張鑫,湯學英,崔亞楠,李明陽,雷舒涵,周鑫*
1. 唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心(唐山 063000);2. 河北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測技術(shù)創(chuàng)新中心(唐山 063000)
喹諾酮類藥物(Quinolones)是一類重要的人工合成廣譜抗菌藥[1-2],這類藥物的作用機制是通過抑制細菌DNA旋轉(zhuǎn)酶的活性,影響細菌的正常代謝和繁衍,因其良好藥效,被廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖等產(chǎn)業(yè)中[3]。但這類藥物及其代謝產(chǎn)物可以蓄積在動物體內(nèi),形成不同程度的藥物殘留。如果長期食用喹諾酮類藥物殘留超標的牛奶,可能會引起皮疹、過敏等應(yīng)激反應(yīng),影響人體腸道中正常菌群生長;低濃度的殘留藥物也可能誘導致病菌產(chǎn)生耐藥性,潛在危害人體健康[4]。中國從食品安全角度考慮,相繼出臺和頒布相關(guān)標準和公告,對禁用的喹諾酮類藥物和食品中的獸藥最大殘留限量提出相關(guān)要求[5-6]。
測定牛奶中喹諾酮類藥物殘留的主要方法有酶聯(lián)免疫法[7]、蛋白芯片法[8]、液相色譜法[9-10]、液質(zhì)聯(lián)用法[11-12]、化學發(fā)光法[1]、免疫層析法[13]等。已報道的方法雖然可對喹諾酮類藥物進行檢測分析,但在方法選擇性和定性能力方面仍存在不足[14]。線性離子阱質(zhì)譜(Q Trap)與三重四極桿質(zhì)譜的區(qū)別在于其具有多反應(yīng)監(jiān)測-信息關(guān)聯(lián)采集-增強子離子掃描(MRMIDA-EPI)的信息采集模式,MRM掃描的信號強度超過設(shè)定閾值時,采集模式將在短時間內(nèi)自動切換為線性離子阱模式進行增強子離子掃描(EPI),獲得對應(yīng)MRM通道中超過閾值的目標化合物的高質(zhì)量二級質(zhì)譜圖,該掃描模式響應(yīng)強度高,離子信息豐富,通過與譜庫檢索對比,實現(xiàn)一次進樣完成定性和定量分析[15-19]。
采用QuEChERS方法對牛奶樣品進行前處理,采用超高效液相色譜線性離子阱質(zhì)譜對喹諾酮類藥物進行分析,建立同時檢測牛奶中16種喹諾酮類藥物殘留的分析方法,為實驗室檢測提供技術(shù)依據(jù)。
16種喹諾酮類藥物混合標準品(諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依諾沙星、洛美沙星、沙拉沙星、萘啶酸、惡喹酸、氟甲喹、達氟沙星、雙氟沙星、司帕沙星、奧比沙星、氟羅沙星混合液標,天津阿爾塔公司);乙腈、甲酸(色譜純,德國默克公司);純凈水(杭州娃哈哈公司)。
QuEChERS凈化管(150 mg PLS-A,50 mg PSA,Dikma公司,15 mL ProElut QuEChERS)。
液相色譜儀(Shimadzu SIL-30A,日本島津公司);三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀(4000 Q TRAP,美國AB SCIEX公司);高速離心機(SORVALL LYNX 4000,美國賽默飛公司)。
取2.0 mL牛奶樣品,加入8.0 mL 0.2%甲酸乙腈,渦旋混合1 min,振蕩提取5 min,超聲提取5 min,以8 000 r/min離心5 min,取上清液待凈化轉(zhuǎn)移到15 mL QuEChERS凈化管,渦旋混合1 min,8 000 r/min離心5 min,取5.0 mL上清液于40 ℃氮吹至近干,用10%乙腈水溶液定容至1.00 mL,渦旋混勻,過0.22 μm微孔濾膜,上機待分析。
