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    椰漿中椰子蛋白的提取、分離和鑒定

    2021-06-15 13:25:56林塬吳毓煒王焱吉哲蓉樂學(xué)義
    熱帶作物學(xué)報 2021年4期
    關(guān)鍵詞:椰漿椰子條帶

    林塬 吳毓煒 王焱 吉哲蓉 樂學(xué)義

    摘? 要:為了更好地了解市售椰漿中椰子蛋白質(zhì)量狀況,本研究以市售的10種椰漿為樣品,采用反向高效液相色譜(reversed-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)及十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium laurylsulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)對提取蛋白進(jìn)行分析,采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF/TOF-MS)對蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明:椰漿RP-HPLC約在10.4 min和11.9 min分別出現(xiàn)1個色譜峰,大多數(shù)樣品峰面積大小都與蛋白標(biāo)簽含量一致,SDS-PAGE條帶數(shù)量和顏色的深淺與RP-HPLC得到的峰面積結(jié)果一致,個別樣品標(biāo)簽含量高,SDS-PAGE能分離出的蛋白條帶數(shù)量也較多,但RP-HPLC的椰子蛋白峰面積小,經(jīng)MALDI-TOF/TOF-MS鑒定,部分條帶沒有鑒定出椰子有關(guān)的肽段或蛋白。研究結(jié)果為椰漿蛋白的食品安全與質(zhì)量控制提供了方法參考和示范。

    關(guān)鍵詞:椰漿;蛋白分析;鑒定;RP-HPLC;SDS-PAGE;MALDI-TOF/TOF-MS

    中圖分類號:S667.4? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

    Extraction, Isolation and Identification of Coconut Protein from Coconut Milk

    LIN Yuan1, 2, WU Yuwei2, WANG Yan2, JI Zherong2, LE Xueyi1*

    1. Department of Applied Chemistry, South China Agricultural University, Guangzhou, Guangdong 510642, China; 2. Products Quality Supervision and Testing Institute of Hainan Province / National Quality Supervision and Inspection Center for Tropical Agriculture Products, Haikou, Hainan 570203, China

    Abstract: In order to better understand the quality of coconut protein in commercially available coconut milk, 10 types of coconut milk were used as the samples bought from the market. Reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and sodium laurylsulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) were used to analyze the extracted proteins, identified through matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF-MS). There were two peaks in RP-HPLC of coconut milk at 10.4 min and 11.9 min, the peak area of most samples were consistent with the protein label content. The number of SDS-PAGE bands and intensity were consistent with the peak area results obtained by RP-HPLC. Some samples had high label content, and SDS-PAGE could separate more protein bands, but the peak area of coconut protein from RP-HPLC was small. The protein bands were identified with MALDI-TOF/TOF-MS and no coconut-related peptides or proteins were identified. This method could be used for the isolation and identification of coconut protein in coconut milk.

    Keywords: coconut milk; protein analysis; identification; RP-HPLC; SDS-PAGE; MALDI-TOF/TOF-MS

    DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.029

    椰子(Cocos nucifera L.)是棕櫚科(Palmae)椰子屬(Cocos)植物[1],是世界上重要的果樹之一[2]。椰肉富含蛋白,易于被人體吸收,有較好的保健效果,如具有抗糖尿病活性[3]、抗氧化活性[4]和降低血脂[5]等作用,近年來引起了人們的興趣[6]。椰子肉中蛋白質(zhì)的種類包括球蛋白、谷蛋白、白蛋白和醇溶蛋白等[7]。椰子全身是寶,但其可食部分比例較小、加工麻煩,不宜直接將其作為生產(chǎn)原料。椰子果肉被加工成純椰漿,在保持其營養(yǎng)物質(zhì)和天然風(fēng)味的同時解決了運(yùn)輸麻煩的問題,降低貯存費(fèi)用,便于廣泛使用。

