yǎng)24 h,使用前在相同培養(yǎng)條件下的試管斜面上活化培養(yǎng)24 h,待測(cè)真菌于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA)上于28 ℃下培養(yǎng)48 h,使用前在相同培養(yǎng)條件下在試管斜面上活化培養(yǎng)48 h,抑菌實(shí)驗(yàn)前制備菌懸液濃度為106～107CFU/mL。

1.2.4 抑菌活性檢測(cè) 抑菌實(shí)驗(yàn)采用濾紙片擴(kuò)散法[24-26]。樣品利用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解,采用二倍稀釋法配制系列質(zhì)量濃度(mg/mL)的待測(cè)樣品液。準(zhǔn)確吸取100 μL菌懸液均勻涂布于平皿培養(yǎng)基上,在培養(yǎng)基上等間距平鋪4片已滅菌直徑為6 mm的濾紙片,其中3片滴加10 μL經(jīng)0.22 μm無(wú)菌濾頭處理的樣品液,根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?設(shè)置空白對(duì)照時(shí),另1片滴加等量的DMSO;設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照時(shí),另一片滴加陽(yáng)性對(duì)照液,陽(yáng)性對(duì)照液為10.0 μg/mL的氨芐青霉素(Ampicillin)或1.0 mg/mL的兩性霉素B(Amphotericin B)。細(xì)菌于37 ℃下培養(yǎng)24 h,真菌于28 ℃下培養(yǎng)48 h,采用十字交叉法量取抑菌圈直徑(包括濾紙片直徑)。觀察菌落生長(zhǎng)情況,存在抑菌圈的最低樣品液濃度即為最小抑菌濃度(minimum antimicrobial concentration,MIC)(mg/mL)。菱角梗、菱角殼乙醇提取物的抑菌活性測(cè)定過(guò)程中,設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照;菱角梗、菱角殼各溶劑萃取物的抑菌活性測(cè)定過(guò)程中,設(shè)置空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.5 乙酸乙酯萃取物抑菌穩(wěn)定性檢測(cè) 取三種典型腐敗微生物大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母菌作為供試菌種,考察溫度、pH、紫外光處理對(duì)乙酸乙酯萃取物抑菌穩(wěn)定性的影響,各處理如下:將濃度為50 mg/mL的萃取物溶液,分別在20、40、60、80、100 ℃水浴溫度下處理30 min,檢測(cè)抑菌活性;利用0.1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH,得到pH分別至5、6、7、8、9濃度為50 mg/mL的萃取物溶液,檢測(cè)抑菌活性;使?jié)舛葹?0 mg/mL的萃取物溶液在30 W的紫外燈下分別照射10、20、30、40 min,檢測(cè)抑菌活性。

1.2.6 乙酸乙酯萃取物的純化 根據(jù)抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇活性最強(qiáng)的乙酸乙酯萃取物,采用HP-20大孔樹脂[27]進(jìn)行初步純化,上樣質(zhì)量為10 g,柱體積為590 mL(47 cm×4 cm),采用體積分?jǐn)?shù)0～100%的甲醇溶液進(jìn)行洗脫,得到各洗脫組分。將檢測(cè)得到的洗脫活性組分再上Sephadex LH-20凝膠柱(85 cm×1 cm),依次用不同濃度的甲醇液(體積分?jǐn)?shù)0～100%)洗脫,得到進(jìn)一步的純化品,用于后期的結(jié)構(gòu)鑒定分析。

1.2.7 超高效液質(zhì)聯(lián)用法和高效液相色譜法條件 超高效液質(zhì)聯(lián)用法(ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS)條件:色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流動(dòng)相:A,水;B,甲醇;洗脫程序:0～15 min,0～100% B;15～20 min,100% B;20～25 min,100%～0B;流速300 μL/min,進(jìn)樣量1.0 μL,柱溫40 ℃。質(zhì)譜條件:電噴霧電離(ESI),檢測(cè)離子為負(fù)離子;分辨率70000,掃描范圍m/z 140～2000;鞘氣、輔助氣流速分別為35、15 L/min,電離電壓-3.2 kV,離子參數(shù)管溫度320 ℃,離子源溫度200 ℃,數(shù)據(jù)掃描模式Full MS-ddMS2。

高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)條件參考文獻(xiàn)方法[28-29]:色譜柱,Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:A,乙腈;B,0.1%甲酸水;洗脫程序:0～3 min,2% A;3～30 min,2%～30% A;30～35 min,30%～70% A;35～39 min,70% A;39～41 min,70%～2% A;41～45 min,2% A。流速0.8 mL/min,進(jìn)樣量10 μL,柱溫40 ℃。

1.2.8 UPLC-MS和HPLC分析 菱角梗、菱角殼的乙酸乙酯萃取物經(jīng)UPLC-MS檢測(cè),通過(guò)人工譜圖解析及文獻(xiàn)對(duì)比,確定了樣品中的各種化學(xué)物質(zhì),最后利用HPLC法,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)已知物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次,數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值,采用Origin 8.0進(jìn)行單因素方差分析與圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 菱角梗、菱角殼乙醇提取物的抑菌活性分析

