高溫對堿誘導鴨蛋蛋清凝膠液化特性的影響

范紅，艾民珉，郭善廣，曹媛媛，蔣愛民*

1. 華南農(nóng)業(yè)大學食品學院（廣州 510642）；2. 畜禽產(chǎn)品精準加工與安全地方聯(lián)合工程研究中心（廣州 510642）

蛋清中的蛋白質(zhì)分子在熱、壓力、酸和堿的作用下會發(fā)生變性，若變性后的蛋白質(zhì)分子發(fā)生有序聚集，形成連續(xù)的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，則蛋清可以形成凝膠[1-4]。在加熱后蛋清蛋白質(zhì)會形成乳白色不透明的凝結(jié)塊凝膠[3]，例如水煮蛋。蛋清中蛋白的變性溫度在60～92.5℃之間，疏水相互作用和二硫鍵是熱誘導蛋清凝膠內(nèi)部主要的分子間作用力[5-6]。

皮蛋是利用蛋白質(zhì)堿變性的原理加工而成的，在堿的作用下，蛋清可以形成一種富有彈性的、透明的凝膠，具有均勻、疏松、細絲狀的規(guī)則空隙結(jié)構(gòu)[7]，其中堿質(zhì)量分數(shù)是影響蛋清凝膠形成的一個主要因素[7-8]。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)，通過堿和90 ℃加熱共同處理可以獲得透明的棕色蛋清凝膠。但是高溫處理（＞100 ℃）對堿誘導蛋清凝膠性質(zhì)的影響幾乎沒有相關研究報道。

皮蛋瘦肉粥是中國傳統(tǒng)美食。試驗發(fā)現(xiàn)灌裝的皮蛋瘦肉粥經(jīng)過121 ℃/30 min高溫殺菌后可以在常溫下貯藏，但高溫會導致皮蛋蛋白液化，影響其感官和風味。試驗采用精確控制鴨蛋蛋清中堿質(zhì)量分數(shù)的方法，并與常溫下的堿誘導蛋清凝膠進行對比，研究堿處理與121 ℃/30 min殺菌處理對堿誘導鴨蛋蛋清凝膠流變特性、分子間作用力、外觀特征和蛋白結(jié)構(gòu)的綜合影響，旨在為長貨架期皮蛋瘦肉粥的研發(fā)奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮鴨蛋（市售）；乙二胺四乙酸（EDTA，分析純，天津市富于精細化工有限公司）；5, 5’-二硫代雙-2-硝基苯甲酸（DTNB，分析純，天津市富于精細化工有限公司）；β-巰基乙醇（β-Me，分析純，北京索萊寶科技有限公司）；8-苯胺基-1-萘磺酸銨（ANS，分析純，北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.2 儀器與設備

高壓釜（LS-35HD型，江陰濱江醫(yī)療器械有限公司）；紫外分光光度計（UV-2600型，日本島津公司）；熒光分光光度計（RF-5301PC型，日本島津公司）；均質(zhì)機（T25 easy clean digital型，德國IKA公司）；流變儀（MCR301型，奧地利Anton Parr公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 堿誘導蛋清凝膠的制備

將新鮮的鴨蛋清洗殺菌獲得蛋清，并用凱氏定氮法將蛋清中蛋白質(zhì)濃度“標準化”為10 g/100 g。然后加入NaOH溶液，制成最終NaOH質(zhì)量分數(shù)分別為0.00，0.30%，0.35%，0.40%和0.45%的鴨蛋蛋清凝膠，備用。

1.2.2 堿誘導蛋清的高溫處理

將制得的堿凝膠在高壓釜中于121 ℃，0.22 MPa處理30 min，在室溫下冷卻。測定pH、色澤、表面疏水性、化學作用力、凝膠電泳和流變特性，同時與常溫下放置的凝膠進行對比。

1.2.3 pH的測定

按照 GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》測定。

1.2.4 表面疏水性的測定

參考文獻[10]并略做修改。稱取1 g凝膠或溶膠樣品，加入19 mL的0.1 mol/L pH 7.0磷酸鈉緩沖液，在10 000 r/min下均質(zhì)2 min，于4 000g離心10 min，取上清液備用。以牛血清蛋白為標準，按照考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量，并分別稀釋至0.05～0.50 mg/mL。在試管中充分混合4 mL的稀釋樣品和20 μL的8 mmol/L ANS。將混合物置于黑暗中15 min，使用熒光分光光度計測定熒光強度（FI0），其中激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為470 nm。為了消除蛋白質(zhì)溶解度對熒光強度的影響，未添加ANS的溶液也被測量，為FI1。初始階段的斜率是蛋白質(zhì)分子的表面疏水性（S0），其中蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，校正后的FI（FI0和FI1之差）為縱坐標。

