葛根素通過(guò)circ-TLK1/miR-367-3p/TLR4抑制SK-N-SH細(xì)胞氧糖剝奪損傷

齊獻(xiàn)忠，邢英瀛，張小林，賈燕燕

南陽(yáng)市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河南 南陽(yáng) 473000

腦卒中是導(dǎo)致殘疾的主要原因，也是全球第2大常見的死亡原因[1]。約87%腦卒中病例為缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS），IS 的死亡率和致殘率一直處于較高水平[2]。有效保護(hù)神經(jīng)元損傷在IS防治中至關(guān)重要[3]。葛根素是從豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.) Ohwi 的根中提取的異黃酮苷類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[4]。葛根素被廣泛用于治療急性缺血性中風(fēng)、心臟病和其他全身性疾病[5-6]。環(huán)狀RNA（circRNA）通過(guò)微小RNA（miRNA）或與RNA 結(jié)合蛋白相互作用形成circRNA-miRNA-mRNA 復(fù)合物，在轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA 可能參與了IS 的發(fā)病過(guò)程，具有作為IS的新型診斷生物標(biāo)志物和分子治療靶點(diǎn)的潛力[8-9]。在IS 患者和動(dòng)物模型中，circ-絲氨酸/蘇氨酸蛋白擾動(dòng)樣激酶1（tousled-like kinase1，TLK1）表達(dá)明顯上調(diào)，敲除circ-TLK1能夠顯著減少腦梗死體積，減少缺血性神經(jīng)元損害并改善神經(jīng)功能缺損[10]。因此，本研究基于circ-TLK1 探究葛根素對(duì)IS 的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 SK-N-SH 購(gòu)自美國(guó)ATCC。

1.2 藥品與試劑

葛根素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)110752-201912）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號(hào)1912）購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；胎牛血清（批號(hào)SN201909）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑（批號(hào)L3000-015）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；MTT（批號(hào)MKBP6775V）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；circ-TLK1過(guò)表達(dá)載體及空載 Vector、circ-TLK1小干擾RNA（si-circ-TLK1）、siRNA 陰性對(duì)照（si-NC）、miR-367-3p模擬物（miR-367-3p mimics）、miR-367-3p抑制劑（miR-367-3p inhibitors）及相應(yīng)對(duì)照、Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒和空載pcDNA 均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20191120）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20190608）購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡試劑盒（批號(hào)MK1020）購(gòu)自日本Takara 公司；雙熒光素酶標(biāo)記試劑盒（批號(hào)E2920）、pmirGLO 載體（批號(hào)E1330）購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP，批號(hào)KT102-01）購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司；TLR4 單抗、HRP 標(biāo)記的IgG 二抗購(gòu)自美國(guó)CST 公司；RIPA 裂解液（批號(hào)P0013）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號(hào)PC0020）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器

CR21GⅡ型低溫高速離心機(jī)購(gòu)自日本日立公司；T-1186-340-LA 型超低溫冰箱購(gòu)自天地精儀科技；MAXM5 型多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美谷分子儀器；YXQ-LS-75G 型高壓滅菌鍋購(gòu)自諾基儀器；流式細(xì)胞儀購(gòu)自北京儀美信科技。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SK-N-SH 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基，于5% CO2、飽和濕度、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）對(duì)SK-N-SH 細(xì)胞存活率的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SK-N-SH 細(xì)胞，以2×104/孔接種于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后使用PBS 洗滌3 次，用不含血清、無(wú)糖的DMEM 培養(yǎng)基，于5% CO2、1% O2、94% N2、37 ℃的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6、12、24 h；將培養(yǎng)基更換成DMEM 高糖培養(yǎng)基，于5% CO2、飽和濕度、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，建立OGD 細(xì)胞模型[11]。加入100 μL MTT 孵育4 h，棄上清，加入二甲基亞砜（DMSO），振蕩至結(jié)晶完全溶解，采用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 處的吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SK-N-SH 細(xì)胞，以2×104/孔接種于6 孔板中，培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%時(shí)，按照試劑盒說(shuō)明書將circ-TLK1過(guò)表達(dá)載體及空載Vector、si-circ-TLK1（5’-GGACATCTCAAA- AAGGCAACA-3’）及si-NC、miR-367-3pmimics、miR-367-3pinhibitors 及相應(yīng)對(duì)照、TLR4過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒及空載pcDNA 轉(zhuǎn)染至SK-N-SH 細(xì)胞。

