包裝對羊肉冷藏過程中熱休克蛋白表達及羊肉品質(zhì)的影響

馬惠敏 王振宇 黃彩燕 趙瑩鑫 張德權

摘? 要：為探究不同包裝方式下羊肉冷藏過程中熱休克蛋白27（Hsp27）、熱休克蛋白70（Hsp70）表達量的變化及其與羊肉品質(zhì)間的關系，以宰后1 h羊背最長肌為研究對象，進行托盤、真空、高氧氣調(diào)（O2、CO2體積比75︰25）和低氧氣調(diào)（O2、CO2體積比50︰50）包裝，分析Hsp27和Hsp70表達量、pH值、色澤、剪切力和蒸煮損失率的變化，并進行Hsp27、Hsp70表達量與肉品質(zhì)的相關性分析。結果表明：在貯藏后期（144 h），真空包裝處理組的亮度值（L*）和紅度值（a*）明顯高于托盤包裝和氣調(diào)包裝組，剪切力顯著低于托盤包裝和氣調(diào)包裝組;隨著貯藏時間的延長，不同包裝方式羊肉貯藏過程中Hsp27相對表達量呈先增加后降低趨勢，Hsp70相對表達量呈逐漸上升趨勢;Hsp27相對表達量與pH值、剪切力呈正相關，與L*、a*、b*和蒸煮損失率呈負相關;Hsp70相對表達量與pH值、剪切力呈負相關，與L*、a*、b*和蒸煮損失率呈正相關。本研究證明了Hsp27相對表達量上調(diào)、Hsp70相對表達量下調(diào)可提高羊肉的色澤和嫩度，且真空包裝處理組羊肉保鮮效果最好。因此，Hsp27、Hsp70可作為羊肉的生物標志物，為羊肉品質(zhì)評價提供參考依據(jù)。

關鍵詞：羊肉;品質(zhì);包裝方式;熱休克蛋白27;熱休克蛋白70

Effect of Packaging on Expression of Heat Shock Proteins and Meat Quality in Lambs during Refrigeration Storage

MA Huimin1，2， WANG Zhenyu2， HUANG Caiyan2， ZHAO Yingxin2， ZHANG Dequan1，2，*

（1.School of Food and Wine， Ningxia University， Yinchuan? ?750021， China; 2.Key Laboratory of Agro-Products Quality and Safety Harvest， Storage， Transportation， Management and Control， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Food Science and Technology， China Academy of Agricultural Science， Beijing? ?100193， China）

Abstract： The objective of this study was to explore changes in the expression of heat shock protein 27 （Hsp27） and 70 （Hsp70） in lamb meat packaged in different ways during refrigeration storage and to investigate their relationship with meat quality. At 1 h postmortem， the longissimus dorsi muscles were subjected to air packaging， vacuum packaging， high-oxygen modified atmosphere packaging （O2：CO2 = 75：25， V/V） or low-oxygen modified atmosphere packaging （O2：CO2 = 50：50， V/V）. Changes in the expression of Hsp27 and Hsp70， pH， color， shear force and cooking loss were analyzed during subsequent storage. The results showed that after 144 h of storage， the L* and a* values of the vacuum packaging group were significantly higher than those of the air packaging and modified atmosphere packaging groups， whereas the shear force value was significantly lower than that of the air packaging and modified atmosphere packaging groups. For all packaging groups， the relative expression of Hsp27 increased at the beginning of storage and then decreased， while the relative expression of Hsp70 increased gradually during the whole storage period. The relative expression of Hsp27 was positively correlated with pH value and shear force， but negatively correlated with L*， a* and b* values and cooking loss; the relative expression of Hsp70 was negatively correlated with pH value and shear force， but positively correlated with L*， a* and b* values and cooking loss. This study proved that the up-regulated relative expression of Hsp27 and the down-regulated relative expression of Hsp70 could improve the color and tenderness of lamb meat， and the vacuum packaging group showed the best preservation effect. Therefore， Hsp27 and Hsp70 can be considered as biomarkers for lamb quality evaluation.

