殼聚糖/果膠酶澄清歐李果汁工藝及其品質(zhì)

毛文英，杜俊民*，杜意鴻

1. 山西中醫(yī)藥大學中藥與食品工程學院（太原 030619）；2. 北京林業(yè)大學林學院（北京 100083）

歐李果是薔薇科櫻桃屬野生果子，含有豐富礦物元素和微量元素。歐李果實置于常溫下極易萎蔫甚至腐爛，即使硬熟時采摘也不耐貯藏。同時，歐李口感酸澀，故適合加工后食用。歐李果產(chǎn)品中，果汁具有方便食用、口感好的優(yōu)點，但由于果汁中存在大分子聚合物，常出現(xiàn)渾濁或形成沉淀的現(xiàn)象。解決果汁渾濁問題的澄清劑主要有果膠酶、殼聚糖、明膠、皂土、聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、硅溶膠等，通常單獨使用或聯(lián)合使用[1-2]。其中，殼聚糖作為一種無毒、抑菌的天然材料，美國食品和藥物管理局（FDA）已批準其作為食品添加劑。研究表明，殼聚糖具有很強的抑菌性，應(yīng)用在食品工業(yè)中，起到防腐的作用，還可避免食物失去原本的味道[3]。另外，殼聚糖還有很好的絮凝效果，可用作絮凝劑和澄清劑[4]。果膠酶廣泛用于果汁澄清過程[1-2,5-6]，但澄清不穩(wěn)定，容易在后期蓄積沉淀，故試驗在少量果膠酶澄清的基礎(chǔ)上，考察殼聚糖對歐李果汁的澄清效果。另外，基于歐李果汁中總黃酮、原花青素、維生素C具有抗氧化功能。其中，原花青素（OPC）具有消除自由基的作用[7]，可有效消除超氧陰離子自由基和羥基，也參與磷酸、花生四烯酸的代謝和蛋白質(zhì)磷酸化，保護脂質(zhì)不發(fā)生氧化損傷，并且可以保護和穩(wěn)定維生素C，有助于維生素C的吸收和運用，對人體健康很有益處[8]。因此，試驗考察最佳澄清工藝后總黃酮、OPC、維生素C質(zhì)量濃度變化情況。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

經(jīng)過粗濾的‘農(nóng)大4號’歐李濁汁（固形物質(zhì)量分數(shù)11%，總酸3.0%）；蘆丁對照品（國家標準物質(zhì)商城）；果膠酶，食品級（浙江寶嘉生物科技有限公司）；檸檬酸（食品級，濟南海王化工有限公司）；原花青素標準品、維生素C（青島捷世康生物科技有限公司）；殼聚糖A（脫乙酰度85%）、殼聚糖B（脫乙酰度95%）（食品級，山東陸海藍圣生物科技股份有限公司）。

紫外可見分光光度計（Ultra-3660型，北京普源精電有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（B-260型，北京科偉永興儀器有限公司）；電子天平（CP124C型，奧豪斯儀器（上海）有限公司制造商）；離心機（L535R-1型，長沙高新產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 溫度對果膠酶澄清效果的影響

量取5 mL歐李果汁于5支試管中，在前期試驗基礎(chǔ)上加入5 μL果膠酶，離心處理20 min，分別在30，35，40，45和50 ℃水浴鍋中加熱1 h[9]，通過紫外可見分光光度計測定其透光率。

1.2.2 殼聚糖溶液加入量對果汁澄清的影響

殼聚糖A、B溶液的制備：分別準確稱取1 g殼聚糖A、B于2個錐形瓶中，加入50 mL蒸餾水，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH至3.0[2]，靜置，再加入50 mL蒸餾水，攪拌至其完全溶解，制得1%殼聚糖溶液。

分別量取10 mL歐李果汁（5 μL果膠酶澄清后）于7支試管中，分別加入配制好的1%殼聚糖A、B溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5和4.0 mL。在45 ℃水浴鍋中加熱1 h，靜置48 h后，通過紫外可見分光光度計測定其透光率。

1.2.3 總黃酮、低聚原花青素、維生素C質(zhì)量濃度的測定

1.2.3.1 標準品的制備

用電子天平準確稱量1.89 mg蘆丁標準品置于10mL容量瓶中，加入70%無水乙醇定容至刻度線處，振蕩使其充分溶解，得到質(zhì)量濃度0.189 mg/mL的蘆丁標準品溶液[10]。

