RAD51AP1在上皮性卵巢癌中的異常表達(dá)與腫瘤預(yù)后的關(guān)系

陳曉娟，劉朝霞

（1.江西省鷹潭市婦幼保健院，江西 鷹潭 335000；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江西 南昌 330000）

0 引言

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤，它的死亡率在婦科惡性腫瘤中排名第一。卵巢位于盆腔深處，早期通常無(wú)癥狀，這使得卵巢早期診斷較難，且易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，導(dǎo)致卵巢癌的死亡率高[1-2]。目前的治療手段為卵巢癌帶來(lái)的效果僅僅是減輕腫瘤負(fù)擔(dān)，不能顯著提高卵巢癌患者的長(zhǎng)期生存率。其根本原因在于卵巢癌的發(fā)病機(jī)制還不能夠完全明了[3-4]。卵巢癌的診斷和治療仍然成為臨床上的棘手問(wèn)題，主要原因是缺乏特異、敏感的卵巢癌篩查方法。找尋卵巢癌特異基因和新的治療方向?qū)β殉舶┑念A(yù)后是有很大幫助的。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，同源重組修復(fù)基因在腫瘤的發(fā)病機(jī)制上中扮演著重要角色。研究DNA損傷修復(fù)基因，并有針對(duì)性地聯(lián)合DNA損傷修復(fù)基因抑制劑和化療藥物，已逐漸成為包括卵巢癌在內(nèi)的腫瘤研究新熱點(diǎn)[6]。RAD51AP1是同源重組修復(fù)基因，與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展如三陰性乳腺癌（TNBC），肝細(xì)胞癌（HCC），食道癌（EC），腎細(xì)胞癌，乳頭狀甲狀腺癌，宮頸癌，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤等有關(guān)[7-9]。但在卵巢癌的研究中缺乏系統(tǒng)評(píng)價(jià)，本文將從生物信息學(xué)角度研究RAD51AP1與卵巢癌的關(guān)系。

1 數(shù)據(jù)與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)。為GEO基因表達(dá)譜，它可以反映基因活動(dòng)信息用于反應(yīng)基因的調(diào)控機(jī)制及在不同表型和條件下基因的表達(dá)如何受影響等。它作為高通量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)貯存庫(kù)，檢測(cè)mRNA、基因組DNA、蛋白質(zhì)豐度和非陣列的表達(dá)水平技術(shù)。研究數(shù)據(jù)集的納入標(biāo)準(zhǔn)：①采用人類(lèi)基因組表達(dá)譜芯片信息及人類(lèi)基因組U133A陣列，②樣品組織有卵巢癌及非卵巢癌組織。③在基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中提取數(shù)據(jù)集。

1.2 腫瘤基因組數(shù)據(jù)。為T(mén)CGA數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)系統(tǒng)分析，可以查找所有癌癥相關(guān)的微效基因改變，從而了解基因的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，以此作為基礎(chǔ)來(lái)指導(dǎo)腫瘤診斷和治療。

1.3 Kaplan-meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)。該數(shù)據(jù)庫(kù)包含卵巢癌在內(nèi)的四中腫瘤信息，收集大量含有芯片的病例，可以用在生存預(yù)后分析中。

1.4 方法

1.4.1 基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)預(yù)處理：基因芯片預(yù)處理包括質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化、數(shù)據(jù)匯總。我們統(tǒng)一使用RAM算法對(duì)基因進(jìn)行預(yù)先處理，通過(guò)預(yù)處理才能將探針?biāo)降臄?shù)據(jù)信息轉(zhuǎn)化成基因的表達(dá)數(shù)據(jù)信息，用于后續(xù)的meta分析。通過(guò)數(shù)據(jù)預(yù)處理提取基因芯片平臺(tái)中四種芯片共享的探針組ID,對(duì)符合標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)集的GEL文件內(nèi)容進(jìn)行預(yù)處理。

1.4.2 基因表達(dá)差異：通常指某個(gè)基因在兩個(gè)條件下表達(dá)水平的檢驗(yàn)值，達(dá)到一定差異，同時(shí)具有生物學(xué)意義。本次研究運(yùn)用R語(yǔ)言環(huán)境下R軟件，將腫瘤當(dāng)中的非癌組織樣本當(dāng)做對(duì)照組，癌組織作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)基因表達(dá)譜做Meta分析，并通過(guò)zscore值篩選出差異基因。

1.4.3 基因表達(dá)程度和病患臨床病理特點(diǎn)間的聯(lián)系：利用SPSS 22.0將已獲得的TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行分類(lèi)、量化及統(tǒng)計(jì)分析。卵巢癌病患的表型及臨床病理信息從腫瘤基因數(shù)據(jù)庫(kù)獲得。通過(guò)χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。該研究利用平均值作為卡梅爾曲線(xiàn)分析的臨界值，畫(huà)生存曲線(xiàn)。和采用Log-rank檢驗(yàn)兩組間生存率及基因表達(dá)是否存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 RAD51AP1在卵巢癌中過(guò)表達(dá)。符合條件的研究對(duì)象有7個(gè)，GEO編號(hào)分別為GSE6008，GSE18520，GSE26712，GSE27651，GSE29450，GSE36668，GSE52037的表達(dá)譜數(shù)據(jù)集，總共包括450個(gè)樣本（396個(gè)病例和54個(gè)對(duì)照）。從數(shù)據(jù)集篩查到RAD51AP1所對(duì)應(yīng)探針（204146-at），在7個(gè)研究中與對(duì)照組比較均顯著上調(diào)（P＜0.01），具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