Keywords： lamb; quality; packaging method; heat shock protein 27; heat shock protein 70

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210208-033

中圖分類號：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：

引文格式：

馬惠敏， 王振宇， 黃彩燕， 等. 包裝對羊肉冷藏過程中熱休克蛋白表達及羊肉品質(zhì)的影響[J]. 肉類研究， 2021， 35（3）：? . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210208-033.? ? http：//www.rlyj.net.cn

MA Huimin， WANG Zhenyu， HUANG Caiyan， et al. Effect of packaging on expression of heat shock proteins and meat quality in lambs during refrigeration storage[J]. Meat Research， 2021， 35（3）：? . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210208-033.? ? http：//www.rlyj.net.cn

羊肉風味濃郁、肉質(zhì)細嫩、味道鮮美，具有高蛋白質(zhì)、低脂肪、低膽固醇等特點，且富含人體所必需的氨基酸和微量元素，營養(yǎng)價值高，深受消費者喜愛[1-2]。食用品質(zhì)是評價羊肉品質(zhì)優(yōu)劣的關鍵指標之一，會直接影響消費者的購買決定和產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟效益，其主要包括嫩度、色澤、風味和多汁性[3]。因此，羊肉品質(zhì)的精準保持和快速鑒別是肉類產(chǎn)業(yè)需求的重點和肉品科學的研究熱點。

采用新型包裝技術是保證羊肉品質(zhì)的重要手段，也是改善羊肉品質(zhì)的重要突破[4]，其中托盤包裝、真空包裝和氣調(diào)包裝是目前產(chǎn)業(yè)中常用的主要包裝方式[5]。目前羊肉的鑒別方法有近紅外光譜、高光譜、拉曼光譜等技術，這些技術具有能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測、無損耗、樣品無需前處理等優(yōu)點，但其檢測精度較低、穩(wěn)定性差，易受環(huán)境因素的影響[6]。

近年來，隨著分子生物學理論和組學技術的迅速發(fā)展，利用組學技術挖掘表征肉品質(zhì)生物標志物成為肉品領域的研究熱點，這為鑒別、評價和預測肉品質(zhì)開辟了新思路[7-8]。熱休克蛋白（heat shock protein，Hsp）是動物中廣泛存在的一類高度保守蛋白，通常按分子質(zhì)量大小可分為Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60及小分子蛋白（Hsp20、Hsp27、αB-晶體蛋白）[9]。Hsp具有分子伴侶、抑制應激誘導的細胞凋亡和維持肌原纖維結構穩(wěn)定的生物學功能，對肉品質(zhì)具有重要影響。Hwang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Hsp27表達量與豬肉的韌性呈正相關。Kim等[11]研究發(fā)現(xiàn)，Hsp27表達量與牛肉的韌性呈正相關，與亮度值（L*）和紅度值（a*）呈負相關。Carvalho等[12]研究印度諾爾牛發(fā)現(xiàn)，Hsp70表達量增加，牛肉剪切力增大。Zhang Muhan等[13]研究鵝肉發(fā)現(xiàn)，Hsp70在低滴水損失組有較高的表達，并被認為是肉中持水力的潛在預測因子。Luca等[14]研究表明，隨著Hsp70表達量的升高，豬肉滴水損失降低。但目前有關Hsp27、Hsp70在羊肉中的研究報道還很少，Hsp27、Hsp70能否作為表征羊肉品質(zhì)的潛在生物標志物有待進一步研究，不同包裝方式是否會影響宰后羊肉冷藏過程中Hsp27、Hsp70表達量變化尚不清楚。

本研究以羊背最長肌為研究對象，探究不同包裝方式下羊肉冷藏過程中Hsp27、Hsp70相對表達量的變化及其與肉品質(zhì)間的關系，明確包裝方式對Hsp27、Hsp70的影響規(guī)律，為羊肉品質(zhì)評價和鑒別提供參考依據(jù)。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料與試劑

