響應(yīng)面法優(yōu)化小米黃色素提取工藝

米智，劉荔貞*，武曉紅

1. 山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（大同 037009）；2. 山西大同大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院（大同 037009）

谷子（Setaria italicL.），亦稱粱、稷、粟，在植物學(xué)上屬禾本科狗尾草屬。它起源于中國，距今約有一萬多年的栽培歷史[1-2]，是世界上最為古老的雜糧農(nóng)產(chǎn)品之一。谷子脫殼后稱小米（foxtail millet），是一種藥食兩用的優(yōu)質(zhì)雜糧。小米含豐富的蛋白、脂肪、膳食纖維、多種維生素及硒、鐵等多種人體所必需的礦物質(zhì)[3]；含有豐富的賴氨酸，可用作大多數(shù)谷物的補充蛋白質(zhì)來源[4]，含有淀粉酶抑制劑、芥子油苷、多酚和單寧等化合物[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，小米中多酚類物質(zhì)具有較好的抗氧化活性[6]，具有降血糖、降膽固醇及預(yù)防潰瘍等生理功效[7-8]。小米蛋白水解產(chǎn)物還可以緩解高血壓和相關(guān)心血管疾病[9]。小米中多酚對金黃色葡萄球菌、腸膜明串珠菌、蠟狀芽孢桿菌和糞腸球菌的生長均有一定的抑制作用[10]。谷糠中的過氧化物酶（FMBP）蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其具有抗結(jié)腸癌的作用[11]。

小米顏色常見的有黃色、白色、青灰色、黃綠色等，其中90%以上谷子品種的小米是黃色，黃色的主要來源為黃色素。米色是衡量小米品質(zhì)的重要指標，小米米色越黃，即黃色素含量越高，米飯的口感越好[12]。谷子籽粒的黃色素主要在胚乳中積累，谷糠和谷殼中很少，成熟期籽粒中黃色素水平逐漸升高，過度成熟后迅速下降[13]。噴施外源硒能顯著提高谷子的黃色素含量[14]。小米黃色素主要成分為天然類胡蘿卜素，主要含有葉黃素（3, 3’-二羥基-α-胡蘿卜素）、玉米黃質(zhì)（素）（3, 3’-二羥基-β-胡蘿卜素）以及少量的隱黃質(zhì)（素）（3-羥基-β-胡蘿卜素）、β-胡蘿卜素等[15-16]。小米黃色素具有一定的耐熱性、耐還原性和耐氧化性，對光和酸性條件穩(wěn)定性較差，不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑，其乙醇提取物最大吸收波長為445～446 nm[17-18]。這些類胡蘿卜素為天然的抗氧化物質(zhì)，具有重要的醫(yī)療保健價值[19]。不僅具有保護視覺與上皮細胞的作用，而且可以提高人體免疫力，淬滅體內(nèi)過多自由基，預(yù)防多種癌癥，同時對口腔潰瘍、皮膚病等都有很好的療效[20]。小米黃色素可用作多種食品、飲料及糖果等的著色劑，具有顏色鮮明、色澤圓潤自然同時兼具營養(yǎng)保健的作用[18,21]。從生物體中提取的天然色素，相比于合成色素，具有更高的安全性及保健功效，且著色色調(diào)更接近天然物質(zhì)顏色[22-23]。

對于測定和提取小米黃色素的報道很多，而用索氏提取法測定小米黃色素鮮見報道。該方法具有選擇性好、能耗低、設(shè)備、操作簡便等優(yōu)點，適于實驗室應(yīng)用[24]；小米黃色素易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑，而且經(jīng)常用于食品工業(yè)中，因此在考慮溶劑的提取率的同時還需考慮其安全環(huán)保性。乙醇毒性低且沸點低，適于索氏提取法進行小米黃色素的提取，且使用乙醇為提取劑時回收利用方便。試驗以小米為研究對象，利用響應(yīng)面試驗探究索氏提取法提取小米黃色素的最佳工藝條件，為小米黃色素的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米（東方亮，產(chǎn)自山西廣靈）；β-胡蘿卜素標準品（美國ChromaDex公司）；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司），精密電子天平（上海精密儀器儀表有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司），紫外/可見分光光度計（上海元析儀器有限公司），高速中藥粉碎機（上海比朗儀器制造有限公司），索氏提取器（鄭州利康儀器設(shè)備有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1β-胡蘿卜素標準曲線的建立

參照王海棠等[17]的方法，并做修改。準確稱取10mgβ-胡蘿卜素標準品，加95%乙醇，在超聲波輔助下，搖勻使之充分溶解并定容至50 mL，得0.2 mg/mLβ-胡蘿卜素標準液。用95%乙醇配制不同質(zhì)量濃度梯度的β-胡蘿卜素溶液，以95%乙醇為空白對照，在445 nm處用紫外/可見分光光度計測定吸光度，測3次求平均值，做回歸處理。