1.2.5 離子鍵、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵的測定參考文獻[11]。

1.2.6 凝膠電泳（SDS-PAGE）

參考文獻[12]并略做修改。濃縮膠和分離膠的質(zhì)量分數(shù)分別為5%和12%。稱取3 g樣品，加入27 mL 5%的SDS溶液中，在10 000 r/min下均質(zhì)2 min，于10 000g離心15 min，然后測定蛋白質(zhì)含量并將其調(diào)整為1 mg/mL。蛋白溶液與樣品緩沖液混合后，沸水浴5 min。將大約10 μL的等分試樣和10 μL的標準蛋白質(zhì)標記物注入到濃縮凝膠上。使用垂直凝膠電泳儀進行電泳，在分離凝膠中用120 V的恒定電壓。凝膠用0.125 g/100 g考馬斯亮藍R-250，25 mL/100 mL甲醇和10 mL/100 mL乙酸染色。用20 mL/100 mL甲醇和10 mL/100 mL乙酸進行脫色。

1.2.7 流變特性的測定

參考文獻[8]并略做修改。在25 ℃下測定不同樣品的流變特性，將2 mL左右的樣品放在平臺上，在探頭壓下之后，周圍用石蠟密封，以防止水分流失。黏度掃描的剪切速率范圍在0.1～100 s-1之間。頻率掃描的頻率范圍在0.01～16 Hz之間，應變?yōu)?%。探頭型號為CP-50。

1.2.8 色澤和外觀

將樣品鋪在色皿上，使用便攜式分光光度計測定樣品的色澤，以黑板和白板為空白，測量L*，a*和b*的值。分析樣品的5個點，并采用平均值。

1.2.9 統(tǒng)計分析

運用SPSS 20.0進行多重比較和LSD檢驗，運用Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色澤和表觀形態(tài)

在常溫放置和高溫處理（120 ℃/30 min）下蛋清凝膠的表觀形態(tài)如圖1所示。高溫處理后，凝膠的形態(tài)和色澤發(fā)生了很大的變化。當NaOH質(zhì)量分數(shù)為0～0.35%時，鴨蛋蛋清具有凝膠結(jié)構(gòu)；當NaOH質(zhì)量分數(shù)達到0.4%和0.45%時，凝膠結(jié)構(gòu)塌陷，最終變成液體狀，后文中將這種現(xiàn)象稱之為“凝膠的液化”，液化后的凝膠稱之為“液化液”，而在常溫下凝膠的形態(tài)變化則相反，只有在較高NaOH質(zhì)量分數(shù)的情況下才能形成凝膠。常溫放置和高溫處理后堿誘導鴨蛋清凝膠以及液化液的L*，a*和b*值如表1所示。高溫處理組中，加了NaOH的試驗組與空白組（NaOH質(zhì)量分數(shù)為0）相比，a*值顯著增加（p＜0.05），且隨著NaOH質(zhì)量分數(shù)的增大而增大（p＜0.05），表明高溫處理得到的堿誘導蛋清凝膠具有紅色色澤，且隨著NaOH質(zhì)量分數(shù)的增加，紅色加深；但是L*和b*值明顯降低，表明空白組的凝膠比加了NaOH的試驗組更白、更黃，呈現(xiàn)黃白色。b*值隨NaOH質(zhì)量分數(shù)的增大而逐漸增大（p＜0.05），表明高溫處理后凝膠和液化液的黃色加深。以上分析表明高溫處理堿誘導蛋清凝膠之后，凝膠的顏色接近紅棕色，并且隨著NaOH質(zhì)量分數(shù)的增加，顏色變深。蛋清中的蛋白質(zhì)在堿的作用下，會生成H2S和NH3，它們會與蛋白質(zhì)中具有強氧化還原性的基團發(fā)生反應，形成一些結(jié)構(gòu)復雜的色素類物質(zhì)[13]。同時，游離氨基會與糖類的羰基發(fā)生美拉德反應形成棕色超分子聚合物[4,14]。高溫會促進蛋白質(zhì)的變性和加速相關反應的進行，因此高溫處理之后的堿誘導鴨蛋蛋清凝膠呈現(xiàn)紅棕色，其與常溫下白色的透明凝膠有明顯的區(qū)別。

