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    水力空化在不同pH下對大豆β-伴球蛋白理化性質(zhì)的影響

    2021-06-10 06:49:40馬瑩瑩任仙娥李春枝楊鋒黃永春閻柳娟
    食品工業(yè) 2021年5期
    關(guān)鍵詞:空化水性水力

    馬瑩瑩,任仙娥*,李春枝,楊鋒,黃永春,閻柳娟

    廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,廣西糖資源綠色加工重點實驗室,廣西高校糖資源加工重點實驗室(柳州 545006)

    大豆蛋白氨基酸組成合理,并具有良好的加工性能以及較低的成本,常作為重要的食品配料被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)。大豆蛋白的主要成分為11S(大豆球蛋白)和7S(β-伴球蛋白),其中β-伴球蛋白是一種糖蛋白,具有三聚體的分子結(jié)構(gòu),由α’-、α-和β-這3個亞基組成。大豆蛋白經(jīng)過適當(dāng)修飾改性后可獲得更好的功能性質(zhì),滿足不同類型食品體系的需求[1]。蛋白質(zhì)改性方法有物理改性和化學(xué)改性等方法,物理改性是通過改變蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)和分子間聚集方式使蛋白質(zhì)發(fā)生改性,具有無毒副作用、安全性高及對產(chǎn)品營養(yǎng)性質(zhì)影響較小等優(yōu)點而被廣泛使用??栈夹g(shù)作為近些年應(yīng)用在食品加工中的新的物理方法,引起國內(nèi)外很多學(xué)者的關(guān)注。

    水力空化作為一種新興技術(shù),具有和超聲空化相似的空化效應(yīng),在食品蛋白方面已有很多學(xué)者研究。Gregersen等[2]、Li等[3]的研究表明水力空化技術(shù)可降低牛奶蛋白濃縮物黏度,從而提高噴霧干燥效率,降低乳制品粉末的生產(chǎn)成本。Meletharayil等[4]研究發(fā)現(xiàn)水力空化可改善希臘酸奶的流變特性和微觀結(jié)構(gòu)。Pathania等[5]發(fā)現(xiàn)水力空化提高難以溶解的高蛋白奶粉再水化性能。可見,水力空化技術(shù)在一定條件下能改變食品蛋白質(zhì)的理化性質(zhì),進(jìn)而改善其產(chǎn)品品質(zhì)。前期研究發(fā)現(xiàn)單孔孔板水力空化可使大豆球蛋白的平均粒徑、暴露巰基含量和總巰基含量均減小,Zeta電位絕對值和表面疏水性均增加[6]。試驗進(jìn)一步研究水力空化處理對大豆蛋白中另一組分——大豆β-伴球蛋白理化性質(zhì)的影響,為該技術(shù)應(yīng)用于大豆蛋白改性提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    脫脂豆粕(益海嘉里(防城港)有限公司);乙二胺四乙酸二鈉(EDTA二鈉,西隴化工股份有限公司);1-苯胺-8-萘磺酸(ANS,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);十二烷基硫酸鈉(SDS,天津市大茂化學(xué)試劑廠);5, 5’二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB,國藥集團(tuán)化工試劑有限公司);三羥甲基氨基甲烷(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);福林酚(上海源葉生物有限公司)。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(上海圣科儀器設(shè)備有限公司);F97Pro型熒光分光光度計(天津港東科技發(fā)展股份有限公司);Avanti J-26 XPI高速冷凍離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特有限公司);Nano ZS90馬爾文納米粒度和Zeta電位分析儀(英國馬爾文儀器有限公司);T25高剪切混合乳化機(jī)(上海鑫鯊機(jī)械設(shè)備有限公司)。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 大豆β-伴球蛋白的制備

