低共熔溶劑提取黃芩苷及其復(fù)合保鮮液在鮮肉中的應(yīng)用

魏夏夏，張曉虎，鄭 妍

（商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院/陜西秦嶺特色生物資源產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，陜西商洛 726000）

0 引言

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，人們對(duì)食品質(zhì)量安全要求越來越高，從開始追求“民以食為天”發(fā)展到“食以安為先”。食品添加劑被譽(yù)為“食品工業(yè)的靈魂”，在現(xiàn)代食品加工過程中功不可沒。天然食品防腐保鮮劑對(duì)人體無毒害作用，可以有效地防止微生物污染，避免食物腐敗變質(zhì)，從而減少食物的浪費(fèi)，開發(fā)天然食品保鮮劑已成為食品科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[1-3]。商洛因藥用植物資源豐富而被譽(yù)為“秦嶺藥庫”，但當(dāng)?shù)仄髽I(yè)卻未能將所收獲的藥材進(jìn)行全面深加工，現(xiàn)有相關(guān)產(chǎn)品較為單一，且對(duì)其利用率普遍較低。張曉虎等[4]采用超聲輔助乙醇提取商洛黃芩中漢黃芩素，在最優(yōu)提取條件下漢黃芩素提取率為0.526%。

研究表明，黃芩富含多種對(duì)人體健康有益的活性成分，具有抗炎[5]、抗病毒[6-8]、抗癌[9]等作用。其主要活性成分黃芩苷具有一定的生物活性，能夠抑制各種導(dǎo)致食品腐敗的微生物。劉昊等[10]研究表明7 mg/mL的黃芩苷能夠增加大腸桿菌細(xì)胞膜的通透性，使內(nèi)容物溢出導(dǎo)致細(xì)胞失活，從而達(dá)到抑制大腸桿菌的作用。目前，黃芩苷的提取主要包括水提法[11]、微波法[12]、超聲法[13]、CO2-超臨界流體萃取法[14]，對(duì)比發(fā)現(xiàn)微波提取是一種高效、綠色、提取率高的提取方法。目前采用DESs作為溶劑提取天然活性成分已經(jīng)受到越來越多國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[15-17]。

鑒于以上敘述，本研究采用微波輔助低共熔溶劑提取黃芩中的有效抑菌成分黃芩苷，復(fù)配殼聚糖、檸檬酸制成復(fù)合保鮮液并應(yīng)用于鮮肉保鮮?；贒ESs作為提取溶劑的優(yōu)點(diǎn)與微波技術(shù)的優(yōu)勢，以DESs作為提取溶劑輔助微波提取黃芩苷，旨在提高黃芩中黃芩苷的提取率，從而實(shí)現(xiàn)商洛黃芩的充分利用；采用響應(yīng)面法優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn)所得的3因素3水平結(jié)果，通過分析得到黃芩苷提取的優(yōu)化工藝參數(shù)，以期為黃芩苷的提取工藝提供參考依據(jù)。將黃芩苷復(fù)合保鮮液應(yīng)用于鮮肉保鮮，通過測定鮮肉的理化指標(biāo)評(píng)價(jià)復(fù)配保鮮劑對(duì)鮮肉品質(zhì)的影響，為肉類貯藏保鮮的實(shí)際應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 黃芩于2019年9月采挖于商洛市商州區(qū)黃芩基地；鮮肉購于商洛市商州區(qū)華潤萬家超市。

1.1.2 試劑 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)110715-201318，上海純優(yōu)生物科技有限公司，純度＞98%）；四丁基氯化銨、四辛基溴化銨、甲基三辛基氯化銨、甲基三辛基溴化銨、癸酸；檸檬酸、殼聚糖；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌（商洛學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

研究所用儀器列于表1。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 材料預(yù)處理 黃芩根清洗后于室溫風(fēng)干，40℃烘箱烘干，粉碎，過40目篩，備用。