羊肉采集于內(nèi)蒙古美洋洋食品有限公司。選取20 只6～8 月齡、飼養(yǎng)環(huán)境一致的小尾寒羊公羊。Hsp27小鼠單克隆抗體G3.1（ab2790）、Hsp70小鼠單克隆抗體3A3（ab5439）、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（ab205719）? ?英國Abcam公司;GAPDH鼠單克隆抗體（AB-M-M001）? ?杭州賢至生物科技有限公司。

1.2? ?儀器與設備

電泳設備、轉(zhuǎn)膜設備、ChemiDocTM MP凝膠成像儀? ?美國Bio-Rad公司;CM-600D色差計? ?日本柯尼卡-美能達（中國）有限公司;數(shù)顯式肌肉嫩度儀? ?東北農(nóng)業(yè)大學工程學院;Testo 205便攜式pH計? ?德國德圖公司;RDW550P臥式氣調(diào)包裝機（全自動）? ?成都市羅斯波爾機械有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋? ?江蘇省榮華儀器制造有限公司。

1.3? ?方法

1.3.1? ?樣品處理及實驗設計

采用完全隨機法將20 只小尾寒羊公羊分成4 組，每組5 只，分別用于托盤包裝、真空包裝、高氧氣調(diào)包裝（O2、CO2體積比75︰25）和低氧氣調(diào)包裝（O2、CO2體積比50︰50）。托盤包裝采用聚丙烯托盤，真空包裝袋厚度150 μm，透氧性4 cm3/（m2·d），透濕性4.5 g/（m2·d），氣調(diào)包裝膜厚度100 μm，透氧性<2 cm3/（m2·d），透濕性<5 g/（m2·d）。小尾寒羊屠宰后30 min內(nèi)取雙側(cè)背最長肌，置于4 ℃冷庫15 min內(nèi)剔除表面筋膜及結締組織，每組樣品分成大小相等的6 份，在宰后1 h對樣品進行包裝，隨后將包裝的樣品置于4 ℃冰箱中冷藏，分別在冷藏1、6、12、24、72、144 h時測定pH值、肉色、蒸煮損失率、剪切力并留樣。留樣樣品于凍存管中液氮速凍后置于干冰中帶回實驗室，用于Hsp27和Hsp70相對表達量測定。

1.3.2? ?pH值的測定

參考Szerman等[15]方法，使用便攜式pH計測定各時間點肉樣的pH值，將探頭插入羊肉中，深度約2 cm，選取3 個不同位置連續(xù)測定3 次，結果取平均值。

1.3.3? ?肉色的測定

參考李蒙[16]方法，用CM-600D色差計測定L*、a*、黃度值（b*），色差計在使用前用標準白瓷板和標準黑板在室溫下進行校正，每個樣品表面選取4 個位點進行測定，結果取平均值。

1.3.4? ?剪切力的測定

參考李桂霞等[17]的方法，稍作修改。將肉樣置于蒸煮袋內(nèi)，抽去袋內(nèi)空氣，使肉塊表面緊貼蒸煮袋，密封袋口，放入71 ℃水浴鍋中30 min后將肉塊取出，冷卻至室溫并放入4 ℃冰箱過夜。將肉樣沿著肌纖維方向切成1.0 cm×1.0 cm×1.5 cm的小塊。采用數(shù)顯式肌肉嫩度儀對樣品進行測定，每個樣品重復測定7 次，結果取平均值。

1.3.5? ?蒸煮損失率的測定

參考肖雄等[18]的方法，稍作修改。稱取肉樣，質(zhì)量記為m1（g），隨后將肉樣放置于蒸煮袋內(nèi)并抽去袋內(nèi)空氣，使肉塊表面緊貼蒸煮袋，密封袋口，放入71 ℃水浴鍋中30 min后將肉塊取出，冷卻至室溫用定性濾紙擦去表面水分后稱質(zhì)量，記為m2（g）。蒸煮損失率按照下式計算。