2.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SK-N-SH 細(xì)胞，以2×104/孔接種于6 孔板中，培養(yǎng)12 h，加入不同質(zhì)量濃度（20、40、80 μg/mL）的葛根素或用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，對(duì)照組加入不含藥物的無(wú)糖DMEM 培養(yǎng)基，于5% CO2、1% O2、94% N2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h；將培養(yǎng)基更換成DMEM 高糖培養(yǎng)基，于5% CO2、飽和濕度、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按“2.2”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

按“2.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，收集細(xì)胞，分別加入Annexin V-FITC 和PI 染液，孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.6 ELISA 法檢測(cè)上清液中IL-6 和TNF-α 水平

按“2.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，收集上清液，按ELISA 試劑盒說(shuō)明書測(cè)定IL-6 和TNF-α 水平。

2.7 qRT-PCR 檢測(cè) circ-TLK1 和 miR-367-3p mRNA 表達(dá)情況

按“2.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，收集細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書提取總RNA 并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR 分析。引物序列見表1，將U6作為miR-367-3p內(nèi)參，將GAPDH作為circ-TLK1內(nèi)參。

2.8 雙熒光素酶標(biāo)記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)熒光素酶活性

將包含miR-367-3p結(jié)合位點(diǎn)的circ-TLK1的野生型序列（WT-circ-TLK1）或不具有miR-367-3p 結(jié)合位點(diǎn)的突變體（MUT-circ-TLK1）插入pmirGLO載體，將質(zhì)粒與miR-367-3p mimics或miR-NC共轉(zhuǎn)染至SK-N-SH 細(xì)胞，采用雙熒光素酶標(biāo)記試劑盒考察熒光素酶活性。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2.9 RIP 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-367-3p 與circ-TLK1 和TLR4 結(jié)合關(guān)系

以預(yù)冷的PBS 洗滌SK-N-SH 細(xì)胞2 次，加入裂解液于冰上裂解，收集上清液，于 -80 ℃保存。制備重懸磁珠，加入IgG 或Ago2 抗體孵育，棄上清，以洗滌液洗滌3 次，加入免疫沉淀緩沖液，離心取上清，提取免疫沉淀的RNA，并通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)，以確認(rèn)結(jié)合靶點(diǎn)的富集水平。

2.10 Western blotting 法檢測(cè)TLR4 蛋白表達(dá)情況

按“2.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，收集細(xì)胞，加入RIPA 裂解液，提取蛋白，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，于5%脫脂牛奶封閉2 h，加入TLR4 抗體（1∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜；洗滌3 次后，加入HRP 標(biāo)記的IgG 二抗，孵育2 h，使用ECL 試劑盒顯色，采用Image J軟件分析。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 葛根素抑制OGD 所致的SK-N-SH 細(xì)胞損傷

如圖1-A 所示，隨著OGD 作用時(shí)間的延長(zhǎng)，SK-N-SH 細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），后續(xù)選擇12 h 作為OGD 的處理時(shí)間。如圖1-B～D 所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.001），凋亡率顯著升高（P＜0.001），IL-6 和TNF-α 水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，葛根素組細(xì)胞存活率顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001），細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.01、0.001），IL-6 和TNF-α 水平顯著降低（P＜0.01、0.001），表明葛根素對(duì)OGD 致細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，選擇40 μg/mL 葛根素進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 葛根素抑制OGD 所致的SK-N-SH 細(xì)胞損傷Fig.1 Puerarin inhibited SK-N-SH cells damage induced by OGD

3.2 過(guò)表達(dá)circ-TLK1 逆轉(zhuǎn)葛根素對(duì)OGD 所致的SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

如圖2 所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞circ-TLK1mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，葛根素組細(xì)胞circ-TLK1mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001），表明葛根素對(duì)OGD致SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與circ-TLK1的表達(dá)有關(guān)。轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)circ-TLK1后，細(xì)胞circ-TLK1mRNA 表達(dá)水平表達(dá)顯著升高（P＜0.001），細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01），IL-6 和TNF-α 水平顯著升高（P＜0.01、0.001），表明過(guò)表達(dá)circ-TLK1能夠逆轉(zhuǎn)葛根素對(duì)OGD 致SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

圖2 過(guò)表達(dá)circ-TLK1 逆轉(zhuǎn)葛根素對(duì)OGD 所致的SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用Fig.2 Overexpression of circ-TLK1 reversed protective effect of puerarin on SK-N-SH cells injury induced by OGD