圖1 常溫放置和高溫處理后堿誘導鴨蛋蛋清的外觀特征

表1 常溫放置和高溫處理后堿誘導鴨蛋蛋清凝膠和液化液色澤的變化

2.2 pH和表面疏水性的變化

鴨蛋蛋清凝膠和液化液的pH和表面疏水性變化如圖2所示。在常溫下，當NaOH質(zhì)量分數(shù)為0～0.4%時，表面疏水性隨NaOH質(zhì)量分數(shù)的增加而顯著增大（p＜0.05），可能是由于堿度增大，蛋白質(zhì)在堿的作用下暴露出更多的疏水基團。高溫處理后，隨著NaOH質(zhì)量分數(shù)的增加，pH顯著增加（p＜0.05），表面疏水性在NaOH質(zhì)量分數(shù)為0～0.35%時顯著增加，然后顯著降低（p＜0.05）。表面疏水性可以反映疏水性的強度，并進一步揭示蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和功能特征[15]。高溫處理空白組的表面疏水性明顯低于其他組（p＜0.05），這可能是因為沒有加NaOH的蛋清，在高溫下形成了硬質(zhì)凝膠，疏水基團嵌入進了該凝膠中。然而，在高溫組中當NaOH質(zhì)量分數(shù)為0.30%和0.35%時，pH的升高會暴露疏水基團的內(nèi)部蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)之間發(fā)生疏水相互作用，形成柔軟而有彈性的蛋清凝膠，從而使得表面疏水性顯著增加（p＜0.05）[6]。當NaOH質(zhì)量分數(shù)過高（＞0.40%）時，可能在高溫下OH-的高速振動破壞了游離疏水基團的結(jié)構(gòu)，從而使得表面疏水性降低。在相同的堿質(zhì)量分數(shù)下，常溫下的凝膠的表面疏水性要比高溫處理后的大，這可能是過高的溫度破壞了疏水基團所致。

圖2 常溫放置和高溫處理后堿誘導鴨蛋蛋清凝膠和液化液中pH和表面疏水性的變化

2.3 離子鍵、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵的變化

不同的蛋清蛋白凝膠受到不同的分子間作用力的支持，例如疏水相互作用和二硫鍵是熱誘導蛋清蛋白凝膠中的主要分子間作用力[2,4]，但是蛋清凝膠用強堿溶液處理（2.0% NaOH）之后，其主要的作用力是離子鍵和疏水相互作用[5]。高溫處理后，堿誘導鴨蛋蛋清凝膠和液化液的分子間力如圖3（b）所示。高溫處理組中隨著NaOH質(zhì)量分數(shù)的增加，S1顯著降低（p＜0.05），蛋清凝膠液化后S3顯著增加，但與空白組相比明顯降低（p＜0.05），當NaOH質(zhì)量分數(shù)較高時，S4明顯下降（p＜0.05），具有凝膠結(jié)構(gòu)組的S1和S4（NaOH質(zhì)量分數(shù)為0.30%～0.35%）顯著高于液化組的S1和S4（NaOH質(zhì)量分數(shù)0.4%～0.45%；p＜0.05），而在S2和S3中未出現(xiàn)相似的結(jié)果。表明高溫處理后，氫鍵和二硫鍵是維持堿誘導鴨蛋蛋清凝膠（NaOH質(zhì)量分數(shù)為0.30%～0.35%）的主要作用力，當凝膠開始液化（NaOH質(zhì)量分數(shù)為0.40%）時，氫鍵沒有顯著變化（p＞0.05），二硫鍵顯著較少（p＜0.05），但是凝膠徹底液化之后，這2種作用力均減少，這可能是因為當NaOH質(zhì)量分數(shù)過高時，變性后的蛋白質(zhì)分子之間又出現(xiàn)了某種分子間排斥力，從而使得蛋白分子無法有序聚集，也有可能是因為蛋白質(zhì)變成了更小分子質(zhì)量的多肽，失去了蛋白結(jié)構(gòu)。從圖3（a）可以發(fā)現(xiàn)，在常溫下，當NaOH質(zhì)量分數(shù)為0.4%和0.45%時，S1和S4顯著增大，且明顯大于S2和S3，說明離子鍵和二硫鍵是維持常溫下蛋清凝膠的主要作用力。

圖3 化學作用力的變化

2.4 流變性質(zhì)