1.3.6? ?Hsp免疫印跡

肌漿蛋白的提?。簠⒖糎uang[19]、Oh[20]等的方法并稍作修改，稱取1 g冷凍的肉樣，加入6 mL預冷的緩沖液（0.01 mol/L Tris、0.01 mol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、pH 8.3、蛋白酶抑制劑1 片（配制50 mL））冰浴勻漿，然后在4 ℃條件下10 000×g離心30 min，上清液即為肌漿蛋白溶液。肌漿蛋白溶液用超純水稀釋20 倍后，用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，將肌漿蛋白質(zhì)量濃度調(diào)至8 mg/mL，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

免疫印跡：參考Shi[21]、Xing[22]、Xing Tong[23]等的方法并稍作修改。提取的肌漿蛋白樣品調(diào)整質(zhì)量濃度為8 mg/mL，按體積比1︰1加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（10 g/100 mL SDS、10 mL甘油、0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、1 mol/L DTT、1 mol/L溴酚藍），沸水浴中加熱10 min，蛋白上樣量為10 L。SDS-PAGE電泳中Hsp27和Hsp70采用12%的分離膠和4%的濃縮膠，電泳初始電壓為70 V，待蛋白進入分離膠后將電壓調(diào)整為110 V，待蛋白到達凝膠底部時停止電泳。電泳結束后采用濕法將凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移在硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜上，轉(zhuǎn)膜結束后用TBST緩沖液（137 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris、體積分數(shù)0.1% 吐溫-20、pH 7.6）清洗NC膜3 次，每次10 min。清洗后將條帶置于含5 g/100 mL脫脂乳粉的TBST溶液中室溫封閉1 h，加入一抗（Hsp27小鼠單克隆抗體（稀釋比1︰200）、Hsp70小鼠單克隆抗體（稀釋比1︰1 000）和GAPDH鼠單克隆抗體（稀釋比1︰500）），4 ℃緩慢搖動孵育過夜，隨后用TBST溶液漂洗NC膜3 次，每次10 min。漂洗后加入二抗（稀釋比1︰2 000），室溫緩慢搖動孵育2 h;孵育結束后用TBST溶液漂洗NC膜3 次，加入電化學發(fā)光顯色液浸泡5 min，凝膠成像儀拍照。采用Quantity One軟件分析條帶灰度值。

1.4? ?數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)分析與作圖。利用IBM SPSS Statistics 25.0軟件進行差異顯著性分析，采用鄧肯多重比較法，P<0.05即為差異顯著，所得結果以平均值±標準差的形式表示。

2? ?結果與分析

2.1? ?不同包裝方式處理羊肉冷藏過程中Hsp27的相對表達量變化

由圖1可知，隨著貯藏時間的延長，不同包裝方式處理下Hsp27條帶灰度值減小，表明Hsp27發(fā)生降解，尤其是在宰后72、144 h，Hsp27的降解程度明顯高于宰后初期。

小寫字母不同，表示同一包裝方式、不同貯藏時間差異顯著（P<0.05）;大寫字母不同，表示同一貯藏時間、不同包裝方式差異顯著（P<0.05）。圖4同。

由圖2可知，隨著宰后貯藏時間延長，不同包裝方式羊肉冷藏過程中Hsp27相對表達量呈先增加后降低趨勢，其中真空包裝和低氧氣調(diào)包裝羊肉Hsp27相對表達量在宰后6 h達到峰值，托盤包裝和高氧氣調(diào)包裝在宰后12 h達到峰值。宰后初期羊剛被屠宰放血，處于缺氧狀態(tài)，外界氧氣和營養(yǎng)供應的終止導致細胞產(chǎn)生不可避免的凋亡，Hsp27作為一種應激蛋白立即對細胞凋亡產(chǎn)生應激反應，以維持細胞的平衡。李捷等[24]的研究結果表明，Hsp27表達量總體呈降低趨勢，這與本研究結果一致。宰后貯藏后期Hsp27相對表達量下降，原因可能是Hsp27作為分子伴侶，結合受損的蛋白質(zhì)以及錯誤折疊的蛋白質(zhì)保護細胞內(nèi)蛋白，防止不可逆的損傷[25]，最終導致機體Hsp27相對表達量降低。