室溫下精密稱量0.65 mg OPC標準品于10 mL容量瓶中，加入pH 3的超純水定容至刻度線處，使其充分溶解。制得質(zhì)量濃度65 mg/L的OPC標準品溶液[11]。按照上述方法操作制得質(zhì)量濃度65.00，42.25，32.50和16.25 mg/L的標準品溶液。

1.2.3.2 標準曲線的繪制

紫外-可見分光光度法具有重復性好、易掌握，所需試劑便宜易得，因此常用于測定植物中總黃酮質(zhì)量濃度[10]。NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系是藥典最常用的總黃酮質(zhì)量濃度檢測方法。用移液管分別量0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL的蘆丁標準品溶液于5 mL容量瓶中。加入5%亞硝酸鈉溶液搖勻，靜置6 min后，加入10%硝酸鋁溶液0.2 mL搖勻，再次靜置6 min后，加入氫氧化鈉溶液2.0 mL搖勻，靜置15 min。立即加入70%無水乙醇定容至刻度線[11-12]。用紫外可見分光光度計在波長510 nm下測定其吸光度。根據(jù)吸光度（y）和標準品質(zhì)量濃度（x）繪制標準曲線，得回歸方程：y=2.534x+0.064 4，R2=0.998 9。整理后再在波長280 nm下用紫外-可見分光光度計分別測定質(zhì)量濃度65.00，42.25，32.50和16.25 mg/L的OPC標準溶液的吸光度。并根據(jù)吸光度（y）和質(zhì)量濃度（x）繪制標準曲線，得回歸方程：y=0.015x+0.046 5，R2=0.994 4。

1.2.3.3 重現(xiàn)性試驗

室溫下，準確量取5 mL歐李果汁原溶液于25 mL容量瓶中加超純水定容至刻度線（相當于原果汁稀釋5倍），處理搖勻，分別于6支試管中，將其加入比色皿中用紫外-可見分光光度儀測定其吸光度3次。根據(jù)其標準曲線求得總黃酮質(zhì)量濃度和δRSD值[12-14]。

1.2.3.4 碘量法測定維生素C質(zhì)量濃度

取歐李果汁20 mL于100 mL容量瓶中，并加入2%鹽酸至100 mL定容，充分混合。在50 mL燒杯中，用移液管注入1%碘化鉀0.5 mL、0.5%淀粉溶液2 mL、定容好的歐李果汁5 mL，加入蒸餾水至總體積10 mL。用0.001 mol/L碘酸鉀進行滴定，一滴滴加入，并同時搖動燒杯，使其充分接觸，至微藍色不再褪色即為終點，記錄所消耗的碘酸鉀毫克數(shù)[15]。

準確稱量2.5 mg維生素C標準品于100 mL容量瓶中，并加入2%鹽酸定容至刻度線處。按照上述同樣操作，同時記錄所消耗碘酸鉀的毫克數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 澄清結(jié)果與分析

果膠酶含有脂酶、水解酶和裂解酶3種成份，在合適作用條件下，它可將果汁中的果膠、蛋白質(zhì)等高分子物分解，降低果汁黏度，釋放出更多的有效成份[2,5-6]。果膠酶在分解果膠的同時，會使帶正電的蛋白微粒暴露，并與帶負電的膠體微粒相互吸引，迅速絮凝沉淀，從而有效降低果汁的渾濁狀況，最大限度提高澄清度[16]。由圖1可知，加入5 μL果膠酶量后，隨著水浴溫度變化，果汁透光率也有所變化。水浴溫度45 ℃時，果汁的透光率較大，為26.3%。關(guān)于其澄清效果有大量文獻證明，隨著果膠酶加入量增加，透光率呈上升趨勢。但容易出現(xiàn)長期放置后又沉淀，影響果汁食用。為改善果汁澄清效果，延長果汁儲存時間，試驗進一步在少量果膠酶澄清基礎(chǔ)上，加入殼聚糖溶液。

