平肝止復(fù)方免煎顆粒聯(lián)合卡馬西平對難治性癲大鼠海馬組織自噬及凋亡的影響*

王強，薛紅，郭磊磊，婁金波，李若照，劉運權(quán)

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，貴陽 550000)

癲是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病，是由大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電而對大腦神經(jīng)功能造成障礙，嚴重影響患者的健康和生活質(zhì)量[1]。目前已經(jīng)有大量研究證實，卡馬西平、苯妥英鈉、苯巴比妥等臨床常用抗癲藥物對25%～30%癲患者治療效果不佳[2-4]。因此，尋找針對此類難治性癲患者新的治療方法和有效的干預(yù)藥物，具有重要的現(xiàn)實意義。平肝止復(fù)方是本研究團隊通過總結(jié)臨床經(jīng)驗及結(jié)合前期實驗研究的復(fù)方藥。近年來，筆者用平肝止復(fù)方免煎顆粒聯(lián)合卡馬西平治療臨床確診的難治性癲患者取得一定的療效[5]，但其對難治性癲的治療機制尚不明確。筆者在本研究旨在探討平肝止復(fù)方聯(lián)合卡馬西平對難治性癲大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡及自噬的作用。

1 材料與方法

1.1實驗藥物 平肝止復(fù)方免煎顆粒組成：天麻20 g(批號：1008072)，石菖蒲10 g(批號：1009044)，全蝎6 g(批號：1108023)，膽南星10 g(批號：1002036)，郁金12 g(批號：1009018)，均來自四川省新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，購于貴州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院中藥免煎顆粒沖劑配方。取全方藥物58 g，于200 mL純化水溶解后濃縮為0.48 g·mL-1藥液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2動物 無特定病原體(SPF)級雄性Wistar大鼠44只，體質(zhì)量200～220 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2015-30。大鼠于室溫21～25 ℃、相對濕度40%～65%條件下飼養(yǎng)。

1.3試劑 蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒、尼氏染色液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒(批號：G1120、G1436、PC0020)均購自北京索萊寶生物公司；TUNEL檢測試劑盒(貨號：C1090)購自上海碧云天生物公司；蛋白Marker(貨號：DM131-02)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、B淋巴細胞瘤-2(b-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(bcl 2 associated X protein，Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)、自噬效應(yīng)蛋白(Beclin1)、微管相關(guān)蛋白1親鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)一抗及辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記羊抗兔二抗(批號：ab181602、ab196495、ab32503、ab13847、ab207612、ab192890、ab6721)均購自美國Abcam公司；海人酸(批號：K0250)購自德國Sigma公司；卡馬西平，苯妥英鈉(批號：S45626、S49327)均購自上海源葉生物公司。

1.4儀器 離心機(5427R)購自德國Eppendorf公司；透射電鏡(Tecnai F30)購自美國FEI公司；顱腦定位儀(68526)購自天津市醫(yī)療器械研究所；石蠟切片機(RM2235)購自德國Lecia公司；光學(xué)顯微鏡(E200)購自日本尼康公司；超低溫冰箱(DW-86L388J)購自中國海爾公司；微量移液器(3111)購自德國Eppendorf公司；電子天平(CPA26P)購自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司(感量：0.1 mg)。

