腎癌環(huán)狀RNA表達(dá)譜和調(diào)控通路分析△

紀(jì)梓良，路瑞靜，陳忠，溫志強(qiáng)，鄭清友#

1南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院泌尿外科，廣東深圳518101

2深圳市寶安區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東深圳518133

腎癌是起源于腎小管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，是第二常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，約占所有惡性腫瘤的3%。2018年全球新診斷的腎癌患者約403 262例，約占2018年所有新診斷惡性腫瘤患者的2.2%；因腎癌死亡患者約175 098例，約占2018年因惡性腫瘤死亡患者的1.8%。盡管臨床上已經(jīng)使用了許多分子靶向藥物，但晚期腎癌患者的預(yù)后仍然很差。因此，迫切需要進(jìn)一步闡明腎癌的發(fā)病機(jī)制，并尋找更有效的腫瘤標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。環(huán)狀 RNA（circular RNA，circRNA）是繼微小 RNA（microRNA，miRNA）及長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）后，RNA家族又一逐漸被人們認(rèn)識的新的內(nèi)源性非編碼RNA。由于circRNA的3'和5'端相連形成共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)，因此，沒有傳統(tǒng)的線性RNA 5'帽結(jié)構(gòu)或3'聚腺苷酸尾巴，這使它們比線性RNA更穩(wěn)定。circRNA富含miRNA反應(yīng)元件，可以充當(dāng)miRNA的海綿，從而減少miRNA對靶mRNA的抑制作用。近年來，研究表明，circRNA參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，如乳腺癌和前列腺癌，但circRNA在腎癌中的作用和功能仍未完全闡明。本研究對3例腎癌患者的腎癌組織及癌旁正常腎組織進(jìn)行高通量測序，檢測腎癌環(huán)狀RNA表達(dá)譜，結(jié)合生物信息學(xué)的方法預(yù)測差異表達(dá)的circRNA在腎癌中的調(diào)控通路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院行手術(shù)切除的腎癌患者3例，分別為44歲男性（腫瘤分期為TNM期）、48歲女性（腫瘤分期為TNM期）、55歲男性（腫瘤分期為TNM期）患者，收集其腎癌組織標(biāo)本及癌旁（距腫瘤邊緣＞5 cm）正常腎組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后病理檢查均證實(shí)為腎透明細(xì)胞癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：有化療、放療或其他腫瘤史。

1.2 RNA提取和高通量測序

使用TRIzol試劑（Life Technologies，美國）從組織中提取總RNA。使用NanoDrop分光光度計(jì)（Isogen Life Science，荷蘭）測量RNA樣品的濃度和純度。若OD值/OD值為1.8～2.1，則RNA樣品的純度合格。由上海天昊生物科技公司（中國）進(jìn)行高通量測序。通過EpicentreRibo-ZerorRNA去除試劑盒（Epicentre Technologies，美國）消除了核糖體RNA之后，使用Illumina平臺的NEBNextUltra定向RNA庫制備試劑盒（NEB，美國）構(gòu)建RNA庫。使用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)（Agilent Technologies，美國）對RNA庫進(jìn)行質(zhì)量控制和定量評估。

1.3 circRNA鑒定及分析

使用生物信息學(xué)程序識別circRNA，包括CIRI2（v2.0.6 版）、CIRCexplorer2（v2.3.3 版）、Mapsplic（ev2.2.1版）、circRNA_finde（rv1.1版）和find_circ（v1.2版）。從GENCODE數(shù)據(jù)庫下載基因注釋文件（gencode.v19版）和參考基因組（GRCh37.p13版）。通過FastQC評估RNA-seq數(shù)據(jù)的質(zhì)量并去除低質(zhì)量讀數(shù)后，獲得純凈的讀數(shù)，并使用指定讀數(shù)比對儀將其定位至參考基因組。將獲得的circRNA與circBase（140 790個circRNA）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，確定是否為新發(fā)現(xiàn)的circRNA。提取每個circRNA的反向剪接連接點(diǎn)讀數(shù)確定circRNA的表達(dá)量，用R軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一及后續(xù)的差異表達(dá)的circRNA分析，倍數(shù)變化大于2且