菱角梗、菱角殼乙醇提取物在濃度為50 mg/mL時(shí)對(duì)幾種典型腐敗微生物的生長(zhǎng)有明顯的影響,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菱角梗、菱角殼乙醇提取物的抑菌活性Table 1 Antibacterial activity of water chestnut stem and water chestnut pericarp ethanol extract

由表1可知,菱角殼乙醇提取物的抑菌活性強(qiáng)于菱角梗乙醇提取物,且兩者均表現(xiàn)出一定的抑菌規(guī)律:對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌抑菌能力>對(duì)革蘭氏陰性菌抑菌能力>對(duì)真菌抑菌能力。

2.2 菱角梗、菱角殼各溶劑萃取物的抑菌活性分析

菱角梗、菱角殼中各極性萃取物對(duì)四種典型腐敗菌(金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、釀酒酵母菌)的抑菌活性結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。由圖1和圖2可知,在同一濃度下(50 mg/mL),菱角梗和菱角殼各極性萃取物對(duì)四種典型腐敗菌的抑菌作用趨勢(shì)一致,菱角梗各極性萃取物對(duì)腐敗菌抑菌能力由強(qiáng)到弱為(除大腸桿菌):乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物或石油醚萃取物>水萃取物,菱角殼各極性萃取物對(duì)腐敗菌抑菌能力由強(qiáng)到弱為:乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>石油醚萃取物>水萃取物?？傻贸鼋Y(jié)論:發(fā)揮主要抑菌能力的活性成分主要集中在中等極性的乙酸乙酯萃取物中,因此,在后續(xù)分析及分離鑒定實(shí)驗(yàn)中,重點(diǎn)分析菱角梗的乙酸乙酯萃取物(ethyl acetate extract of water chestnut stem,EAS)和菱角殼的乙酸乙酯萃取物(ethyl acetate extract of water chestnut pericarp,EAP)。

圖1 菱角梗各溶劑萃取物的抑菌活性Fig.1 Antibacterial activity of solvent extracts from water chestnut stem注:s-a:金黃色葡萄球菌;s-b:蠟樣芽孢桿菌;s-c:大腸桿菌;s-d:釀酒酵母菌。

圖2 菱角殼各溶劑萃取物的抑菌活性Fig.2 Antibacterial activity of solvent extracts from water chestnut pericarp注:p-a:金黃色葡萄球菌;p-b:蠟樣芽孢桿菌;p-c:大腸桿菌;p-d:釀酒酵母菌。

2.3 EAS、EAP的最小抑菌濃度

對(duì)EAS、EAP的最小抑菌濃度進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如表2。EAS、EAP對(duì)3種供試菌的抑菌能力由大到小分別為:金黃色葡萄球菌≥大腸桿菌>釀酒酵母菌,該結(jié)果與前述抑菌活性篩選的結(jié)果一致,表明EAS、EAP對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌作用優(yōu)于革蘭氏陰性菌,對(duì)真菌的抑制作用最不明顯。另外,從結(jié)果也可看出,EAP的MIC值明顯低于EAS的,說(shuō)明整體來(lái)看,EAP的抑菌能力強(qiáng)于EAS。

表2 EAS、EAP的最小抑菌濃度Table 2 Minimum antibacterial concentration of ethyl acetate extract from water chestnut stem and water chestnut pericarp

2.4 EAS、EAP的抑菌穩(wěn)定性分析

將EAS、EAP進(jìn)行不同溫度、不同pH和不同時(shí)間的紫外照射處理,對(duì)其抑菌穩(wěn)定性進(jìn)行分析。由圖3(A)可知,在不同溫度處理后,EAS對(duì)三種微生物抑菌能力未出現(xiàn)明顯變化,均表現(xiàn)較好的熱穩(wěn)定性。由圖3(B)可知,經(jīng)過(guò)不同pH調(diào)節(jié)處理,EAS對(duì)大腸桿菌的抑菌性能波動(dòng)較大,具體表現(xiàn)為堿性條件下,抑菌性能明顯下降;而對(duì)金黃色葡萄球菌和釀酒酵母菌而言,抑菌作用較穩(wěn)定。因此,酸性環(huán)境下更有利于EAS抑菌活力的發(fā)揮。由圖3(C)可知,經(jīng)過(guò)不同時(shí)間紫外線照射處理后發(fā)現(xiàn),紫外線照射時(shí)間30 min可明顯促進(jìn)EAS對(duì)大腸桿菌的抑菌作用;當(dāng)照射時(shí)間20 min,EAS對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌能力最強(qiáng);而紫外線照射處理對(duì)釀酒酵母的抑菌作用幾乎沒(méi)有影響?？傮w來(lái)說(shuō),EAS在使用過(guò)程中暴露在紫外線下的時(shí)間不宜超過(guò)30 min。