    椰漿目前的研究主要集中在揮發(fā)性風(fēng)味成分及脂肪酸的類型和含量[8]、濃縮方法(常壓、真空)對椰漿各指標(biāo)的影響[9]、真空濃縮椰漿的護(hù)色工藝[10]和真空濃縮椰漿形成穩(wěn)定乳狀液的乳化劑配比[11]等。椰子中蛋白質(zhì)的分離和鑒定研究很少,1930年美國科學(xué)家從椰子蛋白質(zhì)中分離出一種分子量約208 kDa的球蛋白,并命名為Cocosin[12]。Hagenmaier等[13]采用Sephadex G-200層析方法對椰子蛋白進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)3個蛋白質(zhì)峰。Huang等[14]采用雙向電泳(2-DE)技術(shù)對椰子蛋白進(jìn)行了分析,通過MS/MS鑒定出7S球蛋白、一種類似于谷蛋白和受體樣蛋白激酶的蛋白質(zhì)。椰子蛋白含有人體所需的氨基酸,通過椰子蛋白的分析方法還可分離出椰子蛋白并測定其氨基酸含量[15-16]。

    椰子蛋白的含量與其品種、生長環(huán)境等有關(guān),在生產(chǎn)椰漿的過程中為保證椰漿中蛋白質(zhì)的含量,可能會加入其他蛋白質(zhì)。椰漿的內(nèi)控要求中,蛋白質(zhì)含量是一項(xiàng)重要的指標(biāo),目前用于測定蛋白質(zhì)的方法是GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法,該方法是一種測定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法,具有廣泛性、操作相對簡單、實(shí)驗(yàn)成本低和準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn),缺點(diǎn)是測定結(jié)果為總有機(jī)氮,只要是含氮的物質(zhì),都被當(dāng)成蛋白質(zhì)計(jì)入結(jié)果,不能準(zhǔn)確評定椰漿質(zhì)量。本研究以反應(yīng)后的椰子蛋白的RP-HPLC、SDS-PAGE以及MALDI-TOF MS的鑒定結(jié)果為評價指標(biāo),研究椰漿蛋白的定性分析方法,旨在為椰漿蛋白的食品安全與質(zhì)量控制提供方法參考和示范。

    1? 材料與方法

    1.1? 材料

    1.1.1? 材料與試劑? 供試椰子為海南綠色高種(Cocos nucifera L., Hainan Tall, green fruit),老椰子,市售10種椰漿樣品信息見表1。

    乙腈和三氟乙酸,色譜純,美國Tedia公司;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、三羥甲基氨基甲烷、氨基乙酸、十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺、過硫酸銨及溴酚藍(lán),均為分析純,廣州化學(xué)試劑廠;考馬斯藍(lán)(分析純),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;水為超純水。

    蛋白提取液:取磷酸氫二鉀5.5 g與磷酸二氫鉀0.41 g,加超純水溶解并將pH調(diào)到8.0,最后定容至1000 mL為堿提取液。

    1.1.2? 儀器與設(shè)備? Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)、Sigma 3-18K冷凍高速離心機(jī)(德國Sigma公司)、Mini-protea Tetra system蛋白電泳儀(美國Bio-rad公司)、超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)、S20K型pH計(jì)(瑞士梅特勒-托利公司)、5800MALDI基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(美國AB SCIEX公司)、ZM200高速粉碎機(jī)(德國Retsch公司)。

    1.2? 方法

    1.2.1? 樣品制備及提取? 鮮榨椰子漿:椰子去掉椰衣后取出椰子肉,去褐色種皮,用粉碎機(jī)粉碎成椰子肉泥(粉碎機(jī)上安裝1 mm的篩),將殘?jiān)^濾后取濾液為椰漿??偟鞍椎奶崛⒄瘴墨I(xiàn)[17]中的方法,略有改動。稱取椰漿4 g,加入蛋白提取液40 mL,4 ℃水浴中磁力攪拌提取0.5 h后,4 ℃、6000 r/min離心15 min,去掉上層油脂及底層沉淀,取中間層澄清液,將澄清液pH調(diào)至蛋白質(zhì)等電點(diǎn)即pH 3.5,4 ℃、6000 r/min離心15 min,棄掉上清液,用超純水清洗沉淀3次,加入5 mL提取液溶解蛋白,4 ℃冷藏備用。

    1.2.2? 液相色譜分離條件? 流動相A為含有體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸的乙腈溶液,流動相B為含有體積分?jǐn)?shù)0.07%三氟乙酸的超純水,色譜柱為Agilent PLRP-S(300A,8 μm,250 mm×4.6 mm),檢測波長214 nm,流速為1 mL/min,進(jìn)樣體積10 μL,柱溫24 ℃。經(jīng)過反復(fù)多次的試驗(yàn),最終采用線性梯度洗脫程序?yàn)椋洪_始1~2 min,34% A;2~4 min,34%~37% A;4~8 min,37%~42% A;8~10 min,42%~45% A;10~11 min,45%~42% A;11~13 min,42%~38% A;13~15 min,38%~34% A。此條件下,色譜峰峰形好且得到有效的分離。

