2型糖尿病患者視網(wǎng)膜病變與血漿氧化三甲胺水平的相關(guān)性分析

武銀鈴, 朱麗曄, 章 雯, 桂雅迪, 王 雷, 楊 芬, 孫樹乾

(江蘇省南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院/東南大學附屬中大醫(yī)院溧水分院,1. 內(nèi)分泌科, 2. 康復醫(yī)學科, 江蘇 南京, 211200)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是導致中老年糖尿病患者視力損害的主要原因之一，其全球患病率約為34.6%[1]。高血壓、糖尿病病程較長、血糖控制不佳是DR發(fā)生和發(fā)展的重要危險因素，探討能準確反映DR病情的生物標志物有助于制定高危人群的早期預防和個性化管理策略。氧化三甲胺(TMAO)是一種由腸道微生物衍生的代謝物，主要來源于左旋肉堿、膽堿及前體三甲胺(TMA)。腸道微生物群將L-肉堿和膽堿轉(zhuǎn)化為TMA, TMA在肝臟中被黃素單加氧酶3(FMO3)氧化為TMAO。既往研究[2-4]證實，血漿TMAO是心血管疾病預后的一個新預測因子，非致死性抑制腸道微生物酶或FMO3基因缺陷可顯著降低TMAO水平，減輕TMAO誘導的動脈粥樣硬化和血栓形成性疾病。一項薈萃分析[5]結(jié)果顯示，血漿TMAO濃度與糖尿病的發(fā)生風險呈正相關(guān)。較高TMAO濃度會損害葡萄糖的穩(wěn)態(tài)，導致糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和較差的臨床預后[6]。此外，F(xiàn)MO3基因敲除可以降低血漿TMAO濃度，進而預防高脂血癥和高血糖疾病的發(fā)生[7]。TMAO可能是糖尿病相關(guān)性疾病的一個重要新型生物標志物，但目前關(guān)于TMAO與DR之間關(guān)系的研究較少。本研究分析了血漿TMAO水平與2型糖尿病(T2DM)患者DR的相關(guān)性，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年10月—2020年10月在本院就診的102例T2DM患者作為研究對象，根據(jù)有無DR和DR分期標準[8]將患者分為無DR(NDR)組38例、非增殖性DR(NPDR)組35例、增殖性DR(PDR)組29例。NDR組男22例，女16例，年齡57～67歲; NPDR組男19例，女16例，年齡56～66歲; PDR 組男17例，女12例，年齡57～67歲。另選取本院同期40名健康體檢者作為對照組，男25例，女15例，年齡56～66歲。4組受試者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

納入標準: ① T2DM的診斷符合1999 年世界衛(wèi)生組織糖尿病的診斷和分型標準[9]者; ② 受試對象或家屬自愿參加本研究，并簽署知情同意書。排除標準: ① 患有其他眼部疾病者，如外傷、青光眼、白內(nèi)障、視網(wǎng)膜脫落; ② 合并嚴重肝腎功能障礙、認知障礙、自身免疫性疾病、全身感染、惡性腫瘤、意識障礙、糖尿病急性并發(fā)癥者; ③ 近1個月口服降脂藥物者; ④妊娠期、哺乳期女性。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集: 收集受試者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、糖尿病病程和高血壓、冠心病、糖尿病腎病病史等一般資料。

1.2.2 實驗室指標檢測: 實驗室指標包括空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血肌酐、C反應(yīng)蛋白(CRP)和TMAO。采集受試者清晨空腹靜脈血5 mL, 分2管進行EDTA抗凝處理，一管用于常規(guī)生化指標檢測，另一管用于TMAO檢測。經(jīng)4 ℃、3 000轉(zhuǎn)/min離心10 min, 靜置提取血漿后于-80 ℃保存集中送檢。采用同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法檢測血漿TMAO濃度[10], 將20 μL血漿樣品與80 μL含有d9-TMAO(上海Sigma公司)甲醇內(nèi)參溶液混勻后在15 000轉(zhuǎn)/min、4 ℃條件下離心10 min, 取70 μL上清液在API 5500Q-TRAP(美國AB SCIEX公司)質(zhì)譜儀上進行檢測。其他血脂、血糖和生化指標采用美國Beckman Coulter公司DxC800自動生化分析儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 一般資料和實驗室指標比較

PDR組患者糖尿病病程長于NDR組、NPDR組患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 對照組、NDR組、NPDR組、PDR組的FPG、HbA1c、CRP和TMAO水平均依次升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組臨床資料和實驗室指標比較

2.2 不同TMAO水平亞組患者一般資料和實驗室指標的比較

按不同TMAO水平將受試者(n=142)分為<0.3 μmol/L組、0.3～0.6 μmol/L組和>0.6 μmol/L組3個亞組, 3組間糖尿病病程和FPG、HbA1c、CRP水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同TMAO水平亞組患者一般資料和實驗室指標比較

2.3 TMAO與各臨床參數(shù)的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示, TMAO與糖尿病病程、FPG、HbA1c、CRP均呈顯著正相關(guān)(r=0.456、0.568、0.623、0.774,P均<0.05), 與其他臨床參數(shù)無顯著相關(guān)性(P>0.05)。見表3。

表3 TMAO與各臨床參數(shù)的相關(guān)分析

2.4 DR的主要危險因素分析

Logistic回歸分析結(jié)果顯示，糖尿病病程長和FPG、HbA1c、CRP、TMAO水平高均是DR的危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 DR的主要危險因素分析

