lncRNA FGD5-AS1靶向miR-421對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的影響

孟曉京，劉亞軍，項寧

秦皇島市第一醫(yī)院，河北秦皇島 066000

眾所周知，心血管疾病是全世界最致命的疾病。缺血再灌注（I/R）損傷是最常見的心血管疾病病理因素［1］。目前，非編碼RNA［包括微小RNA（miRNA）和長鏈非編碼RNA（lncRNA）］在心肌I/R損傷機制研究中已成為熱門［2］。研究顯示，lncRNA FGD5-AS1在牙周炎患者中表達下調，上調其表達可減輕脂多糖（LPS）誘導的牙周膜細胞損傷［3］。lncRNA FGD5-AS1在糖氧剝奪誘導的神經元損傷中低表達，其過表達可減輕糖氧剝奪誘導的神經元損傷［4］。miR-421在缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷中表達上調，下調其表達可抑制細胞凋亡從而減輕缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷［5］。但lncRNA FGD5-AS1在缺氧/復氧誘導的心肌細胞中的表達與功能研究較少。2018年11月—2020年6月，本研究利用缺氧/復氧誘導心肌細胞，復制心肌I/R損傷模型，考察lncRNA FGD5-AS1在其中的表達及其對心肌細胞凋亡和氧化應激的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠心肌細胞H9C2購自上海生物科學研究所細胞資源中心，PrimeScript RT、SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒購自日本TaKaRa公司，MiScript逆轉錄試劑盒、MiScript SYBR-Green PCR試劑盒購自德 國Qiagen公 司，pcDNA、pcDNA-FGD5-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-421、si-NC、si-FGD5-AS1、miRNC、miR-421購自上海GenePharma公司，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的檢測試劑盒均購自江蘇碧云天生物技術公司，膜聯蛋白V（Annexin V）-FITC細胞凋亡試劑盒購自美國BD Pharmingen公司，細胞裂解緩沖液購自上海Sangon Biotech公司，pMIR GLO載體、雙熒光素酶活性測定系統購自美國Promega公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與缺氧/復氧處理 心肌細胞在補充了10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中于37℃、5%CO2中培養(yǎng)。取心肌細胞，將其分為Con組和H/R組。Con組未進行處理；H/R組進行缺氧/復氧處理，即將心肌細胞在缺氧培養(yǎng)箱（95%N2、5%CO2）中缺氧培養(yǎng)3 h，然后在常規(guī)培養(yǎng)箱（95%空氣、5%CO2）中復氧培養(yǎng)4 h［6］。

1.3 心肌細胞lncRNA FGD5-AS1和miR-421檢測 采用實時熒光定量PCR。用TRIzol試劑提取Con組、H/R組細胞的總RNA。使用PrimeScript RT試劑盒或MiScript逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，SYBR Premix Ex TaqⅡ或MiScript SYBR-Green PCR試劑盒在7900HT實時PCR系統上進行PCR，lncRNA FGD5-AS1以GAPDH為內參，miR-421以U6為內參。lncRNA FGD5-AS1引物序列分別為5'-AACAGTGCCTATGTGGACGG-3'（正向）和5'-CCCATCACAGAGGTCCACAC-3'（反向）；miR-421引物序列分別為5'-GCGCGGATCAACAGACATTAATT-3'（正向）和5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'（反向）；GAPDH引物序列分別為5'-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3'（正向）和5'-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3'（反向）；U6引物序列分別為5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3'（正向）和5'-TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-3'（反向）。PCR反應條件：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，40個循環(huán)。使用2-ΔΔCt法計算lncRNA FGD5-AS1和miR-421的相對表達量。