    1.2.3? SDS-PAGE蛋白電泳條件? 椰子蛋白的SDS-PAGE分析參照文獻(xiàn)[18]的方法,SDS-PAGE分離膠的濃度為12.5%,濃縮膠的濃度為4%。在進(jìn)行電泳試驗(yàn)時先恒定功率在5 W/膠,約1 h后蛋白條帶從濃縮膠進(jìn)入到分離膠,再將功率恒定在10 W/膠直至電泳結(jié)束。用考馬斯亮藍(lán)G-250染色,先用10%乙酸脫色,再用5%乙酸脫色,最后用水去除凝膠上的染色背景,然后掃描凝膠。

    1.2.4? MALDI-TOF/TOF-MS條件? MALDI- TOF/TOF-MS分析參照文獻(xiàn)[19]中的方法,從凝膠上挖取對應(yīng)的蛋白條帶,然后加100 μL超純水洗15 min,去除水,用移液槍頭將蛋白條帶搗碎,利于后期酶與蛋白充分接觸,提高酶切效率。加入100 μL脫色液—[50% 100 mmol/L碳酸銨(NH4)2CO3,50% 乙腈ACN],置于搖床振蕩30 min。加入100 μL 100% ACN,搖床振蕩脫水10 min,重復(fù)該步驟2次至膠粒變?yōu)榧儼咨?。開蓋,除去ACN,置超凈臺中干燥,直至ACN完全揮發(fā),小心將離心管蓋扣好,防止干膠粒蹦出。根據(jù)膠粒大小加入3~5 μL胰酶(20 ng/μL酶液),以完全覆蓋膠粒為佳,蓋好置于冰浴約1 h,使膠粒充分吸收酶液。根據(jù)膠粒大小,加入5~8 μL胰酶緩沖液,以覆蓋膠粒為佳,在PCR儀(熱蓋設(shè)置為100 ℃左右,防止樣品蒸發(fā))37 ℃酶解16 h。酶解結(jié)束后先加入0.8 μL酶解液到質(zhì)譜靶上,近干后加入0.8 μL酶解液,待其近干再加入0.8 μL基質(zhì)(濃度5 mg/mL),待其完全干后即可進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

    將所得到的質(zhì)譜信息通過MASCOT 2.2軟件以植物界的分類法(綠色植物,包括6 686 534個序列)為基礎(chǔ),在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(發(fā)布版本NCBI prot 20180429,包括152 462 470個序列和55 858 910 152個殘基)進(jìn)行檢索。MASCOT軟件搜索參數(shù)如下,搜索類型:MS/MS離子搜索;酶:胰蛋白酶/ P;固定修飾:脲基(C);可變修飾:氧化(M);質(zhì)量值:同位素;蛋白質(zhì)量:不受限制;肽質(zhì)量公差:±300×10?6;碎片質(zhì)量公差:±0.3 Da;最大錯位:1;查詢數(shù)量:158。

    2? 結(jié)果與分析

    2.1? 椰漿的液相色譜分析

    椰漿提取蛋白經(jīng)液相色譜分析,在10.3 min和11.9 min分別有1個峰。此次分析的椰漿樣品分別來自中國海南、泰國、馬來西亞、印度尼西亞,椰漿中蛋白含量范圍為0.9~3.3 g/100 mL(表1)。從圖1可知,除5號和6號樣品外,其余椰漿蛋白的2個色譜峰面積之和與產(chǎn)品標(biāo)識的蛋白含量基本呈正相關(guān);1號樣品的蛋白質(zhì)含量最大(2.0 g/100 mL),色譜峰面積之和也是最大。

    5號和6號樣品的液相色譜圖見圖2,椰漿蛋白液相色譜峰面積之和表現(xiàn)出與產(chǎn)品標(biāo)識的蛋白含量結(jié)果不一致。其中,6號樣品的蛋白質(zhì)含量為3.3 g/100 mL,2個色譜峰的峰面積都與3號樣(蛋白含量為0.9 g/100 mL)的峰面積相差不大。結(jié)果表明,除去實(shí)驗(yàn)帶來的誤差,5號和6號樣品中的蛋白質(zhì)含量與標(biāo)簽中蛋白含量不符,標(biāo)簽的蛋白含量可能由凱氏定氮法測得,但這種氮并非椰漿蛋白質(zhì)中的氮。