    參照Nagano等[7]的方法稍作修改。脫脂豆粕經(jīng)過粉碎后,用0.180 mm直徑的篩子過篩,得到脫脂大豆粉。稱取120 g豆粕粉并將其充分溶解于1.8 L去離子水中,用2 mol/L NaOH溶液將pH調(diào)至8.0。室溫低速攪拌2 h,離心(9 000g,10 min,4 ℃)棄沉淀,保留上清液。向上清液中加入NaHSO3(0.01 mol/L),充分溶解后用2 mol/L HCl溶液調(diào)pH 6.4。將所得料液放置于4 ℃的冰箱內(nèi)冷藏,靜置過夜后離心(9 000g,10 min,4 ℃),得沉淀大豆球蛋白(11S),向上清液中加入CaCl2固體(0.01 mol/L),充分溶解后用2 mol/L HCl溶液將pH調(diào)至5.0。將調(diào)好后的料液放入已加熱至45 ℃水浴鍋中靜置保溫30 min,保溫結(jié)束后將料液溫度降至25 ℃左右,用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 5.5。離心(9 000g,10 min,4 ℃)取上清液,上清液加等體積的去離子水(體積比1︰1),攪拌均勻后用2 mol/L HCl溶液調(diào)pH 4.8。在室溫下靜置2 h后離心(6 500g,10 min,4 ℃),所得沉淀即為大豆β-伴球蛋白。向大豆β-伴球蛋白沉淀中加入少量去離子水溶解,用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 7.0,充分?jǐn)嚢枞芙?。裝入經(jīng)過處理的透析袋中,放于4 ℃冰箱透析48 h,透析液經(jīng)真空冷凍干燥后裝入密封袋,放置冰箱凍藏備用。

    1.3.2 水力空化處理不同pH大豆β-伴球蛋白

    將大豆β-伴球蛋白配成4份質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的分散液于1 000 mL燒杯中,分別調(diào)pH至3,5,7和9,取800 mL倒入水力空化裝置的貯罐中,空化裝置圖同文獻(xiàn)[6],啟動裝置,開啟冷凝水使大豆β-伴球蛋白在整個處理過程中溫度不超過35 ℃,處理不同時間(0,10和30 min)后取樣測定其理化指標(biāo),每個指標(biāo)測3次。

    1.3.3 粒徑和Zeta電位的測定

    將空化處理后的蛋白質(zhì)離心(10 000 r/min,10 min,4 ℃)后稀釋至3 mg/mL,用0.45 μm的濾膜在室溫下采用納米粒度儀測定各樣品的粒徑。再取樣品測定其Zeta電位。測定條件:1 cm聚苯乙烯池,一對0.45 cm2鉑電極,間距0.4 cm,測定溫度25 ℃,平衡時間2 min。

    1.3.4 表面疏水性的測定

    參照Voutsinas等[8]的方法,以ANS為熒光探針,將蛋白樣品用0.2 mol/L、pH 8.0的磷酸鹽緩沖液稀釋至不同質(zhì)量濃度(0.005~0.5 mg/mL),取4 mL樣品,加入10 μL 8 mmol/L ANS溶液,混合均勻后,在熒光分光光度計下進(jìn)行測定。設(shè)定激發(fā)波長370 nm、發(fā)射波長490 nm、狹縫寬5 nm。以熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)量濃度作圖并進(jìn)行線性回歸,以線性回歸斜率作為蛋白質(zhì)的表面疏水性。

    1.3.5 乳化性的測定

    參考楊盛楠等[9]方法稍作修改。將蛋白樣品稀釋至3 mg/mL,取15 mL蛋白溶液,加入5 mL玉米油,在試管中加入5 mL的1 mg/mL的SDS備用,將蛋白溶液在均質(zhì)機(jī)下進(jìn)行均質(zhì)分散1 min,轉(zhuǎn)速10 000 r/min。均質(zhì)停止時直接從底部吸取50 μL的乳濁液加入到裝有SDS溶液的試管中,并將其充分混勻。靜置10 min之后再從均質(zhì)后的樣液的底部吸取50 μL加入到另一支裝有SDS溶液的試管中,使用紫外可見分光光度計在500 nm處測定吸光度。靜置前后所測得的吸光度用A0、A10表示。以SDS溶液作為空白對照。乳化活性指數(shù)(EAI,m2/g)和乳化穩(wěn)定性(ESI,min)分別按式(1)和(2)計算。

    式中:θ為用于形成乳液所用油相在溶液中所占體積比;C為蛋白質(zhì)濃度,g/mL;L為比色皿的厚度;DF為稀釋倍數(shù);A0為均質(zhì)停止時取樣測定的吸光度;A10為靜置10 min后取樣測定的吸光度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 粒徑分布

    大豆β-伴球蛋白在不同pH下的粒徑分布如圖1(A)所示。在所試pH下均呈多峰分布,其中在pH 5時有4個峰,1~100 nm處現(xiàn)3個峰,100~1 000 nm處1個峰;pH 3時有3個峰,分別在10~100,100~1 000和1 000~10 000 nm;pH 7和9時呈雙峰分布。由圖2可知,在pH 5時,平均粒徑最大,為213.07±4.24 nm;pH 7和9時,平均粒徑較小,分別為(18.30±4.41)nm和(15.11±0.22)nm。因為在溶液pH接近等電點(pI=4.8)時,分子間靜電斥力降低,發(fā)生聚集,所以平均粒徑較高。