1.3.2 DESs的合成與制備

（1）DESs的合成。稱取摩爾比分別為2:1、1:1、1:2的癸酸（DecA，作供氫體）與四丁基氯化銨(N4444-Cl)、四辛基溴化銨(N8888-Br)、甲基三辛基氯化銨(N8881-Cl)和甲基三辛基溴化銨(N8881-Br)（作受氫體）于圓底燒瓶中，加熱至澄清，過夜后得不同性質(zhì)的DESs。所合成的低共熔溶劑見表2。

表2 不同組分的低共熔溶劑

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精確稱定黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品50 mg于100 mL量瓶，乙醇定容至刻度線，得0.5 mg/mL的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)液于100 mL容量瓶中，乙醇定至刻度線，搖勻，在278 nm處測吸光度，以黃芩苷濃度作橫坐標(biāo)，吸光度作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出回歸方程，見圖1。

圖1 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

（3）微波輔助提取黃芩苷的溶劑篩選。稱取0.5 g黃芩粉末于燒杯中，加入10 mLDESs溶劑，參考文獻(xiàn)[18]實(shí)驗(yàn)條件，得黃芩苷粗提液，過濾后吸取1.0 mL于100 mL容量瓶中，乙醇定容，測吸光度，分別計(jì)算不同DESs提取黃芩苷的得率。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以黃芩苷的提取率為指標(biāo)，考察微波功率(500、600、700、800、900 W)、反應(yīng)時(shí)間(5、10、15、20、25 min)、反應(yīng)溫度(60、70、80、90、100℃)、液固比[10:1、15:1、20:1、25:1、30:1(mL:g)]對(duì)黃芩苷提取率的影響，以確定響應(yīng)面優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)因素及相應(yīng)水平。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 依據(jù)1.3.3單因素優(yōu)化結(jié)果，選用最佳DESs作為提取溶劑，以黃芩苷提取率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 抑菌實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)方法制備培養(yǎng)基[19]。挑取菌種于無菌水中，震蕩，制成菌懸液。向各滅菌后的培養(yǎng)基注入融化后的培養(yǎng)基，將菌懸液倒入混合，冷卻待用。將濾紙分別在不同濃度的黃芩苷溶液浸漬后，取出后放置于培養(yǎng)基。在37℃溫度條件下培養(yǎng)48 h后測量無菌圈的直徑。

1.3.6 復(fù)合保鮮液的配制 取不同濃度的黃芩苷與1.5%殼聚糖、1%檸檬酸進(jìn)行復(fù)配，將研制的復(fù)合保鮮液用于鮮肉的防腐保鮮實(shí)驗(yàn)，通過測定有關(guān)理化指標(biāo)，檢驗(yàn)其保鮮效果。

取鮮肉，均勻分為5組，用無菌水清洗后分別進(jìn)行5個(gè)實(shí)驗(yàn)處理。處理1，對(duì)照組1(CT)空白對(duì)照組；處理2，對(duì)照組2(VC-Na)0.05%抗壞血酸鈉；處理3，含0.1%黃芩苷的復(fù)合保鮮液；處理4，含0.2%黃芩苷的復(fù)合保鮮液；處理5，含0.3%黃芩苷的復(fù)合保鮮液。分別在制備的不同濃度的防腐保鮮液中浸泡5 min，分別置于無菌托盤上用保鮮膜密封，在40℃、相對(duì)濕度70%的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行保藏實(shí)驗(yàn)。

1.3.7 測定指標(biāo) pH測定參考GB 5009.237—2016的方法；參考GB/T 5009.228—2016根據(jù)消耗鹽酸的量計(jì)算揮發(fā)性鹽基氮的含量；過氧化值的測定參考GB 5009.227—2016中的滴定法，計(jì)算如式(1)。

式中，V1為試樣用去的Na2S2O3溶液體積，mL；V0為空白試樣用去的Na2S2O3溶液體積，mL；c為Na2S2O3溶液的濃度，mol/L；m為試樣的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同DESs對(duì)黃芩苷提取率的影響

