楊昭,黃佳佳,姚玉靜*,曾琳琦,凌葉婷
廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院食品學(xué)院(廣州 510520)
牡蠣(oyster)是一種低脂肪高蛋白的水產(chǎn)品,含有豐富的蛋白質(zhì)(45%~57%)、?;撬幔?0.6 mg/g)、總糖(18%~39%)和微量元素(硒、鋅)等,擁有極高的營養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值[1]。近十年來,我國牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年增加,年產(chǎn)量超過400萬 t[2]。鑒于牡蠣具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和較大的產(chǎn)量,蛋白質(zhì)酶解技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于牡蠣的水解,以獲得具有良好感官品質(zhì)、功能特性、生理活性和營養(yǎng)價(jià)值的酶解產(chǎn)物[3]。但獲得合適酶解產(chǎn)物受到多種因素的影響,包括酶種類、底物和水解條件(如酶的濃度、溫度、pH和時(shí)間)[4]。通過控制水解條件可以提高酶解產(chǎn)物的品質(zhì)和功能特性,如乳化性和起泡性[5]。適度酶解可以強(qiáng)化酶解產(chǎn)物的功能特性,但酶解過度會(huì)造成一些功能特性喪失[6]。因此,控制蛋白質(zhì)的水解程度對(duì)于獲得具有較佳功能特性的酶解產(chǎn)物至關(guān)重要。
水解度是表征蛋白質(zhì)水解程度的重要指標(biāo)。近年來,越來越多研究者關(guān)注水解度對(duì)水產(chǎn)品酶解產(chǎn)物功能特性和抗氧化活性的影響。袁曉晴等[6]制備水解度為DH 4.5%,9.0%和13.5%鳙魚肉酶解產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)DH 4.5%酶解產(chǎn)物乳化性和起泡性最高,而過度水解后,DH 9.0%和13.5%酶解產(chǎn)物乳化性和起泡性下降。馬艷芳等[7]發(fā)現(xiàn)螺旋藻肽的起泡性、DPPH清除率和還原力,隨著水解度增加呈現(xiàn)先增大后減小趨勢,而泡沫穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性則隨著水解度增大而逐漸減小。周航等[8]制備水解度分別為7.5%,9.4%,10.3%,11.6%和14.6%的鰱魚肉酶解產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)過氧化抑制率、ABTS+·清除率和還原力均隨水解度增大而升高。盧彬等[9]制備水解度分別為10.8%,14.9%,19.0%和21.7%鲹魚肉酶解產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)隨著水解度增大,酶解產(chǎn)物乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性逐漸降低。研究表明,水解度對(duì)酶解產(chǎn)物的功能特性和抗氧化活性有重要影響,且不同原料呈現(xiàn)不同規(guī)律。前期研究發(fā)現(xiàn),水解度對(duì)牡蠣酶解液的感官評(píng)分、肽分子量分布和游離氨基酸組成有較大影響[10]。酶解產(chǎn)物組成的差異會(huì)引起其功能特性和生理活性變化。現(xiàn)鮮有水解度對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物功能特性和抗氧化活性影響的報(bào)道。
因此,試驗(yàn)以牡蠣肉為原料,采用胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成復(fù)合酶對(duì)其進(jìn)行限制性水解,獲得不同水解度的酶解產(chǎn)物,考察水解度對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物功能特性(乳化性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性)和抗氧化活性(DPPH清除率和總還原力)的影響,旨在為牡蠣酶解產(chǎn)物的工業(yè)化應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)和參考。
近江牡蠣肉(購自廣州龍洞農(nóng)貿(mào)市場,現(xiàn)場去殼取肉后,冰鮮保存,立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室-18 ℃凍藏);風(fēng)味蛋白酶(酶活500 LAPU/g,諾維信中國公司);胰蛋白酶(酶活4 000 U/g,重慶市全新祥盛生物制藥有限公司);2, 2-二苯基-1-苦味基肼(DPPH,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);濃硫酸、氫氧化鈉、鹽酸等(均為分析純)。