1.5動物造模和分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始造模[6-7]。隨機選取36只大鼠麻醉后，通過腦立體定位儀于右側(cè)海馬腹后部CA3區(qū)注射1 μg·mL-1海人酸2 μL，注射完畢留置5 min后緩慢拔出注射器，注射口以鐘表螺絲封口，于對應(yīng)左側(cè)顱骨定位處以牙鉆鉆孔并以鐘表螺絲封住，兩側(cè)均用牙科水泥封口，將記錄電極接在鐘表螺絲上面，最后縫合頭皮。假手術(shù)組大鼠于同樣解剖定位下予0.9%氯化鈉溶液2 μL，術(shù)后對大鼠行為學(xué)進行觀察并記錄。采用Racine評分法進行分級評分：I級，咀嚼、眨眼、立須等面部肌肉的抽搐；II級，以點頭運動為主的頸部肌肉抽搐；Ⅲ級，單側(cè)前肢陣攣、抽搐；Ⅳ級，雙側(cè)前肢陣攣、抽搐伴身體立起；V級，雙側(cè)后肢強直，身體背曲強直，跌倒伴全身陣攣。造模后出現(xiàn)Ⅳ級以上發(fā)作視為癲造模成功，未達到Ⅳ級發(fā)作歸入造模不成功組棄用。待癲模型成功后，將癲大鼠以0.03 g·kg-1·d-1苯妥英鈉灌胃；假手術(shù)組大鼠灌胃同體積0.9%氯化鈉溶液。連續(xù)灌胃14 d后，進行行為學(xué)觀察，仍有25只性發(fā)作，歸為成功的難治性癲動物模型，模型成率69.4%。最后采用隨機分組法進行分組，選取制備成功24只模型大鼠，分為模型對照組、卡馬西平(0.03 g·kg-1·d-1)組，平肝止復(fù)方(4.8 g·kg-1·d-1)聯(lián)合卡馬西平(0.03 g·kg-1·d-1)組，每組8只大鼠，另加假手術(shù)組8只。造模結(jié)束后各組大鼠灌胃相應(yīng)藥物或0.9%氯化鈉溶液，給藥量通過人和大鼠體表面積比值換算，每天給藥1次，給藥體積10 mL·kg-1，分別給藥28 d后處死大鼠，取海馬組織。

1.6HE染色觀察海馬組織 取大鼠海馬組織，于4%多聚甲醛中固定48 h，經(jīng)過逐步脫水，石蠟包埋后，以厚度5 μm切片，脫蠟后蘇木精染色，1%鹽酸乙醇分化，伊紅染色，中性樹膠封片，攝像觀察。

1.7尼氏染色觀察海馬組織 取大鼠海馬組織，4%多聚甲醛固定48 h，經(jīng)過逐步脫水，石蠟包埋后，以厚度5 μm均勻切片，脫蠟后1%甲苯胺藍染色，95%乙醇快速分化，脫色，無水乙醇快速脫水，二甲苯透明，攝像觀察。

1.8透射電鏡觀察海馬組織自噬 取大鼠海馬組織，于2.5%戊二醛和1%鋨酸固定，乙醇和丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂浸透包埋，制備超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛分別染色5 min，透射電鏡觀察攝像觀察。

1.9TUNEL檢測海馬組織凋亡 末次給藥結(jié)束后，取海馬組織于4%多聚甲醛中固定48 h，石蠟包埋獲取組織切片，脫蠟，加蛋白酶K工作液孵育20 min，石蠟切片加入TUNEL反應(yīng)液室溫避光孵育60 min，加DAPI染核，封片，熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.10Western blotting檢測海馬組織bcl-2、Bax、Caspase-3、Beclin1、LC3蛋白表達 將海馬組織勻漿后加入蛋白裂解溶液于冰上裂解15 min，4 ℃下，14 000 r·min-1(有效半徑8.5 cm)離心10 min，收集上清液。BCA法測定相應(yīng)蛋白濃度。取等量蛋白樣品以12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳分離，聚偏氟乙烯(Polyvinylidene fluoride，PVDF)轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉緩沖液于室溫下封閉2 h，經(jīng)bcl-2、Bax、Caspase-3、Beclin1、LC3、GAPDH等一抗于4 ℃靜置孵育過夜，再以相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗37 ℃搖床孵育2 h，電致化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)顯影后掃描膠片，統(tǒng)計分析目的蛋白和內(nèi)參蛋白條帶光密度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白光密度比值作為目的蛋白的表達量。

2 結(jié)果

2.1大鼠海馬組織病理變化 HE染色結(jié)果表明，假手術(shù)組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)清晰完整，神經(jīng)細胞形態(tài)完整，呈圓形、橢圓形，排列有序，核仁清晰，形態(tài)正常。與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠神經(jīng)元細胞排列紊亂，細胞間距增加，神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)不完整，細胞腫脹、破裂，輪廓模糊；與模型對照組比較，卡馬西平組神經(jīng)元排列尚且整齊，細胞核形態(tài)較為正常，存在部分破裂、壞死性神經(jīng)元細胞；與卡馬西平組比較，平肝止復(fù)方聯(lián)合卡馬西平組細胞排列較整齊，細胞核形態(tài)較正常，僅有散在的壞輪廓模糊的神經(jīng)元。結(jié)果見圖1。

