不同品種石榴總有機酸含量及抗氧化活性

熱陽古·阿布拉，席茹潔，王琪

喀什大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院新疆特色藥食用植物資源化學(xué)實驗室（喀什 844000）

石榴（Pnnica granatumL.）為石榴屬（PunicaL.）植物，落葉灌木或小喬木，是一種集生態(tài)、經(jīng)濟、社會效益、觀賞價值與保健功能于一身的優(yōu)良果樹[1]。新疆是我國石榴產(chǎn)地之一，新疆石榴主要產(chǎn)于南疆的喀什、和田等地區(qū)，主要品種有甜石榴、酸石榴、甜酸石榴等?？κ驳貐^(qū)夏季氣候條件對石榴的生長發(fā)育有利，使得喀什石榴果實大而皮薄、營養(yǎng)豐富、耐貯藏[2]，具備開發(fā)前景。

石榴汁液中富含有機酸、氨基酸、糖類、脂類、生物堿、酚類和黃酮類化合物[3-5]。有機酸類可以軟化血管、延緩血管硬化，具有防老抗衰、抗菌、抗氧化等作用[6]。石榴有機酸組分以檸檬酸、蘋果酸、草酸為主，且含有少量抗壞血酸及酒石酸[7]。有機酸類成分測定分析方法主要包括指示劑法、電位滴定法、高效液相色譜法等，電位滴定法作為一種簡單、高效、快速的檢測方法，已被廣泛應(yīng)用[8]。吳曉紅等[9]用電位滴定法測定柑橘類水果總有機酸的含量時報道，該方法不僅可操作性強，而且既可以排除滴定過程中終點顏色變化判斷誤差和不均勻搖動誤差，也可以排除由于酸度計校正不準(zhǔn)確帶來的誤差，適合于其他種類水果總有機酸含量的準(zhǔn)確測定。國內(nèi)對石榴有效成分研究主要集中在黃酮類、多酚類及揮發(fā)油類[10]，石榴總有機酸類成分生理活性研究有關(guān)的文獻報道極少。采用電位滴定法測定3個品種喀什石榴果實汁液中總有機酸含量，并以總還原力和DPPH自由基、羥自由基的清除能力為指標(biāo)，評價各品種喀什石榴總有機酸的抗氧化活性，對尋找新型天然抗氧化劑、發(fā)現(xiàn)石榴新的藥理活性、資源開發(fā)及良種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

喀什酸石榴、喀什甜酸石榴、喀什甜石榴（均產(chǎn)于新疆喀什市伯什克然木鄉(xiāng)）。

1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、鐵氰化鉀、無水乙醇、三氯化鐵、乙酸乙酯、三氯乙酸、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、過氧化氫、濃鹽酸、氫氧化鈉、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、抗壞血酸（VC）等（均為國產(chǎn)分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004N電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；Spectrumlab22可見分光光度計（上海棱光技術(shù)有限公司）；HC.TP11B.5架盤藥物天平（北京醫(yī)用天平廠）；78-1磁力加熱攪拌器（金壇市醫(yī)療儀器廠）；TDL-5-A型離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SSW-600-2S電熱恒溫水槽（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；RE-5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 總有機酸的提取

稱取不同品種喀什石榴，去皮、除隔膜，去籽粒榨汁過濾得到石榴汁。在石榴汁中加入氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 11.5左右，滴加0.1 mol/L鹽酸溶液，加入飽和碳酸鈉溶液至溶液微堿性，用乙酸乙酯反復(fù)萃取至溶液沒有顏色，收集堿水液，用鹽酸酸化到溶液pH 2左右，再以乙酸乙酯反復(fù)萃取至無色[11]。合并所用的乙酸乙酯萃取液，減壓回收溶劑，蒸干后得到總有機酸，用乙醇進行溶解，并定容于250 mL容量瓶中，備用。

1.3.2 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取3 mL 6.7 g/L的蘋果酸-乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液與27 mL蒸餾水于燒杯中，將燒杯放在滴定臺上，插入電極，開動磁力攪拌器，用0.047 mol/L NaOH溶液滴定。滴定過程中記錄氫氧化鈉的體積和相應(yīng)的電位變化值。以電位變化量（ΔE）和體積變化量（ΔV）的比值為縱坐標(biāo)，電位變化前后所用去的氫氧化鈉溶液的體積平均值V為橫坐標(biāo)作圖，曲線的極大值對應(yīng)的NaOH溶液體積就是滴定終點，消耗的NaOH的體積為8.49 mL（圖1），由（V堿=C酸V酸/C堿）計算消耗堿量為8.50 mL與理論值相吻合[12]，曲線顯示滴定終點非常明顯，得到NaOH溶液消耗體積。