    由圖1(B)可知,大豆β-伴球蛋白在pH 3時,水力空化處理后1 000~10 000 nm處的峰消失,10~100 nm處的峰向左偏移。pH 5時,處理后的粒徑分布如圖1(C)所示,100~1 000 nm處的峰均向左偏移,且處理30 min后在1 000~10 000 nm出現(xiàn)一個峰。從圖1(D)中可知,pH 7時水力空化處理對蛋白的粒徑分布無影響。pH 9時粒徑分布圖如1(E)所示,經(jīng)水力空化處理后10~100 nm處的峰強(qiáng)度增加,粒徑分布變窄。由圖2可知,pH 5時,其平均粒徑隨空化處理時間顯著減?。╬<0.05),處理30 min后蛋白的平均粒徑從(213.067±4.25)nm減小到(96.9±0.74)nm,這可能是由于空化效應(yīng),產(chǎn)生湍流和高剪切力,破壞蛋白分子間相互作用,大豆β-伴球蛋白的大聚集體逐漸被解離成小聚集體,從而導(dǎo)致平均粒徑顯著減小。王芳等[6]的研究結(jié)果表明單孔孔板水力空化處理可顯著降低大豆球蛋白的平均粒徑,處理30 min后大豆球蛋白的平均粒徑由(335.67±3.43)nm減小至(234.73±4.32)nm。Hu等[10]的研究結(jié)果表明高強(qiáng)度超聲處理40 min,7S球蛋白的平均粒徑從75.9 nm減小到51.8 nm。由此說明水力空化和超聲空化等物理改性具有相似的效果,均能引起蛋白質(zhì)分子中聚集體的解離,從而導(dǎo)致其平均粒徑減小。而在pH 3,7和9時,水力空化處理并未引起大豆β-伴球蛋白平均粒徑發(fā)生顯著變化(p>0.05)。

    圖1 水力空化對不同pH大豆β-伴球蛋白粒徑分布的影響

    2.2 Zeta電位

    蛋白質(zhì)的Zeta電位可以通過蛋白質(zhì)表面電荷的分布來體現(xiàn)[11]。通常,蛋白質(zhì)表面帶負(fù)電荷的氨基酸多于帶正電荷的氨基酸時,其Zeta電位為負(fù)值,反之則為正值。Zeta電位的絕對值越大,表明體系越穩(wěn)定[12]。由圖3可知,pH 3時,電位為正值,說明在酸性條件下蛋白質(zhì)表面帶正電荷的氨基酸多于帶負(fù)電荷的氨基酸。pH 5,7和9時電位為負(fù)值,且隨著pH的增加電位絕對值增大。

    大豆β-伴球蛋白經(jīng)水力空化處理后,其Zeta電位絕對值在pH 3和7時減小,pH 5和9時顯著增加(p<0.05)。Zeta電位絕對值增加可能是經(jīng)孔板水力空化處理后,蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)在一定程度上被破壞,分子展開帶負(fù)電荷的氨基酸殘基更多被暴露于蛋白分子表面而導(dǎo)致的。pH 5時平均粒徑減?。▓D2),聚集體發(fā)生解聚,更多帶負(fù)電荷的氨基酸殘基暴露出來,也使Zeta電位絕對值增加。Zeta電位絕對值減小是因為在pH 3和7時,經(jīng)水力空化處理后蛋白發(fā)生輕微聚集,帶電荷的基團(tuán)被掩埋導(dǎo)致Zeta電位絕對值減小??梢?,水力空化處理后大豆β-伴球蛋白分子結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變。

    圖2 水力空化在不同pH下對大豆β-伴球蛋白平均粒徑的影響

    圖3 水力空化對不同pH大豆β-伴球蛋白Zeta電位的影響

    2.3 表面疏水性

    表面疏水性是衡量蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的重要指標(biāo)之一[13],其大小是由疏水性基團(tuán)暴露的程度決定的。如圖4所示,pH 5時,表面疏水性最低(456.35±16.81),這是因為大豆β-伴球蛋白在疏水相互作用下形成聚集體,圖2中pH 5時蛋白平均粒徑最大也可印證這點。在pH>pI與pH<pI時,大豆β-伴球蛋白的表面疏水性均顯著增加(p<0.05),且pH 3時達(dá)到最大(1 944.71±150.16),說明遠(yuǎn)離等電點時埋藏在蛋白分子內(nèi)的疏水基團(tuán)暴露出來,使表面疏水性增加。

