近紅外技術(shù)快速測(cè)定水冬瓜根皮中紫丁香苷含量

韓忠耀，陳健，宋偉，楊政敏*，唐文雙，李仕外

1. 黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校（都勻 558000）；2. 浙江醫(yī)藥股份有限公司研究院（紹興 312500）

水冬瓜根皮來(lái)源于山茱萸科植物有齒鞘柄木Toricellia angulataOliv. var.intermedia（Harms）Hu的干燥根皮，別名大接骨丹、水五加等，被《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003版）收載[1]。在質(zhì)量控制方面，針對(duì)水冬瓜根皮藥材，可采用指紋圖譜技術(shù)及指標(biāo)性成分含量測(cè)定進(jìn)行質(zhì)量控制[2-3]。

近紅外光譜（Near infrared spectroscopy，NIR）法是收載于《中華人民共和國(guó)藥典》的藥品質(zhì)量控制新方法[4]，具有分析速度快、操作簡(jiǎn)便、無(wú)損、綠色等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于藥品[5-6]、食品[7-8]、農(nóng)藥殘留[9]、煙草[10]等領(lǐng)域。與藥品經(jīng)典的檢測(cè)方法如高效液相色譜法、氣相色譜法、紫外-可見(jiàn)分光光度法、化學(xué)分析法相比，該方法既可離線快速檢測(cè)藥品中的化學(xué)成分或有效成分的含量，又可在線實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)化開(kāi)展藥品質(zhì)量監(jiān)測(cè)，且不消耗有機(jī)溶劑，是一種綠色、無(wú)污染的快速分析新技術(shù)與新方法，應(yīng)用前景廣闊。課題組前期通過(guò)AOTF-NIR技術(shù)建立了水冬瓜根皮總黃酮與浸出物的快速定量分析模型[11]，而關(guān)于采用近紅外漫反射光譜法快速測(cè)定水冬瓜根皮中紫丁香苷含量的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

試驗(yàn)擬以水冬瓜根皮為研究對(duì)象，通過(guò)近紅外漫反射光譜法建立快速檢測(cè)水冬瓜根皮中紫丁香苷含量的NIR模型與快速質(zhì)量控制方法，為水冬瓜根皮快速質(zhì)量評(píng)價(jià)與檢測(cè)新方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 儀器與設(shè)備

Luminar 5030型AOTF-NIR儀（美國(guó)Brimrose公司，主要部件包括光學(xué)部分、控制部分、電源適配器。軟件包括SNAP!光譜處理軟件）；The Unscrambler化學(xué)計(jì)量學(xué)分析軟件（挪威CAMO公司）；Agilent 1260型高效液相色譜儀（DAD檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技公司）；FA1004B型電子天平（萬(wàn)分之一，溫州瑞昕?jī)x器有限公司）；Sartorius BT25S電子天平（十萬(wàn)分之一，德國(guó)塞多利斯公司）；烘箱（天津市泰斯特101-3AB型）；藥典篩（紹興市上虞張興紗篩廠）；WK-1000A高速粉碎機(jī)（濰坊市北方制藥設(shè)備制造有限公司）；水浴鍋。

1.1.2 試藥

紫丁香苷對(duì)照品（北京盛世康普化工技術(shù)研究院，20 mg/支，批號(hào)161214）；乙腈（康科德色譜試劑4 L，色譜純）；磷酸（AR 500 mL，萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠）；水為娃哈哈純凈水（浙江娃哈哈集團(tuán)有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.1.3 樣本采集

水冬瓜根皮藥材為自采，采集地點(diǎn)為貴州省都勻杉木湖溝渠（經(jīng)度107°30′52.33″E，緯度26°15′46.16″N，海拔807 m），自采樣本均經(jīng)韓忠耀副教授鑒定為山茱萸科植物有齒鞘柄木Toricellia angulataOliv. var. intermedia（Harms）Hu的根皮。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

取G1～G48批次水冬瓜根皮鮮藥材，經(jīng)烘箱55 ℃烘干，粉碎，過(guò)220 μm篩，混勻，即得。

1.2.2 光譜采集方法

應(yīng)用AOTF-NIR儀SNAP!光譜處理軟件建立光譜采集方法。波長(zhǎng)掃描范圍，1 100～2 300 nm；波長(zhǎng)增量，2 nm；測(cè)量方式，漫反射；增益調(diào)節(jié)，×1；樣品類型，int. Ref.；數(shù)據(jù)格式，透過(guò)率；掃描方式，比率模式；掃描累計(jì)次數(shù)，230次。