在酸性條件下殼聚糖帶正電荷，可與果汁中帶負電荷的果膠、纖維素、單寧等物質(zhì)結(jié)合。在充分攪拌的條件下，正負電荷的中和作用，打破果汁的穩(wěn)定性，而使果汁中懸浮物吸附于殼聚糖表面，凝結(jié)沉淀，通過過濾便可得澄清果汁[1,4]。由圖2可知，隨著殼聚糖溶液體積的增加，水浴過程中熱凝作用占澄清的主導地位，常溫靜置48 h后，果汁下方可明顯看到團狀凝絮物，透光率增加也較顯著。殼聚糖溶液體積4 mL時，相對脫乙酰度較高的殼聚糖B澄清效果更好，果汁透光率可達到最大值92.4%。這可能是由于脫乙酰度較高的殼聚糖，帶正電荷量較多，在溶液中有可能形成擴張型的線性分子，暴露更多的反應(yīng)基團。在提取液中就與帶負電荷的果膠等大分子相互作用，形成相應(yīng)規(guī)則形狀的絮凝物形狀的絮凝物。但果汁中加入殼聚糖溶液超過4 mL時，果汁膠體粒子表面被殼聚糖分子完全覆蓋，將影響膠粒間架橋交聯(lián)，從而影響絮凝效果[4]。

圖1 溫度對果膠酶、殼聚糖澄清透光率的影響

圖2 殼聚糖溶液加入量對透光率的影響

由圖1可以看出，殼聚糖澄清水浴溫度45 ℃后，溫度對果汁透光率的影響較小。由于擔心高溫水浴對果汁品質(zhì)造成影響，故選擇水浴溫度45 ℃。從圖3可以看出，水浴時間增加，2種脫乙酰度殼聚糖溶液透光率均變大，而1 h后變化不大，故選擇水浴時間1 h。最終得出歐李果汁的最佳的澄清條件為加入0.1%果膠酶5 μL，離心20 min后于45 ℃水浴鍋中攪拌1 h后，加入殼聚糖B溶液4 mL，45 ℃水浴充分攪拌1 h，靜置48 h后最大透光率可達92.4%。

圖3 水浴時間對殼聚糖/果膠酶透光率的影響

2.2 果汁中總黃酮、低聚原花青素及維C質(zhì)量濃度

2.2.1 總黃酮質(zhì)量濃度

通過標準曲線方程計算可得原歐李果汁中總黃酮質(zhì)量濃度為65.25 mg/mL。最佳澄清工藝處理后總黃酮質(zhì)量濃度為62.65 mg/mL。由表1可知總黃酮質(zhì)量濃度重現(xiàn)性數(shù)據(jù)δRSD為0.41%。其吸光度精密度試驗結(jié)果δRSD為0.4%，測定結(jié)果兩者相對標準偏差較小，說明測得總黃酮質(zhì)量濃度重現(xiàn)性和精密度較好。

表1 總黃酮質(zhì)量濃度重現(xiàn)性數(shù)據(jù)

2.2.2 OPC質(zhì)量濃度

運用標準曲線方程可求得空白樣品溶液中OPC質(zhì)量濃度為7.825 mg/mL。最佳澄清工藝處理后果汁中OPC質(zhì)量濃度為7.496 mg/mL。

2.2.3 維生素C質(zhì)量濃度

式中：wVC為維生素C質(zhì)量濃度，mg/100 mL；C為消耗的碘標準液濃度，mol/mL；V碘為滴定時消耗碘的體積mL；A為樣品稀釋倍數(shù)；V果汁樣品體積mL。

利用對數(shù)據(jù)進行處理[15]，求出原歐李果汁中維生素C質(zhì)量濃度為17.24 mg/100 mL，對于最佳澄清工藝下測定的維生素C質(zhì)量濃度為15.43 mg/100 mL。維生素C質(zhì)量濃度稍有降低可能是由于45 ℃水浴鍋進行處理時，溫度對其稍有影響。

3 結(jié)論

加入5 μL果膠酶離心20 min后，于45 ℃水浴鍋中恒溫1 h，加入4 mL質(zhì)量分數(shù)1%殼聚糖溶液，于45 ℃水浴鍋中恒溫攪拌1 h，靜置48 h所得歐李果汁透光率可達92.4%。脫乙酰度較高的殼聚糖，在溶液中更易于與果膠等大分子反應(yīng)結(jié)合，形成沉淀。但加入量超過4 mL后，果汁澄清度反而有所下降。澄清后歐李果汁中OPC質(zhì)量濃度為7.496 mg/mL，總黃酮質(zhì)量濃度為62.65 mg/mL，維生素C質(zhì)量濃度為15.43 mg/100 mL，澄清前后質(zhì)量濃度基本變化不大。后續(xù)可在穩(wěn)定殼聚糖/果膠酶澄清工藝基礎(chǔ)上，利用高效液相色譜法分析澄清工藝與果汁品質(zhì)間的關(guān)系，為研究開發(fā)具有抗氧化活性的果汁及其具體保健功效打好基礎(chǔ)。