基于指紋圖譜及化學(xué)模式識別研究鹽制對五子衍宗丸化學(xué)成分的影響

廖宇嬌，敖明月，彭 穎，胡昌江，陳志敏，許潤春

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137

男性不育是困擾當(dāng)代夫婦的一大難題，已成為全球社會性疾病[1]。據(jù)歐洲生殖學(xué)會統(tǒng)計，育齡夫婦1年內(nèi)不能懷孕的占25%，其中男方因素占50%[2]。西醫(yī)在治療男性不育上缺乏特異性[3-4]；而中醫(yī)藥在治療男性不育方面理論基礎(chǔ)豐富，具有獨特的優(yōu)勢，針對不同病因病機的不育主要從益腎填精、健脾益氣、養(yǎng)血活血等方面進行診治[5]。近年來，中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合在治療男性不育方面愈發(fā)受重視。

五子衍宗丸（Wuzi Yanzong Pills，WYP）是中醫(yī)補腎益精的經(jīng)典名方，有“古今第一種子方”的美譽。現(xiàn)代研究表明，WYP 對生殖系統(tǒng)[6-8]、免疫系統(tǒng)[9]、神經(jīng)系統(tǒng)[10-12]均有較好的保護作用；臨床也多用WYP 及其加減方治療不育、少弱精子、性功能障礙等男性生殖系統(tǒng)疾病[13-16]，并且取得良好療效?！吨袊幍洹?020年版中WYP 由枸杞子、炒菟絲子、覆盆子、鹽車前子、蒸五味子組成[17]，中藥炮制理論認為“鹽，性味咸寒，鹽制可引藥下行，增強補肝腎作用”?！吨兴幣谥茖W(xué)辭典》[18]指出菟絲子鹽制后可去其溫燥之性，平補肝腎，并可增強補腎固澀之功；在《中藥制劑手冊》[19]收載的WYP中菟絲子要求鹽炙，以補腎填精；《得配本草》[20]中也要求菟絲子“淡鹽水拌炒”。現(xiàn)代研究表明覆盆子鹽制更適合于補腎益精[21]，《外科證治全生集》[22]和《時方妙用·時方歌括》[23]中分別有五味子“鹽水拌蒸”“鹽水浸炒”的記載。另外，根據(jù)計算，此3味藥鹽制后組成WYP 其鹽含量也不會給腎臟帶來負擔(dān)。WYP 中菟絲子、覆盆子、五味子是否也應(yīng)該采用鹽制，值得探討。

本課題組在前期工作中已分別進行了處方中幾味藥鹽制前后藥效差異研究，結(jié)果顯示鹽覆盆子鞣花酸含量增加，對腎陽虛多尿大鼠的醛固酮、尿量和腎臟指數(shù)的改善作用優(yōu)于生品[21]；鹽五味子在改善腎精虧虛大鼠卵泡刺激素、促黃體生成素等方面優(yōu)于生五味子、蒸五味子；對比研究枸杞子生品及鹽制品對腎陰虛大鼠的作用，差異不顯著，故枸杞子仍使用生品；此外，以復(fù)方為研究對象，研究顯示W(wǎng)YP 中藥物鹽制后組方可增強復(fù)方補腎生精的療效[24-25]。在此基礎(chǔ)上，本研究從指紋圖譜變化入手，通過建立WYP 全生品組（5 味藥均為生品）、藥典組（按藥典規(guī)定方法進行炮制）、鹽制組（除枸杞子外，其余4 味藥用鹽水炮制）指紋圖譜，對比分析不同組化學(xué)成分差異，以期為WYP 中如何選用藥物炮制品提供一定的參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UltiMate 3000 高效液相色譜儀，Thermo Fisher Scientific 公司；BP110S 十萬分之一分析天平，德國Sartorius 公司；KQ-300E 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TW-2000W 可控調(diào)溫電爐，郫縣永信電器廠。