在其他實(shí)驗(yàn)條件相同的條件下，比較合成的不同性質(zhì)的DESs對(duì)黃芩苷提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同低共熔溶劑的提取效果

結(jié)果表明，DES-1對(duì)黃芩苷提取率最高，為最優(yōu)提取溶劑，因此本實(shí)驗(yàn)最終選取DES-1為提取溶劑。推測是DESs-1能夠與黃芩苷分子之間形成較強(qiáng)的氫鍵，黃芩苷能夠更好地溶解在溶劑中，最終的提取率達(dá)到最高。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

單因素實(shí)驗(yàn)分別考察了提取時(shí)間、提取溫度、微波功率、液固比對(duì)黃芩苷提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選取微波功率700 W，提取時(shí)間10、15、20 min，提取溫度70、80、90℃，液固比15:1、20:1、25:1(mL:g)為各因素水平。

圖3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果 實(shí)驗(yàn)具體處理情況及結(jié)果如表3。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

2.3.2 回歸分析 黃芩苷提取率響應(yīng)面二次模型方差分析見表4，方差分析見表5。

表4 黃芩苷提取率響應(yīng)面二次模型方差分析表

表5 方差分析表

對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到黃芩苷提取率的回歸方程，如式(2)。

式中，Y為提取率，mg/g；A為提取溫度，℃；B為提取時(shí)間，min；C為液固比。

根據(jù)回歸方程可知，各因素影響黃芩苷提取率由大到小表現(xiàn)為提取時(shí)間＞液固比＞提取溫度。

由方差分析表可知模型P＜0.0001，該模型差異極顯著，可以用來預(yù)測工藝參數(shù)。自變量一次項(xiàng)提取時(shí)間B、液固比C，交互項(xiàng)AB、AC，二次項(xiàng)A2、B2、C2均差異極顯著；失擬項(xiàng)P=0.1073＞0.05，無失擬因素存在，因此可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。復(fù)合相關(guān)系數(shù)R2為0.9895，變異系數(shù)為1.11%，均說明模型擬合優(yōu)度較好。

2.3.3 響應(yīng)面分析 圖4反映了各因素影響黃芩苷提取率的交互作用。從圖中可以看出，在提取溫度一定時(shí)，黃芩苷提取率隨著提取溫度的升高，在13～18 min時(shí)達(dá)到最大，當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長，在提取溫度達(dá)到74～90℃時(shí)黃芩苷提取率達(dá)到最大；當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，隨著液固比的增大，黃芩苷提取率在18～25 mL/g時(shí)黃芩苷提取率達(dá)到最大，當(dāng)液固比一定時(shí)，黃芩苷提取率隨著提取時(shí)間的延長在12～17 min達(dá)到最大；當(dāng)提取溫度一定時(shí)，液固比在(18～25):1(mL:g)時(shí)黃芩苷提取率達(dá)到最大，當(dāng)液固比一定時(shí)，黃芩苷提取率隨提取溫度上升在76～90℃達(dá)到最大。

圖4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過響應(yīng)面軟件分析可知，黃芩苷提取實(shí)驗(yàn)最終的優(yōu)化工藝參數(shù)為提取時(shí)間15.63 min，提取溫度83.48℃，液固比為21.07:1(mL:g)時(shí)黃芩苷有最高得率為67.175 mg/g。結(jié)合實(shí)際情況，調(diào)整工藝條件為提取時(shí)間16 min，提取溫度85℃，液固比20:1(mL:g)，平行實(shí)驗(yàn)3次取平均值，黃芩苷提取率為66.99 mg/g，與預(yù)測結(jié)果基本一致，故該提黃芩苷的提取工藝參數(shù)可以用于實(shí)際。