P

＜0.05的circRNA被認(rèn)為是顯著差異表達(dá)的circRNA。

1.4 circRNA/miRNA/靶基因調(diào)控通路預(yù)測

使用regRNA2.0（http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/）、circRNA Interactome（https://circinteractome.nia.nih.gov/）和starBase（http://starbase.sysu.edu.cn/）預(yù)測circRNA/miRNA/mRNA的調(diào)控通路。使 用 miRNAda（http://www.microrna.org/）和Targetscan（http://www.targetscan.org/vert_72/）預(yù) 測 相關(guān)miRNA的潛在靶基因。使用Cytoscape軟件構(gòu)建circRNA/miRNA/mRNA網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 circRNA在腎癌組織中的表達(dá)譜特征

通過高通量測序鑒定circRNA在腎癌組織及癌旁正常腎組織中的表達(dá)譜，共鑒定出4661個circRNA，其中有1963個為新發(fā)現(xiàn)的circRNA，89.89%（4190/4661）circRNA是外顯子circRNA，其余的circRNA包括4.66%（217/4661）內(nèi)含子circRNA和5.45%（254/4661）基因間circRNA。這些circRNA廣泛分布在整個人類染色體中，其中，2號染色體包含463個circRNA，而Y染色體僅包含10個circRNA（表1）。circRNA的長度為78～181 652 nt，其中位長度為652 nt，43.77%的circRNA長度為200～600 n（t表2）。

表1 circRNA在腎癌組織中的染色體分布情況

表2 circRNA在腎癌組織中的長度分布情況

2.2 腎癌和癌旁正常組織中circRNA的表達(dá)情況

在4661個被發(fā)現(xiàn)的circRNA中，1504個cir-cRNA僅于腎癌組織中被檢測到，1840個circRNA僅于癌旁組織中被檢測到，而1317個circRNA在腎癌及癌旁組織中均有表達(dá)。與癌旁組織相比，腎癌組織中共發(fā)現(xiàn)53個顯著差異表達(dá)的circRNA，包括21個表達(dá)上調(diào)和32個表達(dá)下調(diào)的circRNA（倍數(shù)≥2.0，P＜0.05）。表達(dá)上調(diào)和下調(diào)倍數(shù)最高的各4個circRNA（表3）。

表3 腎癌組織中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)最高的circRNA

2.3 circRNA/miRNA/mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了進(jìn)一步研究腎癌中circRNA的潛在生物學(xué)功能及調(diào)控通路，選取表達(dá)差異倍數(shù)最高的4個下調(diào)和上調(diào)的circRNA（表3），利用生物信息學(xué)程序構(gòu)建一個預(yù)測的circRNA/miRNA/mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖1）。該網(wǎng)絡(luò)結(jié)合了測序結(jié)果中circRNA、mRNA的表達(dá)趨勢，以及miRNA與circRNA、miRNA與mRNA預(yù)測的調(diào)控關(guān)系，其中每個circRNA均能與多個miRNA相結(jié)合。如表達(dá)上調(diào)的hsa_circ_0001947能調(diào)控miRNA-203b-3p、miRNA-7152-3p、miRNA-26b-3p、miRNA-12114，進(jìn)而影響下游鈣黏蛋白1（cadherin 1，CDH1）、卵泡抑素（follistatin，F(xiàn)ST）、腦啡肽受體 B1（Ephrin receptor B1，EPHB1）、OCA2等基因的表達(dá)。

圖1 circRNA/miRNA/mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，人們發(fā)現(xiàn)僅有2%的人類基因組可以翻譯成蛋白質(zhì)，而98%的人類基因組僅能轉(zhuǎn)錄成非編碼RNA。非編碼RNA分為 miRNA、小核RNA、lncRNA和circRNA。circRNA是RNA領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)方法的發(fā)展，circRNA在人類腫瘤中的表達(dá)情況及作用正逐漸被認(rèn)識。作為一種基因調(diào)控RNA，circRNA已牽涉到多層次的基因調(diào)控中，包括替代剪接、miRNA成熟抑制、基因轉(zhuǎn)錄、RNA-蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)編碼能力。miRNA“海綿”功能是circRNA的重要功能。circRNA能夠吸附并調(diào)控靶miRNA，進(jìn)而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，提高靶基因的表達(dá)水平。