1.2 藥物及試劑

枸杞子（四川國強中藥飲片有限公司，批號19030105；四川新荷花中藥飲片有限公司，批號1907125、2008077）、菟絲子（四川新荷花中藥飲片有限公司，批號1808099、1907075、D2007005）、覆盆子（成都市都江堰春盛中藥飲片股份有限公司，批號170401；四川國強中藥飲片有限公司，批號19030101、18070103）、車前子（四川國強中藥飲片有限公司，批號18080104；四川新荷花中藥飲片有限公司，批號1909008、2002042）、五味子（四川新荷花中藥飲片有限公司，批號1810092、1907085、2008093），以上藥材均經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)胡昌江教授鑒定，分別為茄科枸杞屬植物寧夏枸杞Lycium barbarumL.的干燥成熟果實、旋花科菟絲子屬植物南方菟絲子Cuscuta australisR.Br.的干燥成熟種子、薔薇科懸鉤子屬植物華東覆盆子Rubus chingiiHu 的干燥果實、車前科車前屬植物車前Plantago asiaticaL.的干燥成熟種子、木蘭科五味子屬植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實。

對照品綠原酸（批號110753-202018，質(zhì)量分數(shù)≥96.1%）、金絲桃苷（批號111521-201809，質(zhì)量分數(shù)≥94.9%）、五味子醇甲（批號 110857- 201815，質(zhì)量分數(shù)≥99.7%）、山柰酚（批號110861- 202013，質(zhì)量分數(shù)≥93.2%）、毛蕊花糖苷（批號111530-201914，質(zhì)量分數(shù)≥95.2%）、異槲皮苷（批號111809-201804，質(zhì)量分數(shù)≥97.2%）均購于中國食品藥品檢定研究院；對照品鞣花酸（批號CHB-R-039，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、紫云英苷（批號CHB-Z-050，質(zhì)量分數(shù)≥98%）均購于成都克洛瑪生物科技有限公司。乙腈，色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司；甲醇，色譜純，Sigma Aldrich 公司；甲醇、磷酸，分析純，購于成都市科隆化工試劑廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[26]

Agilent 5TC-C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.4%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，5%～15%乙腈；5～10 min，15%～17%乙腈；10～25 min，17%乙腈；25～35 min，17%～26%乙腈；35～60 min，26%～56%乙腈；柱溫40 ℃；體積流量1.0 mL/min；檢測波長254 nm；進樣5 μL。

2.2 藥物的炮制

菟絲子、覆盆子、車前子、五味子的炮制均按照文獻方法進行[26]。

2.2.1 炒菟絲子 取凈菟絲子，文火炒至微黃，取出，放涼。

2.2.2 鹽菟絲子 取凈菟絲子，加入鹽水拌勻，待鹽水吸盡后，至炒制容器內(nèi)，文火炒至微鼓起，取出，放涼。每100 克菟絲子，用食鹽2 g。

2.2.3 鹽覆盆子 取凈覆盆子，加入鹽水拌勻，悶潤，待鹽水吸盡后，至蒸制容器內(nèi)蒸至透心，取出，干燥。每100 克菟絲子，用食鹽2 g。

2.2.4 鹽車前子 取凈車前子，置炒制容器內(nèi)，文火炒至起爆裂聲時，噴灑鹽水，炒干，取出，放涼。每100 克菟絲子，用食鹽2 g。

2.2.5 蒸五味子 取凈五味子，至蒸鍋內(nèi)，用蒸汽加熱至黑色，取出，干燥。

2.2.6 鹽五味子 取凈五味子，加入鹽水拌勻，悶潤，待鹽水吸盡后，置炒制容器內(nèi)，文火炒干，取出，放涼。每100 克菟絲子，用食鹽2 g。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸、鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、毛蕊花糖苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚、五味子醇甲對照品適量于5 mL 量瓶中，加入甲醇溶解定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為0.410、0.436、0.480、0.400、0.458、0.412、0.526、0.408、0.432 mg/mL 對照品儲備液。分別吸取上述對照品儲備液240、300、240、80、240、130、50、80、80 μL 至5 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.3.2 WYP 供試品溶液的制備 將不同批號的5味藥材隨機組合成15 個不同批次的WYP（全生品組、藥典組、鹽制組同一批次為同一批號藥物不同炮制品的組合），WYP 各組藥物炮制情況及15 個批次的藥物批號信息分別見表1、2。將枸杞子、菟絲子、覆盆子、車前子、五味子粉碎成細粉，過80目篩，按8∶8∶4∶2∶1 的比例混勻，備用；取2 g，精密稱定，置干燥潔凈的具塞錐形瓶中，加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，回流提取60 min，取出，冷卻至室溫，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得WYP 全生品組供試品溶液，記為S1～S15。同法制得15 個批次藥典組（記為YD1～YD15）、鹽制組（記為YZ1～YD15）供試品溶液。