色譜柱采用ACQUITY UPLC BEH C18液相色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm,美國Waters公司);流速0.2 mL/min;進樣量5 μL;柱溫35 ℃;流動相A為0.1%甲酸水溶液,B為乙腈。梯度洗脫條件:0~2.0min,A保持在90%;2.0~6.0 min,A由90%下降到5%;6.0~9.0 min,A保持在5%;9.0~9.1 min,A由5%上升到90%;9.1~13.0 min,A保持在90%。
離子源采用電噴霧(ESI);檢測方式采用多反應(yīng)監(jiān)測-信息關(guān)聯(lián)掃描-增強子離子掃描(MRM-IDAEPI);掃描方式采用正離子掃描;離子源溫500 ℃;霧化氣50 psi;輔助氣50 psi;碰撞氣,高;噴霧電壓5 000 V;入口電壓10 V。
增強子離子掃描范圍50~400m/z,掃描速度4 000 Da/s;離子阱碰撞能量35±15 V;喹諾酮類藥物檢測離子對信息、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)見表1。
表1 喹諾酮類藥物的選擇離子及碰撞能量
選擇乙腈和甲醇作為有機相對喹諾酮藥物進行洗脫,比較發(fā)現(xiàn)甲醇可提升喹諾酮類藥物分離度;乙腈可使喹諾酮藥物的峰形更好,儀器響應(yīng)值高,提升檢測靈敏度。由于應(yīng)用MRM掃描,各目標化合物有各自的離子對信息,故條件優(yōu)化著重于響應(yīng)強度因素,使用乙腈作為流動相。選擇喹諾酮類藥物在質(zhì)譜掃描方式上均為正掃描,母離子為[M+H]+形式,故而在水相流動相選擇上用0.1%甲酸水溶液,以對流動相體系提供游離H+,提高目標化合物容易離子化效率,與此同時優(yōu)化質(zhì)譜的電壓、電位、氣流等參數(shù)。16種喹諾酮類藥物的色譜圖見圖1。
圖1 16種喹諾酮類藥物多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖
線性離子阱質(zhì)譜為離子阱質(zhì)譜的一種,其三重四極桿結(jié)構(gòu)的Q3有對感興趣的離子捕獲、阱集等功能。增強子離子掃描(EPI)與多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)的掃描模式通過信息關(guān)聯(lián)采集(IDA)連接,在MRM掃描的同時獲得目標化合物的特征性二級質(zhì)譜信息,增強了定性能力。將標準溶液進樣分析,采集到的EPI譜圖(圖2為達氟沙星標液EPI掃描譜圖),編輯入標準譜庫;對檢測樣品進行測定,觸發(fā)EPI掃描時,用采集到EPI譜圖進行譜庫檢索。結(jié)合保留時間和離子豐度比,疑似陽性樣品二級質(zhì)譜圖與譜庫中標準譜圖進行相似度比對,擬定purity數(shù)值大于70%時,疑似陽性樣品為目標化合物的檢出[20]。
圖2 達氟沙星的增強子離子掃描質(zhì)譜圖
采用外標法對牛奶中的喹諾酮類藥物進行定量分析。用空白牛奶基質(zhì)溶液配制不同梯度濃度的標液,上機進行測定,以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標擬合繪制標準曲線。結(jié)果表明,在2~100 ng/mL線性范圍內(nèi),各喹諾酮類藥物線性方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.99,呈現(xiàn)出良好線性關(guān)系。方法設(shè)定S/N>10為定量限,確定方法定量限為0.5~2 μg/L,結(jié)果見表2。
表2 喹諾酮類藥物線性方程相關(guān)系數(shù)、定量限以及方法回收率、精密度
取空白牛奶樣品,分別選擇2,10和50 μg/L這3種質(zhì)量濃度對其進行16種喹諾酮標準品添加,進行定量分析,計算添加回收率和精密度(n=6),結(jié)果見表2。
應(yīng)用QuECHERS-UHPLC-MRM-IDA-EPI方法對牛奶中16種喹諾酮類藥物殘留進行測定分析。方法操作安全、簡便、高效,且準確性、重復性好,在MRM掃描模式保證定量準確的同時,利用線性離子阱的阱集功能,高響應(yīng)強度的EPI二級質(zhì)譜圖和標準譜庫的對比加強對喹諾酮類藥物的定性功能,降低喹諾酮類藥物殘留檢測時出現(xiàn)假陽性的概率。