高壓脈沖電場(chǎng)法提取黑果腺肋花楸中花色苷的工藝

劉子豪，趙權(quán)

1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥學(xué)院（長(zhǎng)春 130118）；2. 吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)院（吉林 132101）

黑果腺肋花楸（Aronia prunifoliaViking）為薔薇科腺肋花楸屬一種多年生落葉灌木的果實(shí)[1]，其多酚類物質(zhì)花色苷的含量最高[2]?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，黑果腺肋花揪及其提取物不僅可以抑制炎癥、降低血糖、血脂，而且其抗氧化能力更強(qiáng)[3-5]。正因花色苷在免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防代謝類疾病以及抗氧化保健等方面具有顯著的效果[6-10]，所以得到了工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。近年，黑果腺肋花楸還被列入新食品原料目錄[11]，目前多以食品、飲品、保健品等市場(chǎng)產(chǎn)品為主[12-13]。黑果腺肋花楸的果實(shí)中花色苷含量豐富，但由于花色苷性質(zhì)不穩(wěn)定，見光受熱易分解，在提取花色苷成分的過(guò)程中往往提取量偏低，造成了資源的浪費(fèi)。進(jìn)一步提高花色苷的提取率成為新的研究趨勢(shì)。

高壓脈沖電場(chǎng)（high voltage pulsed electric field，PEF）的提取原理是利用高壓電流擊穿樣品的細(xì)胞膜或者細(xì)胞壁，使其有效成分從細(xì)胞里溶出而更易于被提取，此方法最早應(yīng)用于食品殺菌領(lǐng)域[14]。由于PEF具有快速、高效、節(jié)能、產(chǎn)熱少等特點(diǎn)，在成分提取領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用[15-16]。目前，黑果腺肋花楸花色苷的提取方法常見有溶劑浸提法、超聲波輔助提取法等，但PEF在黑果腺肋花楸花色苷工業(yè)提取方面的研究較少。

試驗(yàn)采用高壓脈沖電場(chǎng)提取方法提取黑果腺肋花楸果實(shí)中的花色苷，以花色苷提取量為考察指標(biāo)，通過(guò)探究各個(gè)因素對(duì)花色苷提取效果的影響并用Box-Behnken試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)優(yōu)化，從而獲得最佳提取條件，旨在為日后的現(xiàn)代研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黑果腺肋花楸果實(shí)：吉林市大綏河黑果腺肋花楸種植基地。

矢車菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside）、矢車菊素-3-半乳糖（cyanidin-3-galactoside）和矢車菊素-3-阿拉伯糖苷（cyaniding-3-arabinoside）標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；無(wú)水乙醇、甲醇均為分析純，乙腈為色譜純，F(xiàn)isher公司；純凈水，娃哈哈。

1.2 試驗(yàn)方法

取新鮮完好的黑果腺肋花楸果實(shí)，冷水沖洗干凈，冷風(fēng)干燥后充分打碎勻漿，準(zhǔn)確稱取2.00 g果漿置于干凈的具塞瓶中，按不同比例加50%乙醇，在固定溫度下水浴加熱，旋轉(zhuǎn)真空抽濾，定容后參照徐貝貝[17]的HPLC條件檢測(cè)其花色苷含量。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)花色苷提取效果的影響

設(shè)定電場(chǎng)強(qiáng)度10，15，20，25和30 kV·cm-1，溫度為25 ℃，料液比為1：30 g·mL-1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%進(jìn)行提取，提取液旋轉(zhuǎn)真空濃縮備用，按1.2.1色譜條件進(jìn)行HPLC分析計(jì)算黑果腺肋花楸中的花色苷提取量，平行測(cè)定3次，確定最佳電場(chǎng)強(qiáng)度。

1.2.2.2 溫度對(duì)花色苷提取效果的影響

按1.2.2.1確定的最佳電場(chǎng)強(qiáng)度，設(shè)定溫度25，30，35，40和45 ℃，料液比為1：30 g·mL-1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%進(jìn)行提取，提取液旋轉(zhuǎn)真空濃縮備用，按1.2.1色譜條件進(jìn)行HPLC分析計(jì)算黑果腺肋花楸種的花色苷提取量，平行測(cè)定3次，確定最佳提取溫度。