2.2? ?不同包裝方式處理羊肉冷藏過程中Hsp70的相對表達量變化

由圖3可知，隨貯藏時間的延長，不同包裝方式羊肉Hsp70條帶灰度值逐漸增加，尤其是在宰后144 h，Hsp70的條帶明顯深于宰后初期。

由圖4可知，不同包裝方式羊肉冷藏過程中Hsp70相對表達量呈逐漸上升趨勢，在144 h達到峰值。在冷藏后期的24、72、144 h，高氧氣調(diào)包裝組Hsp70相對表達量明顯高于托盤包裝、真空包裝和低氧氣調(diào)包裝組。4 種包裝方式羊肉冷藏過程中Hsp70相對表達量逐漸上升，可能是由于Hsp70可以抑制細胞凋亡進程，保護組織免受氧化應激損傷[26-27]。冷藏24～144 h，高氧氣調(diào)包裝組Hsp70相對表達量明顯高于其他3 個處理組，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是高氧環(huán)境可能會引起肉品發(fā)生氧化應激反應，從而促使Hsp70表達量上調(diào)，來保護機體免受氧化損傷。楊嘯吟等[28]研究結果表明，高氧環(huán)境可能會促使抗氧化蛋白2、Hsp及DJ-1蛋白的表達量上調(diào)，以抵御肉品的氧化應激反應，這與本研究結果一致。

2.3? ?不同包裝方式處理羊肉冷藏過程中品質(zhì)的變化

由表1可知，隨著貯藏時間的延長，4 種不同包裝方式羊肉pH值逐漸下降，從宰后1 h的6.86顯著下降到宰后72 h的5.8左右（P<0.05），72 h后趨于穩(wěn)定。a*和L*是衡量肉類新鮮度最重要的顏色參數(shù)，真空包裝處理組貯藏至144 h的L*和a*明顯高于托盤包裝和氣調(diào)包裝處理組，說明真空包裝處理組羊肉的L*和a*最好，在貯藏至144 h仍能保持較好的色澤，本研究結果與董玉影[29]、Maqsood[30]等研究結果一致。隨著貯藏時間的延長，不同包裝方式處理組b*呈上升趨勢，但是在不同包裝之間無顯著差異。

隨著貯藏時間的延長，不同包裝方式羊肉剪切力呈先升高后降低的趨勢。宰后后期24～144 h，高氧氣調(diào)包裝組剪切力顯著高于托盤包裝、低氧氣調(diào)包裝和真空包裝組（P<0.05），說明真空包裝處理組嫩度最好，原因可能是Hsp27表達量的下調(diào)增加了肌動蛋白的降解，肌肉中肌原纖維完整性衰減和內(nèi)部Z線和I帶連接處被破壞，從而導致肌原纖維超微結構發(fā)生變化，肉嫩度提高[31]。在冷藏后期72～144 h，真空包裝處理組剪切力明顯低于其他3 個處理組（P<0.05），在此期間Hsp70相對表達量也明顯低于其他3 個處理組，推測真空包裝處理組肉嫩度降低可能與Hsp70表達量有關。