3.3 葛根素通過(guò)circ-TLK1 靶向調(diào)控miR-367-3p對(duì)OGD 所致的SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

如圖3 所示，采用生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測(cè)circ-TLK1的下游靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)miR-367-3p和circ-TLK1間存在特異性靶向結(jié)合位點(diǎn)，提示miR-367-3p可能是circ-TLK1的直接靶點(diǎn)。采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和RIP 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-367-3p和circ-TLK1的靶向關(guān)系，結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-367-3p 組WT-circ-TLK1 熒光素酶相對(duì)活性顯著降低（P＜0.001），MUT-circ-TLK1 熒光素酶相對(duì)活性無(wú)明顯改變；與IgG 組相比，Ago2組miR-367-3p和circ-TLK1的富集水平均顯著升高（P＜0.001），表明miR-367-3p可通過(guò)結(jié)合位點(diǎn)與circ-TLK1特異性結(jié)合。

圖3 circ-TLK1 與miR-367-3p 靶向調(diào)控作用Fig.3 Targeted regulation of circ-TLK1 and miR-367-3p

與對(duì)照組相比，模型組miR-367-3pmRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001）；與si-NC 組相比，si-circ-TLK1組circ-TLK1mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001），miR-367-3pmRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與Vector組相比，circ-TLK1 組circ-TLK1mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001），miR-367-3pmRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），表明circ-TLK1能夠靶向負(fù)調(diào)控miR-367-3p的表達(dá)。

如圖4 所示，與對(duì)照組相比，模型組miR-367-3pmRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001）；與模型組相比，葛根素組miR-367-3pmRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001），表明葛根素對(duì)OGD 致SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與miR-367-3p的表達(dá)有關(guān)。通過(guò)轉(zhuǎn)染抑制miR-367-3p表達(dá)，結(jié)果顯示，與葛根素＋anti-miR-NC 組相比，葛根素＋anti-miR-367-3p 組miR-367-3pmRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001），細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.001），IL-6 和TNF-α 水平顯著升高（P＜0.001），表明抑制miR-367-3p能夠逆轉(zhuǎn)葛根素對(duì)OGD 致SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

圖4 葛根素通過(guò)促進(jìn)miR-367-3p 表達(dá)對(duì)OGD 致SK-N-SH 細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用Fig.4 Puerarin protected SK-N-SH cells from OGD induced damage by promoting miR-367-3p expression

3.4 葛根素通過(guò)miR-367-3p 靶向調(diào)控TLR4 對(duì)OGD 所致的SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

如圖5 所示，采用生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測(cè)miR-367-3p的下游靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-367-3p和TLR4間存在特異性靶向結(jié)合位點(diǎn)，提示TLR4可能是miR-367-3p的直接靶基因。采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和RIP 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-367-3p和TLR4的靶向關(guān)系，結(jié)果顯示，與miR-NC 組相比，miR-367-3p組WT-TLR4 熒光素酶相對(duì)活性顯著降低（P＜0.001），MUT-TLR4 熒光素酶相對(duì)活性無(wú)明顯改變；與IgG 組相比，Ago2 組TLR4和circ-TLK1的富集水平顯著升高（P＜0.001），表明miR-367-3p可通過(guò)結(jié)合位點(diǎn)與TLR4特異性結(jié)合。

圖5 TLR4 和miR-367-3p 靶向調(diào)控作用Fig.5 Targeted regulation of TLR4 and miR-367-3p

與對(duì)照組相比，模型組TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001）；與miR-NC 組相比，miR-367-3p組miR-367-3pmRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001），TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001）；與 anti-miR-NC組相比， anti-miR-367-3p 組miR-367-3pmRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001），表明miR-367-3p能夠靶向負(fù)調(diào)控TLR4表達(dá)。

如圖6 所示，與對(duì)照組相比，模型組TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組相比，葛根素組TLR4蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001），表明葛根素對(duì)OGD 致SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與TLR4 表達(dá)有關(guān)。通過(guò)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)TLR4，結(jié)果顯示，與葛根素＋pcDNA 組相比，葛根素＋TLR4 組TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001），細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.001），IL-6 和TNF-α 水平顯著升高（P＜0.001），表明過(guò)表達(dá)TLR4能夠逆轉(zhuǎn)葛根素對(duì)OGD致SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