DKZ-3B電熱恒溫振蕩水槽(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);3K15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司);K9840凱氏定氮儀(濟(jì)南海能儀器股份有限公司);TU-1810紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);T25高壓均質(zhì)機(jī)(艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司)。
1.2.1 酶解產(chǎn)物制備
稱取等重量解凍的牡蠣肉和蒸餾水,混合后迅速打漿,調(diào)整漿液pH 7.0,加入牡蠣肉總重量0.6%復(fù)合蛋白酶(胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比2︰1),攪拌均勻后在55 ℃水浴搖床中分別酶解不同時(shí)間。酶解結(jié)束后,煮沸滅酶20 min。室溫冷卻后在4 ℃條件下以8 000 r/min離心20 min,取上清液-18 ℃凍存?zhèn)溆肹1]。酶解時(shí)間分別為0,30,60,240和480 min的酶解產(chǎn)物,分別標(biāo)記為OH0、OH1、OH2、OH3和OH4。
1.2.2 水解度測定
總氮含量測定采用凱氏定氮法。氨基酸態(tài)氮含量測定采用甲醛滴定法[11]。水解度(DH)按照式(1)計(jì)算。
1.2.3 乳化性能
酶解產(chǎn)物用蒸餾水稀釋3倍后,取30 mL稀釋后的酶解產(chǎn)物至燒杯中,分別調(diào)節(jié)pH 4,6,8和10,加入30 mL大豆油,以10 000 r/min均質(zhì)2 min,迅速將乳化液倒入100 mL離心管中,以3 000 r/min離心5 min,離心后測量乳化層體積[2-3]。
1.2.4 起泡性和泡沫穩(wěn)定性
酶解產(chǎn)物用蒸餾水稀釋3倍后,取30 mL稀釋后的酶解產(chǎn)物至燒杯中,分別調(diào)節(jié)pH 4,6,8和10,以10 000 r/min高速均質(zhì)2 min后迅速轉(zhuǎn)移至量筒中,量取起始泡沫體積,記錄之后5,10,20,30和60 min時(shí)的泡沫體積[8]。起泡性及泡沫穩(wěn)定性按照式(3)和(4)計(jì)算。
1.2.5 DPPH的測定
酶解產(chǎn)物用蒸餾水稀釋4倍后,取2 mL稀釋后的酶解產(chǎn)物于10 mL離心管中,加入2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液,混勻,室溫避光放置30 min。以無水乙醇調(diào)零,于517 nm波長處測定吸光度[4]。計(jì)算如式(5)。
式中:A0為2.0 mL樣品溶液+2.0 mL無水乙醇的吸光度;A1為2.0 mL DPPH溶液+2.0 mL無水乙醇的吸光度;A2為2.0 mL樣品溶液+2.0 mL DPPH溶液的吸光度。
1.2.6 總還原力的測定
酶解產(chǎn)物用蒸餾水稀釋1倍后,取1 mL稀釋后的酶解產(chǎn)物于10 mL離心管中,依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.6)和2.5 mL 1%鐵氰化鉀,混勻,50 ℃水浴20 min,冷卻至室溫,加2.5 mL 10%三氯乙酸,混勻。取2.5 mL上清液,加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵,混勻。以蒸餾水調(diào)零,于700 nm波長處測定吸光度[5]。
所有測定均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn),取平均值。
蛋白質(zhì)水解后成為多肽和游離氨基酸,多肽是酶解產(chǎn)物功能特性和抗氧化活性的主要貢獻(xiàn)者。不同水解度的酶解產(chǎn)物中多肽分子量分布范圍和含量不同。通常水解度越高,多肽分子量分布范圍越小,小分子肽含量越高,但呈現(xiàn)較強(qiáng)功能特性和抗氧化活性的多肽分子量具體是多少,未有一個(gè)明確的參考依據(jù)。因此,探究水解度對(duì)酶解產(chǎn)物功能特性和抗氧化活性的影響,是酶解產(chǎn)物中功能性肽和抗氧化肽分離和鑒定的基礎(chǔ),也是酶解產(chǎn)物應(yīng)用的基礎(chǔ)。如圖1所示,采用胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成復(fù)合酶對(duì)牡蠣進(jìn)行限制性水解,酶解時(shí)間分別為0,30,60,240和480 min時(shí),獲得OH0、OH1、OH2、OH3和OH4這5種酶解產(chǎn)物,水解度分別為8.02%,24.75%,28.04%,36.98%和41.20%。牡蠣在貯藏和預(yù)處理過程中,其中的內(nèi)源蛋白酶也會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解,發(fā)生蛋白質(zhì)自溶的過程[6]。因此,酶解時(shí)間0 min的牡蠣酶解產(chǎn)物,其水解度也需要被測定和考察。