持水能力是肉類加工的重要性能，羊肉蒸煮損失率是衡量肌肉持水能力的重要指標。隨著貯藏時間的延長，除宰后1 h外不同包裝方式羊肉蒸煮損失率總體呈先增加后降低的趨勢，表明不同包裝方式羊肉的持水能力隨著時間的延長而降低;宰后6 h和12 h，真空包裝處理組蒸煮損失率低于托盤包裝、高氧氣調(diào)包裝和低氧氣調(diào)包裝，說明真空包裝處理組羊肉持水能力較好。但是蒸煮損失率在不同包裝之間差異不顯著，證實了不同包裝對蒸煮損失率沒有顯著影響，本研究結果與朱學伸等[32]研究一致。在宰后6 h，真空包裝處理組蒸煮損失率明顯低于托盤包裝和氣調(diào)包裝處理組（P<0.05），此時真空包裝處理組Hsp27、Hsp70相對表達量顯著高于其他3 個處理組，原因可能是Hsp27、Hsp70表達量上調(diào)抑制了肌肉細胞凋亡，減少膜破裂和細胞內(nèi)水分流失，使肉的保水能力增強。

2.4? ?不同包裝方式下羊肉Hsp27、Hsp70表達量與pH值、肉色、剪切力和蒸煮損失率相關性分析

圖中左下方數(shù)字表示各指標之間的相關系數(shù)，右上方圓圈表示各指標間的相關強度，圓圈越大表示相關性越強，藍色表示負相關，紅色表示正相關;*.相關性顯著（P<0.05），**.相關性極顯著（P<0.01）。

對不同包裝方式羊肉冷藏1～144 h Hsp27和Hsp70相對表達量及品質(zhì)進行相關性分析，可進一步明確這2 種潛在標志物與各品質(zhì)的相關程度。由圖5可知：Hsp27相對表達量與pH值呈顯著正相關（P<0.05），相關系數(shù)為0.477，與剪切力呈正相關，與L*、b*和蒸煮損失率呈極顯著負相關（P<0.01），相關系數(shù)分別為-0.632、-0.677和-0.723，與a*呈顯著負相關（P<0.05），相關系數(shù)為-0.486;Hsp70相對表達量與pH值呈極顯著負相關（P<0.01），相關系數(shù)為-0.565，與剪切力呈負相關，與L*、a*、b*呈極顯著正相關（P<0.01），相關系數(shù)分別為0.608、0.592和0.804;與蒸煮損失率呈顯著正相關（P<0.05），相關系數(shù)為0.436。

本研究中Hsp27相對表達量與pH值呈顯著正相關與其他研究基本一致[24，33]，與肉色（L*、b*）呈極顯著負相關，與a*呈顯著負相關與Kim[11]、張淼[34]等的研究結果一致。蛋白質(zhì)組學的研究結果中關于Hsp27與嫩度的關系并不一致，其中Ding Zhenjiang等[35]研究發(fā)現(xiàn)，Hsp27表達量與牛肉的韌性呈負相關，Huang Honggang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，豬肉中Hsp27表達量與韌性呈正相關，本研究結果與Huang Honggang等[19]的研究結果一致。本研究中Hsp70相對表達量與pH值呈極顯著負相關，與L*、a*、b*呈極顯著正相關，這與Gagaoua等[7]研究結果一致。Hsp70相對表達量與剪切力呈負相關，Guillemin等[27]研究表明，Hsp70相對表達量與牛肉嫩度呈負相關，這與本研究結果一致。

3? ?結? 論

隨著貯藏時間的延長，不同包裝方式羊肉的pH值逐漸降低;在貯藏后期（144 h），真空包裝處理組的L*和a*明顯高于托盤包裝和氣調(diào)包裝，剪切力顯著低于托盤包裝和氣調(diào)包裝。隨著貯藏時間的延長，不同包裝方式羊肉貯藏過程中Hsp27相對表達量呈先增加后降低趨勢，Hsp70相對表達量呈逐漸上升趨勢。Hsp27和Hsp70與羊肉品質(zhì)的相關關系如下：Hsp27相對表達量與pH值、剪切力呈正相關，與L*、a*、b*和蒸煮損失率呈負相關;Hsp70相對表達量與pH值、剪切力呈負相關，與L*、a*、b*和蒸煮損失率呈正相關。本研究表明，Hsp27相對表達量上調(diào)、Hsp70相對表達量下調(diào)可提高羊肉的色澤和嫩度，且真空包裝處理組羊肉保鮮效果最好。

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