1.2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性條件

Agela Promosil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，進(jìn)樣量5 μL，柱溫35 ℃，流速1.0 mL·min-1，流動(dòng)相為0.5%-磷酸溶液（A）-乙腈（B），流動(dòng)相洗脫條件見(jiàn)表1，流動(dòng)相洗脫時(shí)間30 min。

表1 高效液相色譜流動(dòng)相洗脫條件

1.2.4 對(duì)照品溶液的制備

取適量紫丁香苷對(duì)照品，精密稱定，加入于25 mL量瓶中，取適量分析純甲醇，超聲溶解，再加入甲醇稀釋到刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為1.622 9 mg·mL-1的紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液[3]。

1.2.5 供試品溶液的制備

取1.2.1小節(jié)各批次樣品粉末，每份約0.5 g，精密稱定，用甲醇回流提取1 h，過(guò)濾，濾液分別用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，續(xù)濾液分別置于液相小瓶中，即得各供試品溶液。

1.2.6 方法學(xué)考察

1) 線性關(guān)系考察：參照文獻(xiàn)[3]方法，分別精密吸取0，0.5，1，2，3，4和5 mL 1.2.4小節(jié)的對(duì)照品儲(chǔ)備液于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋到刻度，按1.2.3小節(jié)色譜條件進(jìn)行分析。

2) 精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性試驗(yàn)：參照文獻(xiàn)[3]。

3) 加樣回收率試驗(yàn)：取6份已知含量的G1批次藥材提取液，精密加入適量紫丁香苷對(duì)照品溶液進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 NIR光譜預(yù)處理與數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件對(duì)紫丁香苷含量檢測(cè)理化值進(jìn)行處理。利用美國(guó)Brimrose公司SNAP!光譜處理軟件，對(duì)NIR光譜進(jìn)行預(yù)處理。利用挪威CAMO公司The Unscrambler化學(xué)計(jì)量學(xué)分析軟件關(guān)聯(lián)NIR光譜與紫丁香苷理化數(shù)據(jù)，構(gòu)建NIR定量PLS分析模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系考察結(jié)果

以紫丁香苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，以紫丁香苷HPLC峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為Y=6 814.4X-11.501，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 6，結(jié)果表明線性考察結(jié)果良好。

2.1.2 其他方法學(xué)考察結(jié)果

由表2可知，儀器的精密度與方法的重復(fù)性良好，同時(shí)供試品在36 h內(nèi)，穩(wěn)定性δRSD小于3%，表明供試品36 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

表2 方法學(xué)考察試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 加樣回收率試驗(yàn)

結(jié)果表明，紫丁香苷的平均加樣回收率為103.18%，且δRSD為2.72%，表明所建立的方法回收率良好。

2.2 NIR掃描結(jié)果

48批次水冬瓜根皮藥材近紅外漫反射光譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 48批次水冬瓜根皮藥材NIR光譜圖

2.3 近紅外定量校正模型的建立與驗(yàn)證

2.3.1 校正集與驗(yàn)證集的確定

將42批次水冬瓜根皮藥材作為校正集（G1～G42），6批次作為驗(yàn)證集（G43～G48）。

2.3.2 近紅外光譜預(yù)處理方法的選擇

為更好地建立水冬瓜根皮紫丁香苷近紅外快速質(zhì)量評(píng)價(jià)定量分析模型，通過(guò)相關(guān)系數(shù)（R）、校正均方根誤差（RMSEC）、預(yù)測(cè)均方根誤差（RMSEP）、預(yù)測(cè)相對(duì)偏差（RSEP）來(lái)考察模型性能。R越接近1表示模型的預(yù)測(cè)值與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照方法分析值之間的相關(guān)性越好；RMSEC和RMSEP的大小與樣品化學(xué)值相關(guān)，這兩個(gè)參數(shù)越小越接近，則表明模型性能越佳，預(yù)測(cè)精度越高；同時(shí)，RSEP越小越佳。不同光譜預(yù)處理方法見(jiàn)表3。

表3 不同光譜預(yù)處理方法對(duì)定量校正模型性能的影響

2.3.3 近紅外建模波段的選擇

根據(jù)表3，“Add constant+Smooth”為光譜的相對(duì)較佳預(yù)處理方式，為更好地降低冗余信息及降低噪聲干擾，采用Add constant+Smooth優(yōu)化水冬瓜根皮藥材中紫丁香苷含量測(cè)定最佳波段，波長(zhǎng)優(yōu)化條件見(jiàn)表4。