圖1 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定ΔE/ΔV—V曲線

1.3.3 總有機酸含量測定

精確量取3 mL各品種喀什石榴提取溶液于燒杯中，加入27 mL蒸餾水，同樣將燒杯放置在滴定臺上滴定，相同的方法制作滴定曲線，圖中最大值所對應(yīng)的體積V就是滴定終點時的所消耗氫氧化鈉體積，記錄其數(shù)值，重復(fù)操作5次。

1.3.4 總有機酸還原力測定

將石榴總有機酸溶液配制成0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL的溶液，分別取2 mL溶液，加入2 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6），再加入2 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混合后在50 ℃水浴中反應(yīng)20 min。取出后在混合物后加入2 mL 10%三氯乙酸，分別從中取出2 mL混合物，加入2 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%三氯化鐵于試管中，反應(yīng)10 min后，在700 nm波長處測吸光度。按同樣方法以VC作陽性對照，臨用前用蒸餾水配制[13]。每組數(shù)據(jù)測定3次，求平均值，將其制表、繪圖。

1.3.5 總有機酸對DPPH自由基清除活性測定

精密配制0.2 mmol/L的DPPH溶液，并將石榴總有機酸溶液配制成0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL的溶液，待用?？瞻捉M：取2 mL乙醇和2 mL DPPH溶液，振搖后靜置30 min，在517 nm處測定吸光度d0。對照組：取2 mL乙醇和2 mL待測樣品溶液，測定其吸光度d1。樣品組：取2 mL待測樣品溶液，加入2 mL DPPH溶液，按上述方法測定吸光度d2。按同樣方法以VC作陽性對照，臨用前用蒸餾水配制。計算對DPPH自由基的清除率[14]。試驗的每組數(shù)據(jù)測定3次，求平均值，將其制表、繪圖。

1.3.6 總有機酸對OH自由基清除能力測定

取2 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲于試管中，依次加入2 mL PBS（pH 7.40）、1 mL蒸餾水，充分混勻后，加入1 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵，混勻，加1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.12%的H2O2，于37 ℃水浴90 min，在536 nm處測定其吸光度Ap；用蒸餾水代替H2O2，測定其吸光度Ab；用石榴總有機酸溶液代替1 mL蒸餾水，測定其吸光度As。按同樣方法以VC作陽性對照，臨用前用蒸餾水配制。計算樣品對羥自由基的清除率[15]。每組數(shù)據(jù)測定3次，求平均值，將其制表、繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 總有機酸含量測定與計算

根據(jù)各品種喀什石榴總有機酸提取液滴定得到的ΔE/ΔV—V關(guān)系曲線（圖2～4），確定所消耗氫氧化鈉體積VNaOH，其代入式（3）計算各品種喀什石榴果實中總有機酸含量[16]。求得酸石榴、甜酸石榴、甜石榴中總有機酸含量平均為2.19%，1.66%和1.10%。

式中：CNaOH為氫氧化鈉濃度，mol/L；V為滴定樣品時消耗氫氧化鈉體積，mL；V0為空白消耗氫氧化鈉體積，mL；Mr為蘋果酸相對分子質(zhì)量，Mr=134；m為所用石榴果實質(zhì)量，g；30為稀釋倍數(shù)。

圖2 酸石榴總有機酸滴定ΔE/ΔV—V曲線

圖3 甜酸石榴總有機酸滴定ΔE/ΔV—V曲線

圖4 甜石榴總有機酸滴定ΔE/ΔV—V曲線

2.2 不同品種喀什石榴總有機酸還原力測定

圖5 VC與不同品種喀什石榴總有機酸總還原力

吸光度越大表示總還原力越強[17]。由圖5可知，各品種喀什石榴總有機酸具有一定總還原力，質(zhì)量濃度為1 mg/mL時石榴總有機酸吸光度分別達到0.945，0.709和0.752，其中甜石榴總有機酸的還原力最強。結(jié)果表明，各品種喀什石榴總有機酸的還原力隨著樣品濃度的增加而增強，且呈顯著量效關(guān)系。

2.3 不同品種喀什石榴總有機酸對DPPH自由基清除活性測定

由圖6可知，各品種喀什石榴總有機酸對DPPH自由基具有明顯的清除作用，質(zhì)量濃度為1 mg/mL時石榴總有機酸對DPPH自由基的清除率分別達到91.93%，84.20%和78.45%。運用SPSS Statistics 17.0軟件計算得出各品種石榴總有機酸對DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度IC50值分別為酸石榴0.22 mg/mL、甜酸石榴0.18 mg/mL、甜石榴0.31 mg/mL，表明各品種喀什石榴總有機酸對DPPH自由基具有較強的抑制作用。在測定的濃度范圍內(nèi)，各品種喀什石榴總有機酸對DPPH自由基的清除作用隨著樣品濃度增加而增強，且呈顯著量效關(guān)系。