我們用相同的手段對(duì)7個(gè)卵巢癌數(shù)據(jù)集的資料進(jìn)行分析得到的13，294個(gè)基因的表達(dá)矩陣，并且顯示了基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中Meta分析的Zscore值頻數(shù)分布。RAD51AP1所對(duì)應(yīng)探針（204146-at）與對(duì)照組織相比，表達(dá)量顯著上調(diào)（Zscore=10.226，P=1.51E-24），見(jiàn)圖1。

同時(shí)通過(guò)計(jì)算效應(yīng)尺度加權(quán)均數(shù)差及其95%CI繪制出meta分析的森林圖證實(shí)RAD51AP1在多個(gè)研究中高表達(dá)穩(wěn)定，無(wú)異質(zhì)性（SMD=1.51，95%CI=1.00-2.03，P=0.08），從圖2中可以看出與癌旁組織相比，癌組織中RAD51AP1是穩(wěn)定高表達(dá)。

表1 RAD51AP1所對(duì)應(yīng)探針（204146-at）在7個(gè)卵巢癌數(shù)據(jù)集中表達(dá)情況

圖1 Zscore值頻數(shù)分布RAD51AP1所對(duì)應(yīng)Zscore為10.226

圖2 RAD51AP1在癌組織和癌旁組織表達(dá)差異的森林圖

為了驗(yàn)證以上結(jié)果，通過(guò)TCGA選取426例卵巢癌卵巢臨床樣本并且通過(guò)GTEx下載88例正常卵巢樣本，進(jìn)行表達(dá)差異分析，RAD51AP1在卵巢癌組織中確實(shí)上調(diào)。

2.2 RAD51AP1與卵巢癌臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系。從腫瘤基因數(shù)據(jù)庫(kù)獲取卵巢癌患者相關(guān)的臨床病理特征信息及表達(dá)值信息，并對(duì)年齡、腫瘤組織學(xué)分級(jí)、腫瘤TNM分期進(jìn)行歸納整理，詳情見(jiàn)表2。

RAD51AP1高表達(dá)與患者的年齡、腫瘤TNM分期、腫瘤組織學(xué)分級(jí)都無(wú)關(guān)（P＞0.05），然而基于GEO數(shù)據(jù)集中患者的生存和預(yù)后信息的生存分析（圖3），RAD51AP1高表達(dá)確實(shí)與卵巢癌生存預(yù)后相關(guān)（P＜0.01），高水平的RAD51AP1的患者生存能力差；且高水平的RAD51AP1的患者無(wú)病生存期也縮短，提示RAD51AP1與不良的生存預(yù)后顯著相關(guān)。以上結(jié)果提示，RAD51AP1很可能作為腫瘤不良生存預(yù)后的預(yù)測(cè)因子，在卵巢癌的發(fā)生過(guò)程中可能具有重要作用，RAD51AP1與不良的生存預(yù)后顯著相關(guān)可能作為卵巢癌發(fā)生過(guò)程中潛在的治療靶點(diǎn)。

表2 RAD51AP1表達(dá)情況臨床病理特征的相關(guān)性

圖3 生存分析

3 討論

RAD51AP1基因位于人類(lèi)第十五號(hào)染色體，該基因編碼的酶是RAD51蛋白質(zhì)家族的成員，它參與DNA的同源重組和修復(fù)[10-11]。RAD51AP1 在人體多種組織器官中表達(dá)，尤其在睪丸，胸腺，結(jié)腸和小腸中更是大量表達(dá)[12-13]。RAD51AP1能夠連接同源重組酶RAD51和DMC1，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的有絲分裂和減數(shù)分裂中的同源重組起到至關(guān)重要的作用[14]。同源重組（homologous recombination，HR）在細(xì)胞遭受損傷時(shí)啟動(dòng)，在損傷修復(fù)中占重要地位，同源重組修復(fù)遵循著模板進(jìn)行修復(fù)，對(duì)保持基因穩(wěn)定很重要，如果修復(fù)出現(xiàn)缺陷，將可能導(dǎo)致基因突變，甚至能造成腫瘤的發(fā)生。HR修復(fù)的機(jī)制非常復(fù)雜，和很多蛋白有關(guān)，包括RAD51、RAD52、RAD54、BRCA1、BRCA2、MRN復(fù)合物等[15]。

本文通過(guò)生物信息學(xué)分析，利用基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)和腫瘤基因數(shù)據(jù)庫(kù)獲得7個(gè)相關(guān)的數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)RAD51AP1在卵巢癌組織中過(guò)表達(dá)，臨床樣本的基因差異性分析同樣證明其在卵巢癌中過(guò)表達(dá)，并且分析了這種過(guò)表達(dá)帶來(lái)的意義，雖然其與患者的臨床病理特征關(guān)系不甚密切，但它與患者的生存預(yù)后有關(guān)聯(lián)，過(guò)表達(dá)的患者生存預(yù)后能力差，無(wú)病生存期縮短，提示其與腫瘤不良預(yù)后有關(guān)，這也展示了RAD51AP1在卵巢癌研究中發(fā)揮的作用，為今后卵巢癌的研究提供新的方向。

自從發(fā)現(xiàn)RAD51AP1以來(lái)，我們?cè)诟玫亓私馄渖图?xì)胞生物學(xué)特性方面取得了重大進(jìn)展。但RAD51AP1與卵巢癌發(fā)生和發(fā)展之間的聯(lián)系仍然知之甚少，本文從生物信息學(xué)的角度來(lái)闡述RD51AP1與卵巢癌之間的關(guān)系，為以后從細(xì)胞學(xué)及分子機(jī)制入手進(jìn)一步深入發(fā)掘其與卵巢癌之間的確切聯(lián)系奠定了理論基礎(chǔ)。