2.2各組大鼠尼氏體變化 尼氏染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型對照組尼氏體減少，細胞排列紊亂，形狀不規(guī)則。與模型對照組比較，卡馬西平組尼氏體數(shù)量增加，細胞排列較為整齊。與卡馬西平組比較，平肝止復(fù)方聯(lián)合卡馬西平組的尼氏體數(shù)量相對增加，細胞排列緊密有序。結(jié)果見圖2。

2.3各組大鼠自噬 假手術(shù)組大鼠細胞質(zhì)中線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯自噬體；模型對照組可見細胞核固縮、碎裂、胞膜輪廓不清、胞質(zhì)疏松，與假手術(shù)組比較自噬體顯著增加(F=6.476，P<0.05)；卡馬西平組細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，可見細胞質(zhì)中線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與模型對照組比較自噬體顯著減少(F=0.682，P<0.05)；與卡馬西平組比較，平肝止復(fù)方聯(lián)合卡馬西平組自噬體顯著減少(F=1.597，P<0.05)，結(jié)果見圖3。

2.4大鼠海馬組織及海馬神經(jīng)元凋亡變化 大鼠海馬組織凋亡情況見圖4。與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠海馬組織凋亡增加；與模型對照組比較，卡馬西平組及平肝止復(fù)方聯(lián)合卡馬西平組大鼠海馬組織凋亡下降；與卡馬西平組比較，平肝止復(fù)方聯(lián)合卡馬西平組大鼠海馬組織凋亡下降。

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.卡馬西平組；D.平肝止復(fù)方聯(lián)合卡馬西平組。

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.卡馬西平組；D.平肝止復(fù)方聯(lián)合卡馬西平組。

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.卡馬西平組；D.平肝止復(fù)方聯(lián)合卡馬西平組；①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05；③與卡馬西平組比較，P<0.05。

2.5大鼠海馬組織Bax、Bcl-2、Caspase-3、Beclin1及LC3表達結(jié)果 Western blotting檢測結(jié)果見圖5。與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠海馬組織Bax、Caspase-3、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達顯著性增加(F=5.166，5.065，1.388，3.216，P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著性減少(F=0.233，P<0.05)；與模型對照組比較，卡馬西平組大鼠海馬組織LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達減少(F=0.252，P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著性增加(F=0.004，P<0.05)，Bax、Caspase-3、Beclin1蛋白表達減少但不顯著(F=1.352，0.259，0.143，P>0.05)，平肝止復(fù)方聯(lián)合卡馬西平組大鼠海馬組織Bax、Caspase-3、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達顯著性減少(F=2.001，0.079，0.628，0.765，P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著性增加(F=0.349，P<0.05)；與卡馬西平組比較，平肝止復(fù)方聯(lián)合卡馬西平組大鼠海馬組織Bax蛋白表達顯著減少(F=0.004，P<0.05)，Bcl-2蛋白表達增加(F=0.291，P<0.05)，Caspase-3、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達減少但不顯著(F=0.089，0.234，0.162，P>0.05)。

3 討論

癲是神經(jīng)系統(tǒng)常見的慢性病之一，目前我國癲發(fā)病率約0.5%，其中25%～30%患者通過臨床常見抗癲藥物系統(tǒng)治療后仍得不到有效控制[8-9]。因此，探索難治性癲的發(fā)病機制，改善患者預(yù)后，尋找針對此類患者新的治療方法和有效的干預(yù)藥物，具有重要的現(xiàn)實意義。平肝止顆粒以天麻為君藥，全蝎、膽南星、郁金為臣藥，石菖蒲為佐使藥。天麻熄風(fēng)止痙、平驚定。尼氏體是神經(jīng)細胞的特殊組成部分，能合成細胞器所需的重要蛋白質(zhì)和產(chǎn)生遞質(zhì)有關(guān)的酶。當(dāng)神經(jīng)元細胞出現(xiàn)凋亡、炎性改變等病理變化時，尼氏小體的數(shù)量也會隨之減少、甚至出現(xiàn)降解或消亡。隨著疾病漸愈，尼氏體數(shù)量形態(tài)又恢復(fù)正常[10]。研究表明，難治性癲大鼠海馬組織中細胞排列紊亂，細胞腫脹、破裂，尼氏體減少[11-12]。本研究采用較成熟的海人酸及苯妥英鈉誘導(dǎo)法建立難治性癲大鼠模型[6-7]。結(jié)果顯示，與難治性癲大鼠比較，平肝止復(fù)方聯(lián)合卡馬西平組大鼠海馬神經(jīng)元細胞尼氏體增加，細胞排列較整齊，細胞核形態(tài)較正常，僅有散在的輪廓模糊的神經(jīng)元細胞，說明平肝止復(fù)方聯(lián)合卡馬西平對難治性癲大鼠海馬神經(jīng)元具有保護作用。