表1 各組WYP 中藥味炮制情況Table 1 Processing of WYP in each group

表2 15 批WYP 中藥味組成批號信息Table 2 Batch number information of 15 batches of WYP

2.3.3 WYP 中單味藥材及各缺藥材陰性樣品供試品溶液的制備 分別稱取“2.3.2”項下比例的各單味藥材以及缺藥材陰性樣品，置不同干燥潔凈的具塞錐形瓶中，按“2.3.2”項下方法制備單味藥材供試品溶液及缺藥材陰性樣品供試品溶液。

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取同一WYP（S1）供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，每次進樣5 μL，連續(xù)進樣6 次，記錄HPLC 圖，以金絲桃苷為參照峰（為君藥菟絲子中成分，且保留時間適中，峰面積較大，分離度良好），計算得到各共有色譜峰相對保留時間的RSD 值為0.011%～0.052%，相對峰面積的RSD值為1.02%～2.79%，表明該儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗 按“2.3.2”項下方法平行制備WYP（S1）供試品溶液6 份，按“2.1”項下色譜條件，分別進樣5 μL，記錄HPLC 圖，以金絲桃苷為參照峰，計算得到各共有色譜峰相對保留時間的RSD 值為0.016%～0.100%，相對峰面積的RSD 值為0.45%～2.70%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一WYP（S1）供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，依次于制備后0、2、4、8、12、24 h 進樣5 μL，記錄HPLC 圖，以金絲桃苷為參照峰，計算得到各共有色譜峰相對保留時間的RSD 值為0.008%～0.024%，相對峰面積的RSD 值為0.31%～2.70%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 WYP 中藥物鹽制前后組方的HPLC 指紋圖譜的建立

2.5.1 HPLC 指紋圖譜的建立 取“2.3.2”項下15個批次的全生品組、藥典組、鹽制組的WYP，按“2.1”項下色譜條件，分別進樣5 μL，得到HPLC圖，將所得圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012.130723 版）軟件，以S1 圖譜為參照圖譜，時間窗寬度設(shè)置為0.1 s，采用中位數(shù)生成方法，進行多點校正和全譜峰匹配，生成WYP 全生品組、藥典組、鹽制組指紋圖譜及相應(yīng)的對照圖譜，共確定了18 個共有峰，見圖1。

以對照指紋圖譜為參照，計算得到15 批全生品組的WYP 樣品指紋圖譜相似度分別為0.959、0.949、0.972、0.963、0.936、0.966、0.939、0.962、0.956、0.954、0.943、0.954、0.910、0.963、0.950；15 批藥典組的WYP 樣品指紋圖譜相似度分別為0.987、0.963、0.969、0.985、0.964、0.975、0.966、0.967、0.989、0.965、0.988、0.948、0.963、0.970、0.985；15 批鹽制組的WYP 樣品指紋圖譜相似度分別為0.993、0.992、0.989、0.996、0.990、0.993、0.994、0.990、0.993、0.992、0.989、0.995、0.994、0.995、0.994；各組指紋圖譜相似度均大于0.9，相似度良好，表明所建立的WYP 全生品組、藥典組、鹽制組指紋圖譜質(zhì)量穩(wěn)定，可以反映其基本特征。

圖1 WYP 全生品組 (A)、藥典組 (B)、鹽制組 (C) 指紋圖譜及混合對照品色譜圖 (D)Fig.1 Fingerprints of WYP of whole-raw group (A), pharmacopoeia group (B), salt-water processing group (C) and HPLC chart of mixed reference substances (D)

經(jīng)對照品比較指認了其中9 個共有色譜峰，分別是綠原酸（5 號峰）、鞣花酸（10 號峰）、金絲桃苷（11 號峰）、異槲皮苷（12 號峰）、毛蕊花糖苷（13號峰）、紫云英苷（14 號峰）、槲皮素（15 號峰）、山柰酚（17 號峰）、五味子醇甲（18 號峰）。

2.5.2 共有色譜峰的指認與歸屬性分析 取“2.3.3”項下枸杞子、菟絲子、覆盆子、車前子、五味子單味藥以及各缺藥材陰性樣品供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別進樣5 μL，得到HPLC 圖，WYP 樣品、單味藥材及缺藥材陰性樣品HPLC 圖見圖2。通過與WYP 全方HPLC 圖進行比對，其中2 號峰歸屬于枸杞子，3、5（綠原酸）、7、9、11（金絲桃苷）、12（異槲皮苷）、14（紫云英苷）、15（槲皮素）、17（山柰酚）號峰歸屬于菟絲子，4、6、8、10（鞣花酸）、16 號峰歸屬于覆盆子，13（毛蕊花糖苷）號峰歸屬于車前子，18（五味子醇甲）號峰歸屬于五味子，1 號峰歸屬于覆盆子和五味子，4號峰歸屬于枸杞子和覆盆子。