1.2.2.3 料液比對(duì)花色苷提取效果的影響

按1.2.2.1確定的最佳電場(chǎng)強(qiáng)度，按1.2.2.2確定最優(yōu)提取溫度，設(shè)定料液比為1：20，1：30，1：40，1：50和1：60 g·mL-1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%進(jìn)行提取，提取液旋轉(zhuǎn)真空濃縮備用，按1.2.1色譜條件進(jìn)行HPLC分析計(jì)算黑果腺肋花楸中的花色苷提取量，平行測(cè)定3次，確定最佳料液比。

要想是混合式學(xué)習(xí)方法的效果可以更加充分的發(fā)揮，教師必須要改變以往的教學(xué)理念，通過(guò)自我學(xué)習(xí)等方法充分認(rèn)識(shí)到混合式學(xué)習(xí)方法的重要性與作用，養(yǎng)成開放性思想，推動(dòng)該學(xué)習(xí)方法的落實(shí)與應(yīng)用。同時(shí)學(xué)校也通過(guò)定期組織教師參加相關(guān)內(nèi)容的講座、到其他學(xué)校進(jìn)行參觀、定期對(duì)教師進(jìn)行教育培訓(xùn)等方法提高教師對(duì)混合式學(xué)習(xí)方法的認(rèn)識(shí)程度與相關(guān)專業(yè)知識(shí)的學(xué)習(xí)，進(jìn)而改變教師以往的教學(xué)理念，使教師更加積極的進(jìn)行混合式學(xué)習(xí)的教學(xué)。

1.2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷提取效果的影響

按1.2.2.1確定的最佳電場(chǎng)強(qiáng)度，按1.2.2.2確定最優(yōu)提取溫度，按1.2.2.3確定的最佳料液比，設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，50%，60%，70%和80%進(jìn)行提取，提取液旋轉(zhuǎn)真空濃縮備用，按1.2.1色譜條件進(jìn)行HPLC分析計(jì)算黑果腺肋花楸中的花色苷提取量，平行測(cè)定3次，確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

1.2.3 Box-Behnken試驗(yàn)

在單因素對(duì)提取效果影響的試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)之上，通過(guò)Design-Expert 8.0.6.1軟件建立以4個(gè)因素（料液比（A）、電場(chǎng)強(qiáng)度（B）、溫度（C）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（D））為自變量，花色苷提取量（Y）為響應(yīng)值的3水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)響應(yīng)面分析的結(jié)果確定最優(yōu)工藝條件。相關(guān)因素水平及編碼的設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平

2 結(jié)果與分析

2.1 花色苷色譜分析

由圖1的出峰時(shí)間得知，1號(hào)峰為矢車菊素-3-半乳糖苷；2號(hào)峰為矢車菊素-3-葡萄糖苷；3號(hào)峰為矢車菊素-3-阿拉伯糖苷。矢車菊素-3-半乳糖苷的標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=17 332.62X+114 270.8（R2=0.999 9）；矢車菊素-3-葡萄糖苷的標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=14 169.4X+68 199.53（R2=0.999 9）；矢車菊素-3-阿拉伯糖苷的標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=29 482.8X+85 457.36（R2=0. 999 8）。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品色譜圖

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影響

由圖2可見，電場(chǎng)強(qiáng)度在10～25 kV·cm-1之間時(shí)，花色苷的提取量隨電場(chǎng)強(qiáng)度的升高而逐漸增加。這是由于增大電場(chǎng)強(qiáng)度，細(xì)胞壁受到電場(chǎng)破壞，使在細(xì)胞中的花色苷更易溶出。當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度為25 kV·cm-1時(shí)，花色苷提取量達(dá)到最大值。繼續(xù)加大電場(chǎng)強(qiáng)度，花色苷的提取量降低，這可能是由于電場(chǎng)強(qiáng)度過(guò)大，致使花色苷降解。因此，最佳的電場(chǎng)強(qiáng)度為25 kV·cm-1，花色苷提取量為8.62 mg·g-1。

2.2.2 溫度對(duì)黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影響

由圖3可見，溫度在25～35 ℃之間時(shí)，花色苷的提取量隨溫度的升高而逐漸增加。這是由于在一定溫度下，隨著溫度的升高，花色苷在溶劑中的溶解度也逐漸增大，變得更易溶出。當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)花色苷提取量達(dá)到最大值。繼續(xù)升高溫度，會(huì)促使花色苷降解和被破壞，導(dǎo)致花色苷提取量下降。因此，最佳的溫度為35 ℃，花色苷提取量為8.67 mg·g-1。