1.4 細胞分組及處理 將心肌細胞分為Con組、H/R組、H/R+pcDNA組、H/R+pcDNA-FGD5-AS1組、H/R+anti-miR-NC組、H/R+anti-miR-421組、pcDNA組、pcDNA-FGD5-AS1組、si-NC組、si-FGD5-AS1組、H/R+pcDNA-FGD5-AS1+miR-NC組、H/R+pcDNA-FGD5-AS1+miR-421組。按照制造商的說明使用Lipofectamine2000進行轉染。轉染48 h后，按照1.3采用實時熒光定量PCR評估轉染效率。隨后，根據不同實驗目的參照1.2進行缺氧/復氧處理。Con組未處理，H/R組以缺氧/復氧處理，H/R+pcDNA組進行pcDNA轉染與缺氧/復氧處理，H/R+pcDNA-FGD5-AS1組進行pcDNA-FGD5-AS1轉染與缺氧/復氧處理，H/R+anti-miR-NC組進行anti-miRNC轉染與缺氧/復氧處理，H/R+anti-miR-421組進行anti-miR-421轉染與缺氧/復氧處理，pcDNA組轉染pcDNA，pcDNA-FGD5-AS1組轉染pcDNA-FGD5-AS1，si-NC組轉染si-NC，si-FGD5-AS1組轉染si-FGD5-AS1，H/R+pcDNA-FGD5-AS1+mi R-NC組同時轉染pcDNA-FGD5-AS1、miR-NC并進行缺氧/復氧處理，H/R+pcDNA-FGD5-AS1+miR-421組同時轉染pcDNA-FGD5-AS1、miR-421并進行缺氧/復氧處理。

1.5 心肌細胞MDA含量和SOD、GSH-Px活性檢測 根據MDA、SOD、GSH-Px檢測試劑盒的操作步驟，收集1.4各組心肌細胞上清液，以硫代巴比妥酸法檢測MDA含量，氮藍四唑顯色法檢測SOD活性，NADPH法檢測GSH-Px活性。

1.6 心肌細胞凋亡率測算 采用流式細胞術。將1.4各組心肌細胞在冰冷的PBS液中洗滌兩次，1 000 r/min離心10 min，然后加入100μL結合緩沖液?；旌虾?，添加5μL Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）。將心肌細胞在室溫下黑暗中孵育15 min，補充400μL結合緩沖液，并使用BD Pharmingen流式細胞儀測量細胞凋亡。FlowJo軟件分析凋亡數據。

1.7 心肌細胞抗B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）檢測 采用Western blotting法。將1.4各組心肌細胞在細胞裂解緩沖液中裂解以提取總蛋白。用12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離等量的蛋白質（50μg），然后將蛋白凝膠轉移到制備的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。選擇5%脫脂脫脂牛奶/TBST來封閉所有PVDF膜，膜與抗B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）和GAPDH一抗（1：1 000稀釋）在4℃孵育過夜，隨后與二抗一起孵育。以增強型化學發(fā)光試劑進行蛋白信號檢測。

1.8 lncRNA FGD5-AS1與miR-421靶向調控驗證 采用生物信息學預測與雙熒光素酶報告實驗。根據從LncBase Predicted v.2獲得的數據，預測出lncRNA FGD5-AS1部分核苷酸序列可與miR-421互補配對。分別擴增包括假定的miR-421結合序列的lncRNA FGD5-AS1兩種類型（野生型WT、突變體MUT）序列，然后將擴增的序列克隆到pMIR GLO載體中，以產生熒光素酶報告質粒WT-FGD5-AS1或MUT-FGD5-AS1。然后，使用Lipofectamine2000將熒光素酶報告質粒WT-FGD5-AS1或MUT-FGD5-AS1和miR-421或miR-NC共轉染。轉染后48 h，選擇雙熒光素酶活性測定系統評估每組熒光素酶活性。

1.9 統計學方法 使用SPSS22.0統計軟件。計量資料以±s表示，兩組間比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 缺氧/復氧對心肌細胞損傷的影響 H/R組lncRNA FGD5-AS1的相對表達量（0.45±0.04）低于Con組（1.00±0.06），miR-421的相對表達量（3.21±0.27）高于Con組（1.00±0.05），P均＜0.05。缺氧/復氧對心肌細胞損傷的影響見表1。

表1 缺氧/復氧對心肌細胞損傷的影響（±s）

表1 缺氧/復氧對心肌細胞損傷的影響（±s）

注：與Con組比較，*P＜0.05。

?