圖2 WYP 全生品組、藥典組、鹽制組樣品 (E) 和各單味藥及陰性樣品 (F) 的HPLC 圖Fig.2 HPLC chart of WYP sample of whole-raw product group, pharmacopoeia group, salt-water processing group (E) and each single herb and negative samples of WYP (F)

2.6 化學(xué)模式分析

2.6.1 方差分析 將15 批全生品組、藥典組、鹽制組WYP 樣品18 個共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 19.0 數(shù)據(jù)分析軟件，進行單因素方差分析[27]，結(jié)果見表3。分析發(fā)現(xiàn)，藥物炮制后組方WYP 大部分共有峰峰面積發(fā)生變化，其中藥物鹽制后組方變化更加明顯；與全生品組比較，藥典組除峰1、4、6、10、16 外均有顯著性差異，鹽制組除峰16 外均有顯著性差異；與藥典組比較，鹽制組除峰2、4、13、14、16外均發(fā)生明顯改變；綜合比較，藥物炮制前后組方WYP 峰3、5、7～9、11、12、17、18 差異較大。

2.6.2 聚類分析 采用SPSS 19.0 數(shù)據(jù)分析軟件，以15 批全生品組、藥典組、鹽制組WYP 樣品18個共有峰峰面積為變量，采用組間連接法，以平方歐氏距離為測度進行系統(tǒng)聚類，聚類結(jié)果見圖3。從聚類結(jié)果來看，平方歐式距離為15 時，15 批全生品組樣品（S1～S15）聚為一類，15 批藥典組樣品（YD1～YD15）聚為一類，15 批鹽制組樣品（YZ1～YZ15）聚為一類，表明不同炮制品組方WYP 在化學(xué)成分含量上差異較大。

表3 15 批不同炮制品組方WYP 中18 個共有峰峰面積方差分析結(jié)果 (± s, n = 15)Table 3 Results of variance analysis of common peak area shared by 15 batches of different processed products of WYP (± s, n = 15)

表3 15 批不同炮制品組方WYP 中18 個共有峰峰面積方差分析結(jié)果 (± s, n = 15)Table 3 Results of variance analysis of common peak area shared by 15 batches of different processed products of WYP (± s, n = 15)

與全生品組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與藥典組比較：▲P＜0.05 ▲▲P＜0.01*P < 0.05 **P < 0.01 vs whole-raw product group; ▲P< 0.05 ▲▲P < 0.01 vs pharmacopoeia group

共有峰 全生品組共 有峰峰藥面典積組/( m AU·min-1鹽) 制組 共有峰 全生品組 共 有峰峰藥面典積組/( m AU·min-1)鹽 制組 1 0.48±0.24 0.59±0.33 1.33±0.18**▲▲ 10 24.02±9.55 20.89±4.91 38.36±5.65**▲▲ 2 0.88±0.21 1.18±0.29* 1.21±0.38** 11 3.65±1.04 18.18±0.94** 9.65±1.74**▲▲ 3 2.63±0.36 6.35±0.56** 4.53±0.53**▲▲ 12 1.31±0.29 3.04±0.21** 1.85±0.31**▲▲ 4 4.48±0.71 5.36±1.30 5.49±0.31** 13 0.64±0.20 1.77±0.26** 1.85±0.36** 5 4.28±0.89 7.37±0.82** 5.07±0.62**▲▲ 14 2.11±0.71 1.17±0.26** 1.34±0.34** 6 5.80±3.31 4.84±1.38 3.04±1.68*▲ 15 0.31±0.27 0.86±0.36** 0.39±0.02▲▲ 7 2.54±0.58 10.87±0.47** 5.85±1.24**▲▲ 16 0.89±0.46 0.94±0.48 0.85±0.40 8 0.94±0.26 1.82±0.30** 1.17±0.33*▲▲ 17 0.69±0.13 0.27±0.03** 0.43±0.09**▲▲ 9 3.48±0.51 2.09±0.25** 2.45±0.41**▲ 18 2.61±0.14 1.87±0.28** 2.33±0.30*▲▲