    11號樣品為海南本地企業(yè)送檢樣,與鮮榨椰子漿(12號樣品)液相色譜圖結(jié)果最為相近(圖2C、圖2D)。3次平行樣的平均峰面積詳見表2。圖2A中5號椰漿液相色譜峰的保留時間分別為10.479 min和12.024 min,與圖2D中鮮榨椰子漿提取的蛋白溶液色譜圖峰型相似,但低濃度椰漿的2個色譜峰的出峰時間都推后了約0.5 min,如果以第1個峰為分子、第2個峰為分母,計(jì)算相對保留時間,獲得椰漿的相對保留時間為1.14 min,鮮榨椰子汁的相對保留時間為1.15 min,相對保留時間差為0.01 min,這可能是由于蛋白質(zhì)的濃度不同、椰漿的處理工藝不同或是在椰漿生產(chǎn)過程中加入了不同添加劑而導(dǎo)致的結(jié)果。

    2.2? 椰漿電泳圖

    椰漿的電泳圖條帶少且顏色淺。在中國海南和泰國產(chǎn)的椰漿樣品1~7號中,除6號樣品外,其他樣品的電泳圖都較為相似,6號樣品因蛋白濃度高,電泳圖條帶比其他樣品的條帶清楚,且6號電泳圖在19~26 kDa之間比其他椰漿多了1條條帶(圖3)。電泳結(jié)果表明,6號樣品中含有

    一定量的蛋白質(zhì),與標(biāo)簽含量一致,但這與液相色譜峰面積較小的結(jié)果不一致,可能是椰漿生產(chǎn)工藝中產(chǎn)生或是加入的蛋白。5號樣品的電泳條帶少且顏色淺,這與液相色譜峰面積小的結(jié)果一致,與標(biāo)簽含量不一致。8~10號椰漿為馬來西亞的椰漿,這3個樣品的電泳條帶個數(shù)基本一致,但各個條帶深淺有區(qū)別,說明含有的蛋白種類基本相同但是含量有所差異。

    2.3? MALDI-TOF/TOF-MS鑒定結(jié)果

    從凝膠上挖取具有代表性的蛋白條帶(挖點(diǎn)見圖3),用MALDI-TOF/TOF-MS進(jìn)行鑒定,根據(jù)Mascot (http://www.matrixscience.com)搜索,椰漿的9個挖點(diǎn)中有6條蛋白條帶均鑒定出vicilin-like antimicrobial peptides 2-1, partial [Elaeis guineensis](豌豆球蛋白樣抗菌肽2-1,部分[油棕])。MALDI-TOF/TOF-MS圖見圖4,圖中標(biāo)出特征肽段QQPFYDEGMR(分子量1270.59)的二級圖譜,條帶2、3、6、7、8都鑒定出豌豆球蛋白樣抗菌肽2-1,部分[油棕],這些條帶的MALDI-TOF/TOF-MS圖譜與條帶1的相似。根據(jù)質(zhì)譜鑒定出的氨基酸序列,通過Swiss-modle(https://swissmodel.expasy.org/inte ractive)數(shù)據(jù)比對,得到許多同源序列,選定相關(guān)性最高的作為待測蛋白質(zhì)列模板,與63 kDa 類球蛋白的條帶具有最高相關(guān)性的模板為豌豆球蛋白模板(4lej.1.A),相似性為37.50%~38.81%,63 kDa 類球蛋白也是椰子中的高豐度蛋白,含量較高[20]。

    由圖3的條帶9鑒定出3種蛋白,除了63 kDa類球蛋白[油棕]外,還鑒定出7S球蛋白[油

    棕]和11S球蛋白同種型1[椰子],MALDI-TOF/ TOF-MS圖譜見圖5。圖中標(biāo)出了7S球蛋白[油棕]:EEVFMAGPEER(分子量 1293.622)、11S球蛋白同種型1[椰子]:GDEVAIFTPR(分子量1104.604)和63 kDa類球蛋白[油棕]:VAIIETNP NT FVLPSHFD AEA LL FVAR(分子量2984.696)代表性的特征肽段,鑒定結(jié)果見表3。椰漿中鑒定出的7S和11S球蛋白,與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致[21]。