常溫放置和高溫處理之后的堿誘導蛋清凝膠和液化液的黏度和剪切速率之間的關系如圖4所示。堿處理后的蛋清蛋白在高溫處理后仍可以通過二硫鍵等分子間作用力形成凝膠（NaOH質(zhì)量分數(shù)為0.30%）或溶膠（NaOH質(zhì)量分數(shù)為0.35%），表現(xiàn)出高黏度，與常溫放置的堿處理鴨蛋蛋清相反。隨著NaOH質(zhì)量分數(shù)繼續(xù)增大，常溫下鴨蛋蛋清開始形成凝膠，黏度增加，但是高溫處理后凝膠結(jié)構(gòu)消失，表現(xiàn)為液體狀，黏度下降。G′值反映了物質(zhì)在一定應變或應力下儲存能量的能力，代表了彈性部分[16]。高溫處理之后，堿誘導鴨蛋蛋清凝膠和液化液的G′值如圖5（b）所示，當NaOH質(zhì)量分數(shù)為0.30%和0.35%時，鴨蛋蛋清還保留有一定的凝膠結(jié)構(gòu)，且G′值隨頻率的增大而增大，說明此時形成的凝膠還有一定的彈性。但是NaOH質(zhì)量分數(shù)為0.45%時，凝膠液化形成液體狀的溶液，G′值隨頻率的變化不明顯，且規(guī)律性不強。常溫放置的蛋清凝膠則相反，當NaOH質(zhì)量分數(shù)為0.4%和0.45%時，蛋清具有凝膠結(jié)構(gòu)，且形成的凝膠有一定的彈性。

圖4 常溫放置（a）和高溫處理后（b）堿誘導鴨蛋蛋清凝膠和液化液黏度的變化

圖5 常溫放置（a）和高溫處理后（b）堿誘導鴨蛋蛋清凝膠和液化液儲能模量（G′）的變化

2.5 凝膠電泳

蛋清蛋白中的卵黏蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵白蛋白、卵類黏蛋白和溶菌酶的分子質(zhì)量分別為110，76，44.5，28和14.3 kDa[1]。由圖6可知，標準蛋白的分子質(zhì)量為14.4～97.4 kDa，以標準蛋白的遷移率作為對照，根據(jù)樣品的相對遷移率，來判斷高溫處理之后堿誘導蛋清凝膠中蛋白質(zhì)的變化[13]。常溫下，43 kDa附近對應的條帶逐漸變窄，說明卵白蛋白在堿的作用下被逐漸分解。與常溫組對比，高溫處理后43 kDa附近對應的條帶均消失，但隨著NaOH質(zhì)量分數(shù)的增加，在濃縮膠和分離膠的交界處出現(xiàn)一些條帶，并有明顯變寬的趨勢，表明形成了交聯(lián)的大分子蛋白質(zhì)，同時在分離膠的底部也出現(xiàn)了一些條帶，說明有小分子蛋白質(zhì)和多肽的生成，這可能是因為蛋清蛋白質(zhì)分子在高溫和堿的處理下發(fā)生了分解。由以上分析可知，雖然在高溫處理下，蛋清蛋白在變性后可能會發(fā)生自組裝形成部分大分子蛋白質(zhì)，但是NaOH質(zhì)量分數(shù)增加時，由于分子間作用力的減少，這些大分子并不能在高溫下發(fā)生有序的聚集，而是有一部分蛋白質(zhì)會進一步分解成更小的蛋白質(zhì)分子或多肽。

圖6 常溫放置（a）和高溫處理后（b）堿誘導鴨蛋蛋清凝膠和液化液的凝膠電泳圖

3 結(jié)論

研究高溫處理對堿誘導蛋清凝膠的影響，對于拓寬高溫處理蛋清凝膠在傳統(tǒng)食品現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)中的應用和即食皮蛋瘦肉粥的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的意義。試驗表明：①NaOH質(zhì)量分數(shù)為0～0.35%時，鴨蛋蛋清在常溫下不能形成凝膠，但經(jīng)過高溫處理（121℃/30 min），蛋清形成凝膠結(jié)構(gòu)，而NaOH質(zhì)量分數(shù)增大，常溫下可以形成凝膠，表觀黏度和G′值均增加，但高溫處理后凝膠會液化，表觀黏度和G′值均減少；②高溫處理得到的蛋清凝膠和液化液均呈紅棕色，并且隨著NaOH質(zhì)量分數(shù)的增大，顏色變深，與常溫下放置的白色透明凝膠明顯不同；③離子鍵和二硫鍵是常溫下鴨蛋蛋清凝膠內(nèi)部的主要作用力，氫鍵和二硫鍵是維持高溫處理后凝膠結(jié)構(gòu)的主要作用力，但當凝膠徹底液化后，2種作用力均減弱；④雖然在高溫處理下，蛋清蛋白在變性后會形成部分大分子蛋白質(zhì)，但是NaOH質(zhì)量分數(shù)增加時，這些大分子并不能在高溫下發(fā)生有序的聚集，而是有一部分蛋白質(zhì)會進一步分解成更小的蛋白質(zhì)分子或多肽。此次試驗對高溫處理堿誘導蛋清凝膠的液化的機理進行了初步的討論，但僅監(jiān)測了流變特性、分子間作用力、外觀特征等，對于其中更深入、更復雜的變化還有待于進一步研究。高溫下液化的鴨蛋蛋清凝膠的安全性、功能特性及相關的應用將是我們未來研究的方向。