圖6 VC與不同品種喀什石榴對DPPH自由基的清除作用

2.4 3個品種喀什石榴總有機酸對OH自由基清除能力測定

由圖7可知，各品種喀什石榴總有機酸對OH自由基有明顯清除作用，質(zhì)量濃度為1 mg/mL時石榴總有機酸對OH自由基的清除率分別達到69.96%，64.86%和53.04%。運用SPSS Statistics 17.0軟件計算得出各品種石榴總有機酸對·OH自由基的半數(shù)抑制濃度IC50值分別為酸石榴0.52 mg/mL、甜酸石榴0.34 mg/mL、甜石榴1.00 mg/mL，表明各品種喀什石榴總有機酸對OH自由基具有較強的抑制作用，其中甜酸石榴總有機酸對OH自由基的抑制能力比陽性對照VC還強。在測定的濃度范圍內(nèi)，各品種喀什石榴總有機酸對OH自由基的清除作用隨著樣品濃度增加而增強，且呈顯著量效關(guān)系。

圖7 VC與不同品種喀什石榴對OH自由基的清除作用

3 討論

一種水果往往有多個品種，不同品種的果實品質(zhì)和有效成分不盡相同[11]。對石榴的營養(yǎng)價值和藥用價值的研究較多，但不同品種石榴總有機酸含量測定及其生物活性方面的研究尚不多見?，F(xiàn)代藥理試驗研究證明，有機酸類成分具有抗腫瘤、抑菌、抗氧化、抗血栓、抗艾滋病毒等廣泛的生物活性，具有研究和開發(fā)潛力[16-17]。水果中總有機酸含量的測定最常用的方法是酸堿滴定法，但是由于水果的提取液常常具有較深的顏色，指示劑的選擇受到限制，同時滴定終點指示不明顯[9]。試驗采用電位滴定法，利用電位的變化確定滴定終點，簡便靈敏，重現(xiàn)性及穩(wěn)定性均良好。結(jié)果表明，喀什酸石榴總有機酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.19%、甜酸石榴總有機酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.66%、甜石榴總有機酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.10%。張琳等[18]報道石榴主要有機酸組分為檸檬酸、蘋果酸、草酸，除此之外還含有乙酸、富馬酸、抗壞血酸、酒石酸等，其中乙酸在酸石榴中含量較高，酒石酸在甜石榴中含量較高。此次試驗結(jié)果與上述研究有共同點，不同品種石榴果實中有機酸含量及組分有所不同，這可能是影響石榴風(fēng)味特征的主要因素之一。

氧化作用是炎癥反應(yīng)和血管形成過程中的一個非特異性的代謝過程，它在癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用[19]，而抗氧化就是任何以低濃度存在就能有效抑制自由基的氧化反應(yīng)的活性。據(jù)研究報道，石榴有明顯的抗氧化活性，抗菌抗病毒作用，并對血管疾病、糖尿病及癌癥的治療有效[20-21]，初步推測其作用可能與石榴中有機酸有關(guān)。試驗通過總還原力的測定，并就DPPH、OH自由基的清除試驗初步探討3個品種石榴總有機酸的抗氧化效果。結(jié)果測得不同品種喀什石榴總有機酸具有一定的總還原力，接近同濃度VC總還原力，且具有一定的濃度依賴性，其中甜石榴還原力最強，酸石榴為次，甜酸石榴最弱；在測試濃度0.2～1.00 mg/mL下，各品種喀什石榴總有機酸對DPPH自由基有明顯的清除能力，質(zhì)量濃度為1 mg/mL時各品種喀什石榴總有機酸對DPPH自由基的清除率分別達到91.93%，84.20%和78.45%。根據(jù)IC50值可知，甜酸石榴總有機酸對DPPH自由基清除能力最強，酸石榴為次，甜石榴最弱。在質(zhì)量濃度0.2～1.00 mg/mL條件下，各品種喀什石榴總有機酸對OH自由基清除能力比VC還強。根據(jù)IC50值可知，甜酸石榴總有機酸對OH自由基清除能力最強，酸石榴為次，甜石榴最弱?？梢姡煌贩N喀什石榴果實中總有機酸含量較高并具有較好抗氧化活性。

4 結(jié)論

喀什地區(qū)石榴資源豐富，而喀什石榴具有顯著的品牌優(yōu)勢和區(qū)位優(yōu)勢，開發(fā)潛力巨大，其食用價值、藥用價值和觀賞價值備受關(guān)注。結(jié)果表明，喀什石榴果實中總有機酸含量較高并具有良好的抗氧化能力，為進一步將喀什石榴總有機酸開發(fā)成天然抗氧化劑提供理論依據(jù)，并對喀什石榴在保健、醫(yī)藥方向的發(fā)展具有重要意義。