1.3.2 小米處理及小米黃色素提取工藝流程

選擇無發(fā)霉、無機械傷、無病蟲害、顆粒飽滿的當年收獲的新谷子，放入電熱恒溫鼓風干燥箱中，在45～50 ℃下干燥2 h后，碾制成小米，用萬能粉碎機粉碎成小米粉末，并使小米粉通過孔徑0.200 mm篩，收集小米粉末于干燥、避光的容器中保存待用。

小米黃色素提取工藝流程：小米→粉碎→過篩→稱重→分裝→乙醇浸提→提取液定容→離心取上清→測定吸光度→計算提取量。

1.3.3 小米黃色素含量的測定方法

精確量取1 mL提取液作為待測液，方法同1.3.1，在445 nm處測吸光度，做3組平行試驗求平均值，代入線性回歸方程，得到小米黃色素的含量。

式中：C為小米黃色素質(zhì)量濃度，mg/mL；N為稀釋的倍數(shù)；V為提取液總體積，mL；W為試驗樣品的質(zhì)量，g。

1.3.4 小米黃色素提取工藝的單因素試驗

1.3.4.1 乙醇體積分數(shù)

準確稱取2 g小米粉末，在料液比為1：4（g/mL）、提取時間3.0 h、回流次數(shù)3次的前提下，設(shè)置乙醇體積分數(shù)80%，85%，90%，95%和100%提取小米黃色素，在445 nm處測定提取液的吸光度，并計算小米黃色素的提取量。

1.3.4.2 料液比

準確稱取2 g小米粉末，在乙醇體積分數(shù)95%、提取時間3.0 h、回流次數(shù)3次的前提下，設(shè)置料液比1：3，1：4，1：5，1：6和1：7（g/mL）提取小米黃色素，在445 nm處測定提取液的吸光度，并計算小米黃色素的提取量。

1.3.4.3 提取時間

準確稱取2 g小米粉末，在乙醇體積分數(shù)95%、料液比1：4（g/mL）、回流次數(shù)3次的前提下，設(shè)置提取時間1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 h提取小米黃色素，在445 nm處測定提取液的吸光度，并計算小米黃色素的提取量。

1.3.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計及統(tǒng)計學(xué)處理方法

根據(jù)小米黃色素提取工藝的單因素試驗結(jié)果，從乙醇體積分數(shù)、料液比和提取時間3個因素中，分別選取3個對小米黃色素提取量影響最大的水平，以小米黃色素提取量為考察目標，運用Design-Expert V 8.0.6.1軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，確定相應(yīng)面試驗方案，并建立回歸方程預(yù)測模型確定最佳提取工藝參數(shù)。

1.3.6 小米黃色素提取工藝的驗證性試驗和樣品加標回收率計算

為了更好地證實索氏提取法提取小米黃色素的可靠性和合理性，每個單因素試驗結(jié)果樣品多取3份，添加β-胡蘿卜素標準品溶液，計算樣品加標回收率。在響應(yīng)面試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，進行3次平行驗證性試驗，并計算相對標準偏差（σRSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以β-胡蘿卜素濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作標準曲線，得出線性回歸方程y=0.197x+0.112，R2=0.991。

2.2 小米黃色素提取工藝的單因素試驗結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分數(shù)對小米黃色素提取量的影響

由圖1可知，當乙醇體積分數(shù)低于95%時，小米黃色素提取量隨乙醇體積分數(shù)增大而提高；當乙醇體積分數(shù)為95%時，小米黃色素提取量達到最大，約為8.23 mg/kg；當乙醇體積分數(shù)超過95%后，隨著乙醇體積分數(shù)的提高，小米黃色素提取量反而略有降低。因此，在做響應(yīng)面試驗時，選取乙醇體積分數(shù)90%，95%和100%作為三水平。

圖1 乙醇體積分數(shù)對小米黃酮提取量的影響

2.2.2 料液比對小米黃色素提取量的影響

由圖2可知，小米黃色素提取量隨著料液比的增大而提高，當料液比為1：4（g/mL）時，小米黃酮提取量達到最大值，約為8.34 mg/kg；當料液比繼續(xù)增大時，小米黃色素提取量反而降低。因此，在做響應(yīng)面試驗時，選取料液比1：3，1：4和1：5（g/mL）作為三水平。

圖2 料液比對小米黃酮提取量的影響

2.2.3 提取時間對小米黃色素提取量的影響

由圖3可知，當提取時間為1.5～3.5 h時，小米黃色素提取量隨提取時間延長而提高，且提取3.5 h時小米黃色素提取量達到最大值，約為8.09 mg/kg，但提取3.0 h時的小米黃色素提取量約為8.07 mg/kg，幾乎與3.5 h時小米黃色素提取量相當。因此，在做響應(yīng)面試驗時，選取提取時間2.5，3.0和3.5 h作為三水平。