2.6.3 主成分分析（PCA） 以15 批全生品組、藥典組、鹽制組WYP 樣品18 個共有峰峰面積為原始數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0 數(shù)據(jù)分析軟件對共有峰峰面積進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，再進行PCA，分析結(jié)果見表4、5 和圖4。以特征值大于1 為提取原則，共提取到4個主成分，累積貢獻率為83.51%，表明這4 個主成分包含了18 個共有成分83.51%的信息，可以反映樣品的主要特征，具有較好的代表性，見表4。由表4、5 可知，主成分1 特征值為8.911，方差貢獻率為49.508%，對應(yīng)峰3、5（綠原酸）、7、8、11（金絲桃苷）、12（異槲皮苷）、17（山柰酚）、18（五味子醇甲）有較高載荷，說明這8 個成分對第1 主成分的影響較大；主成分2 特征值為3.199，方差貢獻率為17.770%，對應(yīng)峰1、10（鞣花酸）、4 有較高載荷，說明這2 個成分對第2 主成分的影響較大；主成分3 特征值1.695，方差貢獻率為9.418%，對應(yīng)峰16 有較高載荷；主成分4 特征值1.227，方差貢獻率為6.814%，對應(yīng)峰2 有較高載荷。將15 批全生品組、藥典組、鹽制組WYP 樣品18 個共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件，繪制主成分得分圖，見圖4，其分類結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。

圖3 WYP 樣品的聚類分析Fig.3 Cluster analysis chart of samples of WYP sample

表4 特征值及方差貢獻率Table 4 Eigenvalues and contribution rates of cumulative variance

表5 初始因子載荷矩陣Table 5 Initial factor loading matrix

圖4 WYP 樣品的主成分得分圖Fig.4 Principal component score chart of samples of WYP

2.6.4 偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA） 以15 批全生品組、藥典組、鹽制組WYP 樣品18 個共有峰峰面積為變量，導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件，運行PLS- DA 程序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)累積解釋能力參數(shù)（R2X、R2Y）分別為0.714、0.898，預(yù)測能力參數(shù)（Q2）為0.836，均大于0.5，表明所建立的模型穩(wěn)定可靠、預(yù)測能力強，可用于區(qū)分不同炮制品組方的WYP；從圖5 可以看出15 批全生品組、藥典組、鹽制組WYP 樣品中，18 個共有峰峰面積數(shù)據(jù)點均落在95%置信區(qū)間內(nèi)，根據(jù)分布可分為3 類，與聚類分析、PCA 結(jié)果一致。

圖5 WYP 樣品的PLS-DA 得分圖Fig.5 PLS-DA score plot chart of samples of WYP

對建立的PLS-DA 模型進行200 次置換檢驗，結(jié)果見圖6。從圖中可以看出，右邊的R2和Q2值均大于0.9，均高于左邊的值，Q2回歸線的截距為負值，表明所構(gòu)建的PLS-DA 模型未出現(xiàn)過度擬合，預(yù)測能力較好，可以用來判別分析不同炮制品組方的WYP。根據(jù)變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值篩選影響藥物炮制前后組方WYP 化學(xué)成分差異的標(biāo)志性成分，結(jié)果見圖7，在95%置信區(qū)間內(nèi)，VIP 值越大，差異越顯著，對區(qū)別不同炮制品組方WYP 的貢獻越大。以VIP＞1 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出了9 個影響樣品分組的關(guān)鍵成分，根據(jù)VIP 值大小依次為峰1、13（毛蕊花糖苷）、10（鞣花酸）、7、4、11（金絲桃苷）、12（異槲皮苷）、3、5（綠原酸），說明這9 個成分對炮制前后組方的WYP 分類具有顯著影響，可作為WYP 炮制前后分別組方差異的主要潛在標(biāo)志物。

圖6 置換檢驗圖Fig.6 Chart of permutation test

圖7 WYP 樣品的VIP 值圖Fig.7 VIP values of samples of WYP

3 討論

在實驗條件摸索過程中，分別考察了提取溶劑 （甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇）、提取方法（超聲法和回流提取法）對供試品色譜峰數(shù)量、峰形、分離度、峰面積的影響，最終確定70%甲醇回流提取1.0 h 效果最佳?？疾觳煌鲃酉啵状?水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.3%磷酸水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液）、不同柱溫（25、30、35、40 ℃）、不同體積流量（0.6、0.8、1.0 mL/min）對分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)采用乙腈-0.4%磷酸水溶液、柱溫40 ℃、體積流量為1.0 mL/min 時，分離效果更好。采用DAD 檢測器對樣品進行全波長掃描，并結(jié)合《中國藥典》2020年版[17]波長條件，考察了樣品在波長210、254、280、320、360 nm 下HPLC 圖色譜峰分離度、峰形等的影響，最終檢測波長選擇254 nm。