圖6 葛根素通過(guò)抑制TLR4 表達(dá)對(duì)OGD 致SK-N-SH 細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用Fig.6 Puerarin protected SK-N-SH cells from OGD induced damage by inhibiting TLR4 expression

3.5 葛根素通過(guò)調(diào)控 circ-TLK1/miR-367-3p/ TLR4 抑制OGD 所致的SK-N-SH 細(xì)胞損傷

如圖7 所示，與對(duì)照組相比，模型組TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001）；與si-NC 組相比，si-circ-TLK1 組TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001）；與si-circ-TLK1＋anti-miR-NC 組相比，si-circ-TLK1＋anti-miR-367-3p 組TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，葛根素組TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001）；與葛根素＋Vector 組相比，葛根素＋circ-TLK1 組TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001）；與葛根素＋anti-miR-NC 組相比，葛根素＋anti-miR-367-3p 組TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。

圖7 葛根素對(duì)circ-TLK1/miR-367-3p/TLR4 的調(diào)控作用Fig.7 Regulatory effect of puerarin on circ-TLK1/miR-367-3p/TLR4

4 討論

IS 為危害我國(guó)中老年人健康及生活質(zhì)量的主要疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率及高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，葛根中的葛根素可以改善血液循環(huán)并減少心血管和腦血管疾?。桓鸶啬軌驕p少腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元損傷，并降低腦卒中神經(jīng)細(xì)胞損傷過(guò)程[14-17]。本研究發(fā)現(xiàn)葛根素可以有效提高OGD 誘導(dǎo)的SK-N-SH 細(xì)胞存活率，降低細(xì)胞凋亡率，降低IL-6 和TNF-α 水平，表明葛根素對(duì)IS 神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

CircRNA 在組織中特異性表達(dá)，具有高度同源性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等特點(diǎn)[18-19]。本研究結(jié)果顯示，OGD誘導(dǎo)的SK-N-SH 細(xì)胞中circ-TLK1mRNA 表達(dá)水平顯著升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]；葛根素顯著下調(diào)circ-TLK1mRNA 表達(dá)，過(guò)表達(dá)circ-TLK1能夠逆轉(zhuǎn)葛根素對(duì)OGD 致SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，表明葛根素通過(guò)降低SK-N-SH 細(xì)胞中circ-TLK1表達(dá)，從而發(fā)揮抗腦卒中的作用。circRNA 通常被用作miRNA 的分子海綿來(lái)調(diào)節(jié)mRNA 表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-367-3p具有明顯的抗IS 的作用[20]。本研究結(jié)果顯示，miR-367-3p為circ-TLK1的靶miRNA，circ-TLK1可以負(fù)向調(diào)節(jié)miR-367-3p表達(dá)；模型組SK-N-SH 細(xì)胞miR-367-3pmRNA 表達(dá)水平明顯降低，葛根素顯著上調(diào)miR-367-3pmRNA 表達(dá)，抑制miR-367-3p能夠逆轉(zhuǎn)葛根素對(duì)OGD 致SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，表明葛根素可能通過(guò)下調(diào)circ-TLK1表達(dá)并上調(diào)miR-367-3p表達(dá)，從而發(fā)揮抗腦卒中的作用。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)軟件搜索miR-367-3p的靶基因，并將TLR4 確認(rèn)為miR-367-3p的直接靶點(diǎn)。miR-497能夠通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4 和環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-responsive element-binding protein，CREB）信號(hào)傳導(dǎo)途徑減輕患者腦梗死[21]。miR-182-5p通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4 介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[22]。本研究結(jié)果顯示，模型組TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著降低，葛根素上調(diào)TLR4 蛋白表達(dá)，過(guò)表達(dá)TLR4能夠逆轉(zhuǎn)葛根素對(duì)OGD 致SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用；此外，circ-TLK1能夠通過(guò)結(jié)合miR-367-3p來(lái)調(diào)節(jié)TLR4 蛋白表達(dá)。以上結(jié)果表明，葛根素通過(guò)circ-TLK1/miR-367-3p/TLR4 軸抑制IS 中的神經(jīng)細(xì)胞損傷。

綜上，葛根素能夠有效提高IS 體外模型中SK-N-SH 細(xì)胞存活率，抑制細(xì)胞凋亡，減少炎性因子的分泌，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與調(diào)控circ-TLK1/miR-367-3p/TLR4 有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突