從表4可以看出，在1 100～2 200 nm波段，紫丁香苷近紅外校正模型的RMSEC與RMSEP相對(duì)較小且比較接近，相關(guān)系數(shù)R無(wú)顯著性差異，RSEP值最小，因此，結(jié)合表3和表4，最終確定NIR光譜預(yù)處理方式：1 100～2 200 nm波段下，采用Add constant+Smooth預(yù)處理NIR光譜，構(gòu)建水冬瓜根皮藥材紫丁香苷含量NIR快速定量分析模型。

表4 近紅外光譜波段優(yōu)化

2.3.4 紫丁香苷NIR定量校正模型的建立

按照2.3.2與2.3.3小節(jié)的建模優(yōu)化條件，將42批次水冬瓜根皮樣本作為校正集（G1～G42），6批次作為驗(yàn)證集（G43～G48），選擇1 100～2 200 nm波段，采用Add constant+Smooth方式對(duì)NIR原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，導(dǎo)入The Unscrambler化學(xué)計(jì)量學(xué)分析軟件，將G1～G42的光譜信息與樣品紫丁香苷含量理化參考值進(jìn)行數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，建立水冬瓜根皮樣本的紫丁香苷的偏最小二乘法（PLS）NIR校正集定量分析模型。結(jié)果顯示：RMSEC=0.935 9，RMSEP=1.191 0，RSEP=0.142 7，R=0.983 6。紫丁香苷的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的Matrix Plot圖見(jiàn)圖2，紫丁香苷預(yù)測(cè)值與真實(shí)值相關(guān)圖見(jiàn)圖3。

2.3.5 模型驗(yàn)證

將水冬瓜根皮驗(yàn)證集樣本G43～G48的NIR原始光譜經(jīng)2.3.2與2.3.3小節(jié)的建模優(yōu)化條件預(yù)處理后的uns格式光譜數(shù)據(jù)，導(dǎo)入The Unscrambler化學(xué)計(jì)量學(xué)分析軟件，對(duì)6批次樣品進(jìn)行模型預(yù)測(cè)，紫丁香苷定量模型的絕對(duì)誤差見(jiàn)表5，表明所建模型驗(yàn)證效果較好。

圖2 水冬瓜根皮的紫丁香苷預(yù)測(cè)值與真實(shí)值Matrix Plot圖

圖3 水冬瓜根皮的紫丁香苷預(yù)測(cè)值與真實(shí)值相關(guān)圖

表5 紫丁香苷模型預(yù)測(cè)結(jié)果

3 討論

紫丁香苷為水冬瓜根皮中的有效成分[12]，試驗(yàn)通過(guò)近紅外光譜法建立了其快速、無(wú)損、綠色的NIR定量分析模型，模型經(jīng)驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果理想。近紅外光譜法不僅可以用于水冬瓜根皮中紫丁香苷的含量測(cè)定，也可用于其真?zhèn)舞b別[13-15]。通過(guò)主成分分析（PCA）法建立正品水冬瓜根皮樣本的NIR模型，可以快速對(duì)偽品及摻雜品進(jìn)行快速定性判別分析，同時(shí)可采用正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)，相關(guān)問(wèn)題有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

試驗(yàn)以黔產(chǎn)水冬瓜根皮藥材（Toricellia angulataOliv. var. intermedia（Harms）Hu）為研究對(duì)象，通過(guò)近紅外漫反射光譜法與理化參考值數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，應(yīng)用挪威CAMO公司The Unscrambler化學(xué)計(jì)量學(xué)分析軟件，構(gòu)建了水冬瓜根皮藥材中紫丁香苷含量快速定量分析最小二乘（PLS）法近紅外光譜模型。該模型驗(yàn)證回收率高，相對(duì)誤差反映模型預(yù)測(cè)值與理化參考值的可信程度較高，實(shí)現(xiàn)了對(duì)水冬瓜根皮藥材無(wú)損、綠色、快速質(zhì)量評(píng)價(jià)，為黔產(chǎn)水冬瓜根皮中紫丁香苷快速分析提供了一種新方法，同時(shí)為食品、煙草、糧食、藥品等快速、綠色、無(wú)損檢測(cè)與分析提供借鑒與參考。

綜上所述，試驗(yàn)所建立的NIR快速檢測(cè)方法穩(wěn)定、可靠、簡(jiǎn)便，可用于水冬瓜根皮中紫丁香苷含量的快速檢測(cè)，生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用前景廣闊，為其快速質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供參考與思路。