2.2 lncRNA FGD5-AS1過表達對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的影響 H/R+pcDNA組、H/R+pcDNAFGD5-AS1組lncRNA FGD5-AS1的相對表達量分別為0.42±0.04、1.78±0.14，H/R+pcDNA組與H/R+pcDNA-FGD5-AS1組相比，P＜0.05。lncRNAFGD5-AS1過表達對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的影響見表2。

表2 lncRNA FGD5-AS1過表達對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的影響（±s）

表2 lncRNA FGD5-AS1過表達對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的影響（±s）

注：與H/R+pcDNA組比較，*P＜0.05。

?

2.3 抑制miR-421表達對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的影響 H/R+anti-miR-NC組、H/R+anti-miR-421組mi R-421的相對表達量分別為1.00±0.05、0.30±0.03，兩者比較P＜0.05。抑制miR-421表達對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的影響見表3。

表3 抑制miR-421表達對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的影響（±s）

表3 抑制miR-421表達對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的影響（±s）

注：與H/R+anti-mi R-NC組比較，*P＜0.05。

?

2.4 lncRNA FGD5-AS1靶向調控miR-421的表達 WT-FGD5-AS1與miR-421共轉染的熒光素酶活性（0.51±0.04）低于WT-FGD5-AS1與miR-NC共轉 染（1.03±0.08），P＜0.05。MUT-FGD5-AS1與miR-421、miR-NC共轉染的熒光素酶活性分別為1.04±0.06、1.01±0.07，兩者相比差異無統計學意義。pcDNA-FGD5-AS1組、pcDNA組mi R-421相對表達量分別為0.35±0.04、1.00±0.06，兩者相比P＜0.05；si-FGD5-AS1組、si-NC組mi R-421相對表達量分別為2.99±0.22、1.01±0.04，兩者相比P＜0.05。

2.5 lncRNA FGD5-AS1、miR-421表達上調對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的作用 見表4。與H/R+pcDNA-FGD5-AS1+mi R-NC組（1.00±0.07）比較，H/R+pcDNA-FGD5-AS1+miR-421組心肌細胞miR-421相對表達量（2.61±0.22）增加（P＜0.05）。lncRNA FGD5-AS1、miR-421表達上調對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的影響見表4。

表4 lncRNA FGD5-AS1、miR-421表達上調對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的影響（±s）

表4 lncRNA FGD5-AS1、miR-421表達上調對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的影響（±s）

注：與H/R+pcDNA-FGD5-AS1+miR-NC組比較，*P＜0.05。

?

3 討論

心肌I/R損傷是一種常見的圍手術期并發(fā)癥，增加患者病死率。在缺氧期間，尤其是在復氧階段，氧化應激和活性氧的大量增加激活了線粒體的凋亡程序，觸發(fā)了半胱天冬酶的級聯反應，最終導致心肌細胞凋亡［7-8］。心肌細胞凋亡有助于心肌I/R損傷后心肌細胞的丟失并抑制左心室的重塑，并且心肌細胞凋亡的增加與心肌I/R損傷后心力衰竭的發(fā)生呈正相關［9］。因此，心肌細胞的凋亡是導致心肌I/R損傷后心力衰竭的關鍵促進因素［10］。抑制心肌細胞的凋亡對于預防和治療心肌I/R損傷具有重要意義。眾所周知，MDA是氧化應激標記，SOD和GSH-Px是抗氧化酶，檢查它們的水平可以評估細胞的氧化應激［11］。本項研究中，缺氧/復氧使心肌細胞中SOD活性、GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達減少，并使MDA含量、凋亡率、Bax蛋白表達增多，與之前研究［11］一致，表明缺氧/復氧處理心肌細胞成功誘導心肌I/R損傷。