2.4 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表6分析可知，黃芩苷對(duì)這2種菌均有抑菌效果。且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果大于大腸桿菌。隨著黃芩苷濃度的降低，抑菌圈直徑逐漸減小，其抑菌效果逐漸減弱。

表6 黃芩苷對(duì)大腸桿菌與金黃色葡萄球菌抑菌效果

2.5 復(fù)合保鮮液對(duì)鮮肉保鮮的影響

2.5.1 pH隨貯藏時(shí)間的變化 由圖5可知，在1～5天時(shí)間內(nèi)，5組樣品的pH均呈下降趨勢?？梢钥吹剑?組復(fù)合保鮮劑處理組的pH下降速度明顯低于2組對(duì)照組，表明該復(fù)合保鮮劑對(duì)鮮肉具有保鮮作用，能夠延緩鮮肉的腐敗作用。且經(jīng)復(fù)合保鮮劑處理的3組樣品中，黃芩苷濃度越大，pH下降的速率越低，說明樣品對(duì)鮮肉的保鮮效果與復(fù)合保鮮劑中黃芩苷的濃度呈正相關(guān)。

圖5 pH隨貯藏時(shí)間的變化

2.5.2 過氧化值隨貯藏時(shí)間的變化 由圖6可知，在1～5天內(nèi)，各組的過氧化值均呈上升趨勢。2～5天復(fù)合保鮮劑處理組和VC-Na組的過氧化值下降速度明顯低于空白對(duì)照組，表明該復(fù)合保鮮劑和VC-Na對(duì)鮮肉均具有保鮮作用。且經(jīng)復(fù)合保鮮劑處理的3組樣品中，黃芩苷濃度越大，過氧化值上升速率越低，說明樣品對(duì)鮮肉保鮮效果與復(fù)合保鮮劑中黃芩苷的濃度呈正相關(guān)。

圖6 過氧化值隨貯藏時(shí)間的變化

2.5.3 揮發(fā)性鹽基氮隨貯藏時(shí)間的變化 由圖7可知，在1～5天時(shí)間內(nèi)，各組樣品的揮發(fā)性鹽基氮值均呈上升趨勢。含0.20%和0.30%黃芩苷的復(fù)合保鮮劑與空白對(duì)照組對(duì)揮發(fā)性鹽基氮影響差異較大，表明含高濃度黃芩苷的復(fù)合保鮮劑能夠抑制蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生胺類和含氮物質(zhì)。比較這2組揮發(fā)性鹽基氮的差異可知，2組復(fù)合保鮮劑組抑制蛋白質(zhì)分解效果與黃芩苷濃度呈正相關(guān)。

圖7 揮發(fā)性鹽基氮隨貯藏時(shí)間的變化

3 討論

3.1 溶劑篩選

本研究首次應(yīng)用低共熔溶劑提取商洛黃芩中黃芩苷，與張曉虎等[20]采用乙醇提取商洛黃芩葉中黃芩苷相比提取率提高了4.33%；與Wang等[21]制備的9種疏水性季銨鹽類DESs，微波輔助DESs提取黃芩中的黃芩苷，其中癸酸-四丁基氯化銨N4444-Cl（物質(zhì)的量比為1:2）為最優(yōu)提取溶劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。王慧[18]合成了9種不同性質(zhì)的DESs用于山西當(dāng)?shù)攸S芩中黃芩苷的提取，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明當(dāng)癸酸與四丁基氯化銨摩爾比為1:2時(shí)，黃芩苷有最高提取率。原因可能是癸酸和四丁基氯化銨與提取的黃芩苷之間能夠形成穩(wěn)定的氫鍵[22-23]。低共熔溶劑與有機(jī)溶劑相比雖可提高提取物的提取率，但在實(shí)際的規(guī)模生產(chǎn)中具有一定的局限性，很難達(dá)到大規(guī)模的制備，且缺乏回收再生的方法，目前常用的再生方法主要包括大孔樹脂吸附、冷凍干燥、固相萃取等[24-26]，相比之下大孔樹脂吸附法具有操作簡單、成本低廉的優(yōu)勢。