2.3 回歸模型的建立及其分析

響應(yīng)面分析因素與水平見表1。響應(yīng)面試驗方案與結(jié)果見表2。

圖3 提取時間對小米黃酮提取量的影響

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

表2 響應(yīng)面試驗方案與結(jié)果

建立小米黃色素提取工藝參數(shù)的回歸模型，獲得試驗評價指標（小米黃色素提取量）的響應(yīng)值對自變量A（乙醇體積分數(shù)）、B（料液比）和C（提取時間）的二次多項式回歸方程：小米黃色素提取量（Y）=-202.951+3.347 35×A+9.285 5×B+20.666 5×C+9.0×10-3×AB+9.0×10-3×AC-0.33×BC-0.017 79×A2-1.177 25×B2-3.179×C2。

以小米黃色素提取量為評價指標對該模型進行方差分析及模型系數(shù)進行顯著性檢驗（表3）。回歸模型在統(tǒng)計學(xué)上呈極顯著（p=0.000 5＜0.01），說明試驗?zāi)Ｐ陀薪y(tǒng)計學(xué)意義；且通過p值可知模型中變量C、B2和C2對提取量影響極顯著，B和A2對提取量影響顯著，說明試驗因素與響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系，二次項對相應(yīng)值也有很大的關(guān)系，三因素的交互作用影響相對較?。皇M項p=0.170 8＞0.05，不顯著，說明試驗?zāi)Ｐ蛿M合度較好，選擇是正確的，模型的殘差可能來源于試驗過程的隨機誤差。模型的校正決定系數(shù)R2Adj=0.903，說明小米黃色素提取量試驗中90.3%的變異分布在方程的9個因子中，其總變異僅有9.7%不能由該模型來解釋，R2=0.957 6，說明提取量的實測值與預(yù)測值之間具有較好的擬合度，該模型可用于預(yù)測小米黃色素提取量的實際情況。噪音信號比的比率為11.699（＞4），說明模型能真實地反映試驗結(jié)果；試驗的精確度為4.16%，說明試驗操作可靠。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，影響響應(yīng)值的順序為提取時間（C）＞料液比（B）＞乙醇體積分數(shù)（A），其中提取時間對小米黃色素提取量影響極顯著（p=0.001＜0.01），料液比對提取量影響顯著（p=0.036 8＜0.05）。

表3 回歸模型方差分析

通過三維響應(yīng)面圖和二維等高線圖分析顯示，隨著乙醇體積分數(shù)、料液比和提取時間的增大或延長，小米黃色素提取量也隨之增大，但當乙醇體積分數(shù)、料液比和提取時間增大或延長到一定程度后，小米黃色素提取量有下降的趨勢（圖4～圖6），三因素之間的交互作用相當，而且從等高線圖中可得，橢圓程度和疏密程度也相當，與模型回歸中的方差分析一致。

圖4 乙醇體積分數(shù)和料液比對小米黃色素提取量的響應(yīng)面圖（A）和等高線圖（B）

圖5 乙醇體積分數(shù)和提取時間對小米黃色素提取量的響應(yīng)面圖（A）和等高線圖（B）

圖6 料液比和提取時間對小米黃色素提取量的響應(yīng)面圖（A）和等高線圖（B）

2.4 最佳提取條件的確定

由響應(yīng)面法試驗分析數(shù)據(jù)可得出小米黃色素最佳提取取工藝：乙醇體積分數(shù)95.86%、料液比1：3.86（g/mL）、提取時間3.19 h。此時提取量為8.35 mg/kg?？紤]實驗室操作的可行性，修正提取工藝條件：乙醇體積分數(shù)95%、料液比1：4（g/mL）、提取時間3.0 h。

2.5 樣品加標回收率和優(yōu)化條件的驗證性試驗

通過3組樣品加標回收試驗結(jié)果計算得到回收率在93.78%～103.33%之間，說明索氏提取法提取小米黃色素準確、可靠。根據(jù)響應(yīng)面試驗篩選出小米黃色素提取的最佳工藝，進行3組平行試驗，驗證響應(yīng)面試驗結(jié)果的可靠性和準確性。由驗證性試驗測定可知，小米黃色素提取量分別為8.24，8.01和7.77 mg/kg。3組平行樣數(shù)據(jù)相對標準偏差（σRSD）為2.94%，精密度和重復(fù)性均能滿足要求，表明該提取工藝小米黃酮提取量較為穩(wěn)定。

3 結(jié)論

由響應(yīng)面試驗結(jié)果及方差分析可知，索氏提取法提取小米黃色素的最佳工藝為乙醇體積分數(shù)95%、料液比1：4（g/mL）和提取時間3.0 h。影響程度為提取時間＞料液比＞乙醇體積分數(shù)，提取時間對小米黃色素提取量影響極顯著，料液比對提取量影響顯著。樣品加標回收率為93.78%～103.33%，σRSD較小（2.94%），說明索氏提取法提取小米黃色素工藝精確、可靠。響應(yīng)面試驗?zāi)軐Ω鱾€因素及各因素之間的交互分析得更全面、更細致，能較為準確地分析出因素間最佳組合，試驗穩(wěn)定可靠，可為今后研究小米黃色素等成分的提取提供試驗依據(jù)。