lncRNA可以在表觀遺傳、翻譯或轉錄水平上調節(jié)基因的表達。越來越多的研究表明，lncRNA在心血管疾病的發(fā)病機制中，尤其是在心肌梗死和I/R損傷中起重要作用［12］。lncRNA不僅起miRNA海綿的作用，還通過調節(jié)下游靶點參與心肌細胞的自噬、細胞凋亡和壞死［13］。此外，組織特異性和穩(wěn)定表達的特性使lncRNA有望成為疾病診斷的生物標志物［14］。lncRNA FGD5-AS1是非小細胞肺癌［15］、結直腸癌［16］、口腔癌［17］等腫瘤的致癌因子，在癌癥中高表達，可以促進非小細胞肺癌的細胞增殖，結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，而抑制FGD5-AS1具有抑制口腔癌細胞生長、遷移和侵襲，但促進細胞凋亡的作用［15-17］。lncRNA FGD5-AS1在牙周炎中失調［18］，被確定為急性心肌梗死的關鍵lncRNA［19］，但lncRNA FGD5-AS1在心肌I/R損傷中的生物學功能仍不清楚。本研究發(fā)現，lncRNA FGD5-AS1在缺氧/復氧誘導的心肌細胞H9C2中表達下調。lncRNA FGD5-AS1過表達時，缺氧/復氧誘導的心肌細胞的MDA含量、凋亡率、Bax蛋白表達降低，SOD活性、GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達升高。這些數據支持lncRNA FGD5-AS1是心肌I/R的保護分子，其作用是通過減少細胞凋亡和改善氧化應激來發(fā)揮的。

lncRNA的已知功能包括轉錄調控、結合蛋白和mi RNA海綿，與各種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關。lncRNA上存在大量的miRNA結合位點，這些結合位點通過堿基互補與目標miRNA的特定序列特異性結合，從而充當miRNA海綿［20］，如miR-107［15］、miR-302e［16］是lncRNA FGD5-AS1促進 非小細胞肺癌、結直腸癌進展的功能性靶標。miR-421此前已被證明在腦I/R損傷中高表達，下調miR-421表達可減少神經功能缺損和梗死體積，并可下調MDA含量，上調SOD活性，促進髓樣細胞白血病-1和Bcl-2的表達，并下調缺血皮質中Bax的表達。下調miR-421表達通過抑制細胞凋亡和氧化應激減輕腦I/R損傷［21］。miR-421敲低導致缺氧/復氧誘導的H9c2細胞凋亡減少，乳酸脫氫酶和MDA水平降低以及SOD水平升高［5］。WANG等［22］證明miR-421通過靶向Pink1來調節(jié)線粒體片段化和心肌梗死。此外，使用antagomir敲低miR-421可抑制心肌細胞中的線粒體片段化和凋亡。本研究發(fā)現，缺氧/復氧誘導的心肌細胞中miR-421的表達上調，抑制miR-421表達可以降低缺氧/復氧誘導的心肌細胞的MDA含量、凋亡率、Bax蛋白表達，提高SOD活性、GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達，與前人研究［5］相符。基于生物學信息分析、熒光素酶報告測定和PCR的測定，本研究確定了lncRNA FGD5-AS1與miR-421的靶向關系。另外，上調miR-421表達后，lncRNA FGD5-AS1過表達對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的保護作用被逆轉，表現為共轉染pcDNA-FGD5-AS1和mi R-421提高缺氧/復氧誘導的心肌細胞的MDA含量、凋亡率、Bax蛋白表達，降低SOD活性、GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達。這說明在缺氧/復氧條件下，lncRNA FGD5-AS1對心肌細胞凋亡和氧化應激的調控作用是通過靶向miR-421來實現的。

總之，lncRNA FGD5-AS1在缺氧/復氧誘導的心肌細胞中下調，lncRNA FGD5-AS1過表達降低細胞凋亡，減輕氧化應激，其可能是lncRNA FGD5-AS1通過靶向調控mi R-421的表達實現的。這些結果為探索急性心肌梗死的新型分子靶向療法提供了有用的信息。