    椰漿的電泳圖基本都有的3個條帶,分別為26 kDa、35~49 kDa和49 kDa。6、8、9、10號椰漿電泳圖上26 kDa的條帶比鮮榨椰子漿中的蛋白條帶深,6號樣品的條帶3和8號樣品的條帶8均鑒定為豌豆球蛋白樣抗菌肽2-1,可能是由于椰漿的生產(chǎn)工藝使得蛋白質(zhì)分解成多肽而產(chǎn)生了此條帶的蛋白。所有椰漿35~49 kDa之間的條帶和49 kDa的條帶都比鮮榨椰子漿的條帶淺,可能是由于椰漿生產(chǎn)加工過程中,部分蛋白因理化因素發(fā)生了變性而析出,導(dǎo)致蛋白質(zhì)濃度下降。6號樣品的第4和第5條條帶,沒有鑒定出椰子相關(guān)的肽段或蛋白,這與高效液相色譜峰面積小的結(jié)果一致,可推測出6號椰漿樣品加入非椰子蛋白的概率大。

    3? 討論

    椰漿用途廣泛,可作為食品添加劑,椰子果肉被加工成椰漿,可保持其營養(yǎng)物質(zhì)和天然風(fēng)味。椰漿的9個挖點(diǎn)中有6條蛋白條帶鑒定出vicilin-like antimicrobial peptides 2-1,partial [Elaeis guineensis](豌豆球蛋白樣抗菌肽2-1,部分[油棕]):QQPFYDEGMR(分子量1270.59)。Zheng等分別于2016、2019年從椰餅分離蛋白水解物中分離出2條抗氧化肽Pro-Gln-Phe-Tyr-Trp(865.02 Da)、ArgPro-Glu-Ile-Val(612.36 Da)[22]和具有ACE抑制和抗氧化作用的3條活性肽KAQYPYV、KIIIYN和KILIYG[23]。這些結(jié)果表明,椰子蛋白是一種具有生物活性肽的潛在來源。

    通常用于植物蛋白的分析方法有十二烷基凝膠電泳(SDS-PAGE)、高效液相色譜(HPLC)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI- TOF/TOF-MS)等。MALDI-TOF/TOF-MS因具有高通量、高分辨率、低檢測線和準(zhǔn)確性,更適用于植物蛋白的定性分析。本研究以RP-HPLC得到的色譜峰面積和SDS-PAGE條帶數(shù)量和顏色的深淺相互驗(yàn)證,并與MALDI-TOF/TOF-MS鑒定出的肽段根據(jù)Mascot搜索匹配的蛋白質(zhì)的信息為評價指標(biāo),研究了椰漿中椰子蛋白的定性分析方法,可初步判定椰漿蛋白與產(chǎn)品標(biāo)識是否相符,判斷椰漿蛋白是否來源于椰子蛋白,可作為椰漿中摻入非椰子蛋白的有效鑒定方法,具有廣闊的應(yīng)用空間,為椰漿蛋白的食品安全和質(zhì)量控制提供了方法參考和示范。

    在椰漿和鮮榨椰子漿的HPLC圖中,都有2個明顯的色譜峰,特別是在鮮榨椰子漿中,這2個色譜峰的峰面積更大。在今后的研究中,可研究批量分離純化這2個蛋白色譜峰的方法,明確這2種椰子蛋白物理化學(xué)性質(zhì);椰子蛋白有促進(jìn)健康和預(yù)防疾病的潛力,可采用已有的現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)開發(fā)出這2種椰子蛋白更多的附加值,在生產(chǎn)椰子蛋白質(zhì)產(chǎn)品時,通過加酸、堿、酶等,得到更容易消化且功能性更好的椰子蛋白質(zhì)產(chǎn)品;也可將這2種純化后的椰子蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品,用HPLC外標(biāo)法檢測和評價椰子產(chǎn)品蛋白含量,而不是只檢測氮含量,使得椰子蛋白的檢測更合理和簡化,對于椰子產(chǎn)品的應(yīng)用與推廣都具有重要的意義。

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    責(zé)任編輯:崔麗虹

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