越來越多的證據(jù)表明circRNA在腎癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，例如circRNA_001569能夠作為miRNA-192的分子海綿，促進(jìn)結(jié)腸癌的增殖、侵襲。Liang等通過高通量測序發(fā)現(xiàn)circRNA_ABCB10在乳腺癌中呈高表達(dá)，且能夠通過作為miRNA-1271的分子海綿下調(diào)miRNA-1271的表達(dá)，從而發(fā)揮致癌基因的作用。Zhang等發(fā)現(xiàn)，circ-UBAP2能夠通過調(diào)控miRNA-143在骨肉瘤中的表達(dá)從而發(fā)揮促癌作用。而在腎癌中，Xue等發(fā)現(xiàn)circ-AKT3通過改變miRNA-296-3p/E-鈣黏蛋白信號抑制腎癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Xiong等發(fā)現(xiàn)，circRNA-ZNF609通過競爭miRNA-138-5p，進(jìn)而調(diào)節(jié)FOXP4的表達(dá)，從而促進(jìn)腎癌細(xì)胞的增殖和侵襲。Li等發(fā)現(xiàn)circTLK1通過調(diào)控miRNA-136-5p的表達(dá)從而促進(jìn)腎癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

為闡明腎癌中環(huán)狀RNA的表達(dá)譜特征，本研究對3例腎癌患者的腎癌組織及癌旁正常組織進(jìn)行高通量測序，共鑒定出4661個circRNA，其中有1963個為新發(fā)現(xiàn)的circRNA。大多數(shù)circRNA是外顯子circRNA，其余的為內(nèi)含子circRNA和基因間circRNA。這些circRNA廣泛分布在整個人類染色體中，其中，2號染色體包含最多的circRNA（463個），而Y染色體僅包含10個circRNA。circRNA的 長 度 為 78～181 652 nt，中 位 長 度 為 652 nt，43.77%的circRNA長度為200～600 nt。通過比較腎癌及癌旁組織中circRNA的表達(dá)情況，本研究共鑒定出53個在腎癌組織中顯著異常表達(dá)的circRNA，包括21例表達(dá)上調(diào)和32例表達(dá)下調(diào)的circRNA（倍數(shù)≥2.0，

P

＜0.05）。此外，為了進(jìn)一步研究腎癌中circRNA的潛在生物學(xué)功能及調(diào)控通路，本研究選取表達(dá)差異倍數(shù)最高的4個下調(diào)和上調(diào)的circRNA，構(gòu)建了circRNA/miRNA/mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)圖將為后續(xù)腎癌中circRNA-miRNA相互作用通路的研究提供理論基礎(chǔ)，進(jìn)一步了解circRNA在腎癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，并預(yù)測其可能的調(diào)控通路。例如，在預(yù)測圖中，高表達(dá)的hsa_circ_0001947能通過調(diào)控miRNA-203b-3p的表達(dá)，從而影響堿性雙螺旋轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子e41（basic helix-loop-helix family member e41，BHLHE41）基因的表達(dá)。Dasgupta等發(fā)現(xiàn)，miRNA-203b-3p在腎癌中呈明顯低表達(dá)，且能抑制腎癌細(xì)胞的增殖和侵襲。Shen等卻發(fā)現(xiàn)，

BHLHE41

在腎癌組織中呈高表達(dá)，且能促進(jìn)腎癌細(xì)胞的增殖。因此可以推測，在腎癌中高表達(dá)的hsa_circ_0001947能夠海綿狀吸附miRNA-203b-3p，降低其表達(dá)后，解除了miRNA-203b-3p對

BHLHE41

的抑制作用，最終引起

BHLHE41

基因的高表達(dá)，從而促進(jìn)腎癌的發(fā)生發(fā)展。該網(wǎng)絡(luò)圖能為腎癌circRNA的研究提供方向，并篩選可能有意義的circRNA調(diào)控通路。當(dāng)然，僅預(yù)測是不夠的，后期仍需進(jìn)一步的體內(nèi)試驗(yàn)、體外實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

綜上所述，本研究闡明了腎癌中circRNA的表達(dá)特征，在腎癌組織中鑒定到了1963個新發(fā)現(xiàn)的circRNA，并發(fā)現(xiàn)了53個在腎癌組織中顯著異常表達(dá)的RNA。通過生物信息學(xué)方法在腎癌中預(yù)測并構(gòu)建了circRNA/miRNA/mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，為后續(xù)腎癌circRNA相關(guān)研究奠定了理論基礎(chǔ)。后期除了擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證circRNA的表達(dá)外，仍需進(jìn)一步闡明差異表達(dá)的circRNA在腎癌中的生物學(xué)功能和確切的分子機(jī)制。