圖3 各處理?xiàng)l件對(duì)EAS抑菌穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of various treatment conditions on antibacterial stability of ethyl acetate extract of water chestnut stem

由圖4(A)可知,加熱處理對(duì)EAP抑菌能力的影響,呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì),60 ℃下處理30 min時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌能力達(dá)到峰值,溫度高于60 ℃抑菌能力明顯降低;加熱處理對(duì)釀酒酵母的抑菌活性幾乎無(wú)影響,與菱角梗的結(jié)果類似。由圖4(B)可知,pH高于5時(shí),EAP對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性出現(xiàn)較明顯的下降,之后隨著pH的升高,保持較好的抑菌穩(wěn)定性,而對(duì)大腸桿菌和釀酒酵母菌的抑菌能力無(wú)明顯變化,較EAS而言,EAP表現(xiàn)出更好的酸堿穩(wěn)定性。由圖4(C)可知,不同時(shí)間的紫外線照射處理時(shí),EAP對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性有略微的影響,當(dāng)照射時(shí)間超過(guò)20 min后,對(duì)大腸桿菌和釀酒酵母菌的抑菌活性有略微下降。但總體而言紫外線照射對(duì)EAP的抑菌活性影響不大。

圖4 各處理?xiàng)l件對(duì)EAP抑菌穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of various treatment conditions on antibacterial stability of ethyl acetate extract of water chestnut pericarp

2.5 菱角梗、菱角殼抑菌成分化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定

從EAS中鑒定出10種化合物(見(jiàn)表3),在高效液相色譜圖(見(jiàn)圖5A)中的峰歸屬編號(hào)為1～10號(hào),其中化合物1～4、6～10為沒(méi)食子酸及其衍生物,化合物5為黃酮類化合物。EAS中沒(méi)食子酸最為豐富,含量27.22%,其次為1,2,6-三-O-沒(méi)食子酰-β-D-葡萄糖,含量18.65%。有學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn),沒(méi)食子酸會(huì)以劑量依賴性方式引起細(xì)菌內(nèi)膜嚴(yán)重收縮和不規(guī)則形態(tài),從而表現(xiàn)出抑菌作用[30],這可能就是菱角梗抑菌成分可以達(dá)到抑菌效果的原因。

表3 EAS的UPLC-MS和UPLC鑒定結(jié)果Table 3 UPLC-MS and UPLC identification results of ethyl acetate extract of water chestnut stem

圖5 EAS、EAP中抑菌成分的高效液相色譜圖Fig.5 High performance liquid chromatograms of antibacterial components in EAS and EAP 注:A:EAS中抑菌成分的高效液相色譜圖; B:EAP中抑菌成分的高效液相色譜圖。

從EAP中鑒定出9種化合物(見(jiàn)表4),在高效液相色譜圖(見(jiàn)圖5B)中的峰歸屬編號(hào)為11～19,其中化合物11～15與EAS的化合物1、3、4、5、7分別重疊,化合物14、19為類黃酮類化合物,其余為沒(méi)食子酸及其衍生物。EAP中含量最為豐富的為1,2,3,6-四-O-沒(méi)食子酰-β-D-葡萄糖,含量33.93%,其次為槲皮素-3-O-半乳糖苷和1,2,6-三-O-沒(méi)食子酰-β-D-葡萄糖,含量分別12.23%、11.68%。

表4 EAP的UPLC-MS和UPLC鑒定結(jié)果Table 4 UPLC-MS and UPLC identification results of ethyl acetate extract of water chestnut pericarp

3 結(jié)論

EAS和EAP都具有較強(qiáng)的抑菌能力,它們均對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌作用優(yōu)于革蘭氏陰性菌,對(duì)真菌的抑菌作用最弱。通過(guò)比較EAS和EAP的MIC值,EAP的抑菌能力優(yōu)于EAS。在抑菌穩(wěn)定性研究中發(fā)現(xiàn),對(duì)于EAS而言,其具有良好的熱穩(wěn)定性,在酸性條件下抑菌活性較強(qiáng),紫外線中暴露時(shí)間不宜超過(guò)30 min;對(duì)于EAP而言,避免溫度高于60 ℃,酸堿穩(wěn)定性較好,紫外線照射對(duì)抑菌能力的影響較小。利用UPLC-MS和HPLC,從EAS中鑒定出10種化合物,主要為沒(méi)食子酸及其衍生物,其中沒(méi)食子酸含量27.22%,1,2,6-三-O-沒(méi)食子酰-β-D-葡萄糖含量18.65%;從EAP中鑒定出9種化合物,其中最為豐富的為一種沒(méi)食子酸衍生物——1,2,3,6-四-O-沒(méi)食子酰-β-D-葡萄糖,含量33.93%。本研究為EAS和EAP在食品保鮮加工中作為抑菌劑的利用提供了理論支持,具有實(shí)際應(yīng)用的意義。