2.5 3種方法對DR的診斷效能比較

ROC曲線分析結(jié)果顯示，單獨TMAO診斷DR的曲線下面積(AUC)為0.833, 糖尿病病程、FPG、HbA1c、CRP聯(lián)合診斷DR的AUC為0.802, 糖尿病病程、FPG、HbA1c、CRP、TMAO聯(lián)合診斷DR的AUC為0.879。見表5、圖1。

表5 3種方法對DR的診斷效能比較

圖1 3種方法診斷DR的ROC曲線

3 討 論

TMAO的表達與糖尿病和DR的發(fā)生密切相關(guān)。研究[11]表明，TMAO對葡萄糖代謝有負性調(diào)節(jié)作用，進而導致糖尿病的發(fā)生。與健康人相比，糖尿病患者磷脂酰膽堿水平與全因死亡率以及心血管疾病病死率有較強的相關(guān)性[12]。血清TMAO水平升高與胰島素抵抗、內(nèi)臟肥胖和脂肪肝的發(fā)生也有緊密聯(lián)系，而干預生活方式可以降低TMAO水平[13-14]。CROYAL M等[15]提出，年齡、糖尿病和BMI與血漿TMAO水平相關(guān)，與左旋肉堿無關(guān)。這些改變不僅與血脂的甲基化有關(guān)，而且與高水平血糖有關(guān)，因此認為高水平血漿TMAO是糖尿病的一個有力預測指標。研究[16-18]發(fā)現(xiàn)，高TMAO水平是糖尿病患者不良心血管結(jié)局的標志，如死亡(HR=2.7, 95%CI為1.1～7.1)、心肌梗死(HR=4.0, 95%CI為1.6～9.8)、心力衰竭(HR=4.6, 95%CI為2.0～10.7)、不穩(wěn)定型心絞痛(HR=9.1, 95%CI為2.8～29.7)和其他心血管事件(HR=2.0, 95%CI為1.1～3.6)。BARREA L等[19]研究結(jié)果顯示，在T2DM患者中，血漿TMAO水平升高導致3年主要心臟不良事件風險增加3.0倍(P<0.001), 5年病死率風險增加3.6倍(P<0.001)。

本研究結(jié)果顯示, PDR組患者糖尿病病程長于NDR組、NPDR組患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 對照組、NDR組、NPDR組、PDR組的FPG、HbA1c、CRP和TMAO水平依次升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); TMAO與糖尿病病程、FPG、HbA1c、CRP呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與年齡、糖尿病持續(xù)時間無相關(guān)性，與其他研究[20]結(jié)論不一致，考慮與樣本量有限和選擇偏差有關(guān)。高脂肪飲食相較素食會產(chǎn)生更多的TMAO[21]。T2DM患者血漿TMAO水平明顯升高，且隨著DR的發(fā)生和發(fā)展, TMAO水平逐漸升高，表明TMAO在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，糖尿病病程長和FPG、HbA1c、CRP、TMAO水平高是DR的主要危險因素(P<0.05); ROC曲線分析結(jié)果顯示, TMAO診斷DR的曲線下面積(AUC)為0.833, 糖尿病病程、FPG、HbA1c、CRP聯(lián)合診斷DR的AUC為0.802, 糖尿病病程、FPG、HbA1c、CRP、TMAO聯(lián)合診斷DR的AUC為0.879。由此提示, TMAO聯(lián)合糖尿病病程、FPG、HbA1c、CRP對DR有較好的診斷效能。動物實驗[22-23]結(jié)果顯示，糖尿病小鼠腸道菌群失調(diào)可促進DR的發(fā)生，間歇性禁食可通過重組腸道微生物組群來阻止DR進展，增加硬壁菌數(shù)量，減少擬桿菌，而血漿TMAO水平與硬壁菌呈負相關(guān)，與擬桿菌呈正相關(guān)。研究[24]提示, TMAO通過增強胰島素抵抗和血脂異常參與DR的發(fā)生，血漿TMAO水平越高，胰島素抵抗越強，糖尿病相關(guān)預后越差。炎癥是影響DR進展的關(guān)鍵，血漿TMAO水平升高可導致輕度和慢性全身炎癥狀態(tài)，引起血漿促炎細胞因子水平升高[25-26]。有動物實驗[27]采用高脂肪飲食喂養(yǎng)小鼠后，發(fā)現(xiàn)小鼠血漿TMAO濃度較高，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)水平升高，白細胞介素-10(IL-10)水平降低。此外, TMAO可激活炎癥信號通路，促進白細胞募集[28], 提示TMAO可能通過促進活性氧(ROS)的過度生成和抑制Sirtuin1的表達，從而加速內(nèi)皮細胞衰老[29]。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)也可能參與了TMAO誘導的血管內(nèi)皮細胞通透性變化過程，以及參與DR的發(fā)生過程[30]。

綜上所述，血漿TMAO水平升高與T2DM患者DR的發(fā)生及其嚴重程度有關(guān)，是DR的主要危險因素之一。TMAO聯(lián)合糖尿病病程、FPG、HbA1c、CRP對DR有較高的診斷效能。但本研究存在一定局限性，如為單中心研究且樣本量較小，也缺乏動物或細胞基礎(chǔ)研究對相關(guān)假設(shè)機制進行驗證，此外血漿TMAO濃度可能存在多種影響因素(如飲食習慣、胃腸道疾病、應(yīng)用抗生素以及檢測技術(shù)的精確度等)，故有待開展更多實驗以及多中心、大樣本量的臨床研究進一步探討。