圖1 牡蠣酶解產(chǎn)物的水解度
乳化性是指能將油水結(jié)合在一起形成乳狀液的能力,是食品加工中重要的性質(zhì)和質(zhì)量控制指標(biāo)。如圖2所示,在pH 4環(huán)境中,OH0、OH1、OH2、OH3和OH4乳化性分別為44.46%,42.29%,44.61%,42.81%和43.76%。在pH 6環(huán)境中,OH0、OH1、OH2、OH3和OH4乳化性分別為44.44%,45.13%,45.81%,43.75%和43.03%。在pH 8環(huán)境中,OH0、OH1、OH2、OH3和OH4乳化性分別為45.82%,44.56%,43.08%,43.44%和44.27%。在pH 10環(huán)境中,OH0、OH1、OH2、OH3和OH4乳化性分別為41.98%,41.82%,39.97%,39.81%和40.38%。數(shù)據(jù)分析表明,不同水解度牡蠣酶解產(chǎn)物在不同pH環(huán)境中的乳化性差別較小,表明水解度對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物乳化性的影響較小。
圖2 不同水解度牡蠣酶解產(chǎn)物的乳化性
起泡性是蛋白質(zhì)應(yīng)用于食品加工的一項(xiàng)重要功能性質(zhì)。如圖3所示,在pH 4環(huán)境中,OH0、OH1、OH2、OH3和OH4起泡性分別為53.84%,56.39%,26.92%,21.40%和16.53%。在pH 6環(huán)境中,OH0、OH1、OH2、OH3和OH4起泡性分別為68.15%,70.07%,58.55%,40.99%和29.59%。在pH 8環(huán)境中,OH0、OH1、OH2、OH3和OH4起泡性分別為52.57%,51.82%,37.56%,24.96%和13.79%。在pH 10環(huán)境中,OH0、OH1、OH2、OH3和OH4起泡性分別為46.13%,55.41%,31.53%,36.11%和18.69%。數(shù)據(jù)分析表明,OH1在4種pH環(huán)境中均有較強(qiáng)的起泡性,在pH 6環(huán)境中起泡性最大為70.07%。在pH 4和6環(huán)境中,牡蠣酶解產(chǎn)物的起泡性隨著水解度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在pH 8環(huán)境中,牡蠣酶解產(chǎn)物的起泡性隨著水解度的增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。在pH 10環(huán)境中,牡蠣酶解產(chǎn)物的起泡性則無明顯規(guī)律。表明水解度對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物起泡性的影響較大。
由圖4可知,在pH 4環(huán)境中,OH3和OH4的泡沫穩(wěn)定性較強(qiáng),泡沫穩(wěn)定性5 min時(shí)分別為93.27%和92.06%。OH1在5,10,20,30和60 min時(shí)的泡沫穩(wěn)定性分別為76.74%,75.58%,70.93%,62.79%和23.26%,表明OH1在pH 4環(huán)境中,30 min內(nèi)具有超過50%的泡沫穩(wěn)定性。由圖5可知,在pH 6環(huán)境中,OH4的泡沫穩(wěn)定性較強(qiáng),泡沫穩(wěn)定性在5 min時(shí)為96.67%。OH1在5,10,20,30和60 min時(shí)的泡沫穩(wěn)定性分別為68.08%,64.32%,58.69%,56.34%和28.17%。表明OH1在pH 6環(huán)境中,30 min內(nèi)仍具有超過50%的泡沫穩(wěn)定性。由圖6可知,在pH 8環(huán)境中,OH3和OH4的泡沫穩(wěn)定性較強(qiáng),泡沫穩(wěn)定性在5 min時(shí)為分別為91.60%和95.34%。OH1在5,10,20,30和60 min時(shí)的泡沫穩(wěn)定性分別為77.07%,73.89%,68.79%,64.33%和50.89%。表明OH1在pH 8環(huán)境中,60 min內(nèi)具有超過50%的泡沫穩(wěn)定性。由圖7可知,在pH 10環(huán)境中,OH1、OH2、OH3和OH4均具有較強(qiáng)的泡沫穩(wěn)定性,泡沫穩(wěn)定性在5 min時(shí)為分別為85.63%,85.36%,84.30%和84.30%。OH1在5,10,20,30和60 min時(shí)的泡沫穩(wěn)定性分別為77.07%,73.89%,68.79%,64.33%和50.89%。表明OH1在pH 10環(huán)境中,60 min內(nèi)仍具有超過50%的泡沫穩(wěn)定性。