3.2 微波提取

本研究采用微波輔助低共熔溶劑提取黃芩中黃芩苷，能夠有效提高黃芩苷的提取率，比楊威[27]采用超聲波提取黃芩中黃芩苷提取率高1%。從而使商洛黃芩得到充分利用，將為商洛地區(qū)黃芩苷提取提供技術(shù)參考。與邵紅等[28]采用微波提取黃芩中的黃芩苷相比，本研究黃芩苷的提取率低2.7%，由于微波實(shí)驗(yàn)設(shè)備的影響，本校實(shí)驗(yàn)室沒有專門的微波提取儀器，在實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)于提取溫度的控制均采用人工水浴控制，因此難免會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不利的影響。與韓建軍等[29]采用超聲-微波輔助提取黃芩中黃芩苷相比提取率降低了6.8%，由于超聲-微波法是將超聲和微波2種方法結(jié)合起來，既具備微波的優(yōu)點(diǎn)，又同時(shí)具備超聲的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)，能夠有效促進(jìn)黃芩苷的提取[30]。因此在后續(xù)研究條件允許的情況下，可以考慮將2種提取方法結(jié)合起來達(dá)到更優(yōu)提取效果。

3.3 抑菌實(shí)驗(yàn)

黃芩苷提取液濃度為100mg/mL時(shí)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為10.3 mm和14.1 mm，與張曉虎等[31]提取黃芩中的漢黃芩素對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在相同濃度下，黃芩苷對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果強(qiáng)于漢黃芩素。有學(xué)者將黃芩苷復(fù)配微生物制備防腐保鮮液用于食品保鮮[32]，可為后續(xù)研究提供新思路。本研究只是在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行黃芩苷的提取工藝，未對(duì)黃芩苷進(jìn)行分離和純化，只是對(duì)商洛黃芩粗提液進(jìn)行了簡單的抑菌實(shí)驗(yàn)研究和鮮肉保藏實(shí)驗(yàn)，因此在一定程度上可能會(huì)影響黃芩苷的抑菌效果[33]，后續(xù)對(duì)黃芩苷的分離純化的工藝有待進(jìn)一步研究。

3.4 保鮮應(yīng)用

近年來，開發(fā)植物源天然保鮮防腐劑用于食品保鮮已成為食品防腐劑的熱點(diǎn)之一[34-35]。Rafaela等[2]比較了黃芩提取液與其他中藥提取液對(duì)不同真菌的抑制作用，通過將黃芩提取液涂抹在紙質(zhì)包裝袋上，在一定條件下用于饅頭的保鮮。結(jié)果顯示黃芩提取液對(duì)真菌的抑制作用強(qiáng)于其他中藥提取液，且用含黃芩提取液的包裝袋包裝饅頭能有效延長饅頭貯藏期。李霞等[36]將9種香辛料應(yīng)用于豆筋的保鮮，結(jié)果顯示八角、丁香及辣椒對(duì)豆筋的保鮮效果最佳，能夠有效延長豆筋的貯藏期。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)最終選取DES-1為提取溶劑，得到黃芩苷最佳提取工藝參數(shù)，即提取時(shí)間16 min、液固比20:1(mL:g)、提取溫度85℃,黃芩苷有最高得率為66.99 mg/g。黃芩苷對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果大于大腸桿菌。黃芩苷濃度為100 mg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為14.1 mm，大腸桿菌為10.3 mm。隨著黃芩苷濃度的降低，其抑菌效果逐漸減弱，抑菌圈直徑逐漸減小。含有黃芩苷的復(fù)合保鮮劑能夠有效降低pH的下降速率以及過氧化值和揮發(fā)性鹽基氮的上升速率，能夠有效抑制鮮肉脂肪的氧化與蛋白質(zhì)的分解，且隨著含黃芩苷濃度的增大，保鮮效果提高。