    大豆β-伴球蛋白在pH 3和9時經(jīng)水力空化處理后,表面疏水性無顯著變化(p>0.05),說明在pH 3和9時經(jīng)水力空化處理后暴露到蛋白質(zhì)表面的疏水性基團(tuán)無明顯變化,從圖2也知pH 3和9的平均粒徑無顯著變化(p>0.05)。pH 5和7時,水力空化處理10 min后表面疏水性顯著增加(p<0.05),說明有較多的疏水基團(tuán)暴露在蛋白質(zhì)分子表面,導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性增加。這可能是因為空化泡潰滅的瞬間產(chǎn)生高溫、高壓和高剪切力等,破壞蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)或者使大的聚集體解聚,導(dǎo)致蛋白分子之間形成的聚集體較少(圖2中平均粒徑減小可印證),進(jìn)一步暴露出包埋在β-伴大豆球蛋白分子中的疏水殘基。圖3中電位的絕對值增加也說明聚集體發(fā)生解離后更多疏水性殘基暴露,導(dǎo)致表面疏水性增加。

    圖4 水力空化對不同pH大豆β-伴球蛋白表面疏水性的影響

    2.4 乳化性

    評價蛋白質(zhì)乳化性的方法有乳化活性和乳化穩(wěn)定性等方法。水力空化對不同pH大豆β-伴球蛋白乳化活性與乳化穩(wěn)定性的影響如圖5所示。由圖5(A)可知,大豆β-伴球蛋白在pH 5時乳化活性較小,為(7.52±0.41)m2/g,遠(yuǎn)離等電點呈上升趨勢,這與表面疏水性變化趨勢一致(圖4)。這是因為在等電點附近蛋白平均粒徑最大(圖2),表面疏水性較低(圖4),蛋白難溶且靜電斥力減小,所以乳化活性較差,遠(yuǎn)離等電點蛋白大的聚集體發(fā)生部分解聚,粒徑減小,疏水性基團(tuán)暴露出來,蛋白親油性增強(qiáng),宏觀表現(xiàn)為乳化活性升高[14]。

    由圖5(A)可知,大豆β-伴球蛋白的乳化活性在pH 5,7和9時隨水力空化處理時間的延長而增加,在pH 7空化時間為30 min時達(dá)到最大(95.48±0.82 m2/g)。這是因為水力空化產(chǎn)生的空化效應(yīng)使蛋白結(jié)構(gòu)遭到破壞,蛋白分子的極性親水基團(tuán)與非極性疏水基團(tuán)暴露出來,親水性與親油性均增強(qiáng),親水性與親油性達(dá)到一定程度的平衡時,蛋白質(zhì)在油水界面具有較好的穩(wěn)定性,表現(xiàn)為乳化活性增強(qiáng)[15]。從圖5(B)中可見,大豆β-伴球蛋白經(jīng)水力空化處理后乳化穩(wěn)定性在pH 3和5時呈下降趨勢,而在pH 7空化10 min與pH 9空化30 min后乳化穩(wěn)定性增大。pH 3時的乳化穩(wěn)定性較低,可能是此時的蛋白質(zhì)粒徑比堿性條件下的粒徑大,粒子分布不均勻,導(dǎo)致穩(wěn)定性降低。

    圖5 水力空化對不同pH大豆β-伴球蛋白乳化性的影響

    3 結(jié)論

    大豆β-伴球蛋白的平均粒徑、Zeta電位、表面疏水性和乳化性等理化性質(zhì)隨著pH的改變而不同。水力空化處理在試驗所試pH下均可使其理化性質(zhì)發(fā)生變化,變化程度與其所處的pH有關(guān),以pH 5和7時較為明顯??梢姡栈瘏f(xié)同pH處理對大豆β-伴球蛋白的改性具有一定效果,這對將水力空化技術(shù)應(yīng)用到大豆蛋白的生產(chǎn)中有一定意義。關(guān)于水力空化在不同pH下對大豆β-伴球蛋白的二級結(jié)構(gòu)以及起泡性、凝膠性等功能性質(zhì)的影響有待進(jìn)一步研究。

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