圖3 不同水解度牡蠣酶解產(chǎn)物的起泡性
圖4 pH 4時(shí)不同水解度牡蠣酶解產(chǎn)物的泡沫穩(wěn)定性
圖5 pH 6時(shí)不同水解度牡蠣酶解產(chǎn)物的泡沫穩(wěn)定性
圖6 pH 8時(shí)不同水解度牡蠣酶解產(chǎn)物的泡沫穩(wěn)定性
圖7 pH 10時(shí)不同水解度牡蠣酶解產(chǎn)物的泡沫穩(wěn)定性
數(shù)據(jù)分析表明,OH4在4種pH環(huán)境中均有較強(qiáng)的泡沫穩(wěn)定性。OH1在pH 4和6環(huán)境中,30 min內(nèi)仍具有超過50%的泡沫穩(wěn)定性。在pH 8和10環(huán)境中,60 min內(nèi)仍具有超過50%的泡沫穩(wěn)定性。表明水解度對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物泡沫穩(wěn)定性的影響也較大。
DPPH清除率是表征抗氧化劑體外抗氧化活性的重要指標(biāo)。DPPH是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基,溶于乙醇時(shí)溶液呈深紫色,有自由基清除劑存在時(shí),可與其單電子配對(duì)使其溶液褪色,吸光度下降,其褪色程度與自由基清除能力呈正相關(guān)。如圖8所示,OH0、OH1、OH2、OH3和OH4的DPPH清除率分別為35.33%,67.00%,66.00%,76.00%和72.67%。牡蠣酶解產(chǎn)物的DPPH清除率,隨著水解度增加,呈現(xiàn)先升高后降低趨勢。牡蠣經(jīng)酶解后,其DPPH清除率提高將近1倍,原因可能是酶的作用使原本隱藏在牡蠣蛋白質(zhì)內(nèi)部并且能夠增強(qiáng)肽抗氧能力的氨基酸殘基暴露出來,生成單電子配對(duì)能力強(qiáng)的產(chǎn)物,易于與DPPH結(jié)合。OH3的DPPH清除率最高為76.00%。隨著水解度增加,OH4的DPPH清除率有所下降,可能因?yàn)榭寡趸钚噪倪^度水解,單電子配對(duì)能力強(qiáng)的產(chǎn)物生成量下降,從而導(dǎo)致DPPH清除率降低。這與馬艷芳等[7]報(bào)道螺旋藻肽的DPPH清除率規(guī)律一致,隨著水解度增加,螺旋藻肽的DPPH清除率呈現(xiàn)先升高后降低趨勢。
在總還原力測定中,700 nm處的吸光度與樣品的還原能力成正比。吸光度越大,樣品的還原能力越強(qiáng)。如圖9所示,OH0、OH1、OH2、OH3和OH4的總還原力分別為0.296,0.304,0.318,0.367和0.395。牡蠣酶解產(chǎn)物的總還原力,隨著水解度增加呈現(xiàn)逐漸升高趨勢。這與周航等[8]報(bào)道鰱魚酶解產(chǎn)物總還原力的規(guī)律一致,鰱魚酶解產(chǎn)物總還原力隨水解度增加,吸光度逐漸增大,總還原力逐漸增強(qiáng)。
圖8 不同水解度牡蠣酶解產(chǎn)物的DPPH清除率
圖9 不同水解度牡蠣酶解產(chǎn)物的總還原力
試驗(yàn)采用胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成復(fù)合酶對(duì)牡蠣進(jìn)行限制性水解,獲得OH0、OH1、OH2、OH3和OH4這5種酶解產(chǎn)物,水解度分別為8.02%,24.75%,28.04%,36.98%和41.20%,考察水解度對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物功能特性(乳化性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性)和抗氧化活性(DPPH清除率和總還原力)的影響。結(jié)果表明,水解度對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物乳化性影響較小,對(duì)起泡性、泡沫穩(wěn)定性、DPPH清除率和總還原力影響較大。OH1在pH 4,6,8和10環(huán)境中均有較強(qiáng)的起泡性,在pH 6環(huán)境中起泡性最大為70.07%。在pH 4和6環(huán)境中,隨著水解度增加,牡蠣酶解產(chǎn)物起泡性呈現(xiàn)先升高后降低趨勢。在pH 8環(huán)境中,牡蠣酶解產(chǎn)物的起泡性隨著水解度的增加呈現(xiàn)逐漸降低趨勢。OH4在pH 4,6,8和10環(huán)境中均有較強(qiáng)的泡沫穩(wěn)定性。牡蠣酶解產(chǎn)物的DPPH清除率,隨著水解度增加,呈現(xiàn)先升高后降低趨勢。OH3的DPPH清除率最高為76.00%。牡蠣酶解產(chǎn)物的總還原力,隨著水解度增加呈現(xiàn)逐漸升高趨勢。OH4的總還原力最高,為0.395。