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.卡馬西平組；D.平肝止復(fù)方聯(lián)合卡馬西平組；①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05；③與卡馬西平組比較，P<0.05。

研究表明，Bcl-2及Bax在細胞凋亡進程中發(fā)揮了重要作用。Bax位于細胞質(zhì)中，當(dāng)細胞受到凋亡信號刺激，其由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體膜上，進而導(dǎo)致線粒體跨膜電位下降，改變線粒體膜通透性進而使凋亡因子如Caspase-3釋放增多[13]。Bcl-2是位于線粒體上的一種跨膜蛋白，能夠與Bax結(jié)合形成二聚體，可穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制促凋亡因子釋放從而起抗凋亡作用[14]。近年來，研究表明癲的發(fā)生過程中，海馬組織Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達異常，神經(jīng)元細胞凋亡嚴重[15-17]。本研究表明，相對于模型對照組，平肝止復(fù)方聯(lián)合卡馬西平組大鼠海馬組織Bax、Caspase-3蛋白表達減少，Bcl-2蛋白增加，細胞凋亡明顯降低，說明平肝止復(fù)方聯(lián)合卡馬西平可抑制海馬神經(jīng)元凋亡，從而保護海馬神經(jīng)元。

自噬即細胞的自我消化，是細胞把待降解的物質(zhì)通過自噬體轉(zhuǎn)運到溶酶體，在溶酶體的酸性環(huán)境以及溶酶體酶作用下使待降解產(chǎn)物被降解的過程[18]。正常生理條件下，自噬處于低水平，機體通過自噬降解細胞內(nèi)多余、衰老或受損的蛋白及細胞器，來維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[19]。當(dāng)細胞受到饑餓、低氧和高溫等影響時，自噬被激活，機體通過自噬降解胞內(nèi)大分子及細胞器為細胞提供能量，促進細胞存活。另外自噬也是一把雙刃劍，當(dāng)細胞中自噬被過度激活后則引發(fā)細胞自噬性死亡[20]。Beclin1是哺乳動物中最早發(fā)現(xiàn)的自噬基因，其表達水平一定程度上反映自噬的活性[21]。LC3是自噬標(biāo)志性蛋白，分為2個亞型，在細胞自噬形成過程中LC3Ⅰ被剪形成LC3Ⅱ，LC3Ⅱ定位于自噬體膜上是自噬的標(biāo)志性分子。因此，在細胞自噬進程中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值可以反映自噬被激活的程度[22-23]。本研究結(jié)果顯示，模型對照組大鼠海馬組織中自噬體增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin1蛋白含量也增多，說明難治性癲大鼠海馬組織中自噬過度激活。平肝止復(fù)方聯(lián)合卡馬西平組大鼠海馬組織中自噬體減少，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin1蛋白含量也降低，說明平肝止復(fù)方聯(lián)合卡馬西平可糾正海馬組織異常自噬。與本研究類似，其他研究也表明癲大鼠海馬組織自噬異常激活，抑制大鼠海馬組織的過度自噬可以保護海馬神經(jīng)元從而減輕癲癥狀[24-25]。

綜上所述，平肝止復(fù)方聯(lián)合卡馬西對難治性癲大鼠神經(jīng)元有保護作用，其具體機制可能與調(diào)節(jié)神經(jīng)元細胞自噬及凋亡有關(guān)，但難治性癲的發(fā)生機制較為復(fù)雜，是否還存在其他影響因素有待進一步深入研究。

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.卡馬西平組；D.平肝止復(fù)方聯(lián)合卡馬西平組；①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05；③與卡馬西平組比較，P<0.05。