本實驗在現(xiàn)有文獻研究的基礎(chǔ)上，對實驗方法進行了改良，建立了WYP 全生品組、藥典組、鹽制組指紋圖譜，通過相似度評價得到相似度均大于0.9，表明各批次WYP 間整體質(zhì)量較穩(wěn)定，標(biāo)記了18 個共有峰，通過對照品指認了其中9 個；比較全生品組、藥典組、鹽制組色譜峰數(shù)量及峰面積差異，未發(fā)現(xiàn)新的化學(xué)成分，但峰面積發(fā)生變化。結(jié)合課題組前期藥理實驗結(jié)果[24-25]，提示藥物炮制后組方WYP 可能通過改變復(fù)方中化學(xué)成分含量而增強補腎生精效果。

化學(xué)計量學(xué)在對大量樣本進行處理時可快速、全面地鑒別歸類，廣泛應(yīng)用于中藥鑒別、中藥炮制、組效關(guān)系等研究[28-31]。本實驗對不同批次不同炮制品組方的WYP 指紋圖譜共有峰峰面積進行方差分析，發(fā)現(xiàn)不同炮制品組方的WYP 在峰3、5、7～9、11、12、17、18 上差異較大；聚類分析發(fā)現(xiàn)WYP全生品組、藥典組、鹽制組各自聚為一類，說明不同炮制品組方的WYP 化學(xué)成分含量上差異較大，可初步推斷WYP 中藥物炮制后組方可影響復(fù)方的化學(xué)成分含量；PCA 篩選得到影響樣品分類的4 個主成分，從載荷值可以看出，峰1、3～5、7、8、10～12、17、18 是影響不同炮制品組方WYP 分類的主要成分；PLS-DA 從18 個共有峰中篩選出9 個差異標(biāo)志物，為峰1、3～5、7、10～13。綜合實驗結(jié)果，峰1、3～5、7、8、10～12、17、18 共11個成分可能是影響不同炮制品組方WYP 的差異性成分，明確了綠原酸、鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、山柰酚、五味子醇甲6 個成分，其余5 個成分還需要進一步借助LC-MS/MS、LC-Q-TOF-MS、NMR 等技術(shù)進行鑒別。

現(xiàn)代研究表明，金絲桃苷對精子活力有促進作用[32]，鞣花酸可減輕睪丸損傷，提高精子質(zhì)量[33-35]，本研究提示鞣花酸、金絲桃苷是產(chǎn)生不同炮制品組方WYP 差異的標(biāo)志性成分，從指紋圖譜看，WYP藥典組金絲桃苷峰面積增加，鞣花酸峰面積減少，鹽制組鞣花酸、金絲桃苷峰面積均增加，且鹽制組毛蕊花糖苷、紫云英苷、山柰酚、五味子醇甲的峰面積高于藥典組，推測WYP 中藥物炮制后組方可能通過促進復(fù)方化學(xué)成分的溶出，增強復(fù)方補腎益精作用，鹽制對WYP 中化學(xué)成分的影響更大，鹽制組可能更有優(yōu)勢。

綜上，本研究建立了不同炮制品組方WYP 指紋圖譜，通過化學(xué)識別初步分析了影響炮制前后組方化學(xué)成分的差異標(biāo)志性成分，實驗結(jié)果能夠較為全面地探討炮制對WYP 化學(xué)成分的影響。但復(fù)方化學(xué)成分復(fù)雜，本研究僅對炮制前后共有峰進行了分析，不夠深入，后期可加強對WYP 中化學(xué)成分的研究，對篩選出的11 個差異標(biāo)志物進行含量測定，并跟蹤這些成分的體內(nèi)過程，通過比較WYP中藥物炮制前后組方有效成分血中移行量、組織分布、代謝排泄等情況，探討炮制對復(fù)方化學(xué)成分體內(nèi)體外的影響，以期為中藥炮制理論“鹽制入腎，腎主生殖”提供依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突