2.2.3 料液比對(duì)黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影響

由圖4可見，料液比在1：20～1：50 g·mL-1之間時(shí)，花色苷的提取量隨料液比的增加而逐漸升高。這是因?yàn)楫?dāng)增大溶劑的用量時(shí)，樣品與溶劑充分接觸，花色苷溶出較多，提取量增加。在料液比為1：50g·mL-1時(shí)花色苷提取量達(dá)到最大值。繼續(xù)加大料液比，花色苷提取量開始降低，這可能是由于樣品已經(jīng)與溶劑充分接觸后完全溶出，且隨著溶劑的增多，樣液濃度降低。因此，最佳的料液比為1：50 g·mL-1，花色苷提取量為8.78 mg·g-1。

圖2 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影響

圖3 溫度對(duì)黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影響

圖4 料液比對(duì)黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影響

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影響

由圖5可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～70%之間時(shí)，花色苷的提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而逐漸增加。這是因?yàn)楫?dāng)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，樣品與溶劑充分接觸，花色苷溶出量增多。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)花色苷的提取量達(dá)到最大值。繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，花色苷的提取量降低，這可能是易溶于乙醇的雜質(zhì)成分溶出量增加導(dǎo)致花色苷的提取量下降。因此，最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，花色苷提取量為8.72 mg·g-1。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影響

2.3 Box-Behnken試驗(yàn)及試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果分析

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

根據(jù)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行二次方程回歸擬合，得出方程：Y=8.79+0.32A+0.43B+0.055C-0.18D+0.29AB-0.12AC+0.37AD-0.48BC-0.18BD+0.27CD-0.94A2-0.89B2-0.52C2-0.51D2。

由表3方差分析的結(jié)果可知：當(dāng)以黑果腺肋花楸花色苷的提取量為響應(yīng)值時(shí)，模型p＜0.000 1，說(shuō)明模型極具有顯著性，影響花色苷提取量的順序?yàn)锽（電場(chǎng)強(qiáng)度）＞A（料液比）＞D（乙醇體積分?jǐn)?shù)）＞C（溫度），其中因素A、B具有極顯著性（p＜0.01），A2、B2、C2、D2極具有顯著性（p＜0.01），失擬項(xiàng)p=0.113 9＞0.05不具有顯著性，表明試驗(yàn)誤差小，其結(jié)果也與模型擬合良好，可以用來(lái)分析和預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果?；貧w方程相關(guān)系數(shù)R2=0.958 1，能夠較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)實(shí)際情況。

2.3.2 響應(yīng)面分析

圖6為A（料液比）、B（電場(chǎng)強(qiáng)度）、C（溫度）、D（乙醇體積分?jǐn)?shù)）各因素之間兩兩交互對(duì)3種花色苷提取量的影響的三維響應(yīng)面曲線圖。由圖6可見，各因素交互作用顯著，A、B因素對(duì)花色苷提取量的影響具有顯著性。綜合圖6及表3可以得出，模型中的一次項(xiàng)A、B有極顯著性（p＜0.01）；AB、AC、BD、CD交互項(xiàng)（p＞0.05）都不明顯；二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2（p＜0.01）極其顯著。表明各因素對(duì)花色苷提取效果的影響非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

表3 回歸方程方差分析

2.3.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)影響黑果腺肋花楸花色苷提取量的綜合分析，得到高壓脈沖電場(chǎng)提取黑果腺肋花楸花色苷提取量的最佳工藝為電場(chǎng)強(qiáng)度21.72 kV·cm-1、溫度34.09 ℃、料液比1：51.88g·mL-1、乙醇體積分?jǐn)?shù)67.85%，為了便于實(shí)際操作，故將工藝條件修正為電場(chǎng)強(qiáng)度25 kV·cm-1、溫度35 ℃、料液比1：50 g·mL-1、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，以此條件進(jìn)行花色苷的提取，其提取量為8.79 mg·g-1，與預(yù)測(cè)值基本相符，說(shuō)明了該模型結(jié)果的準(zhǔn)確性與工藝條件的實(shí)用性。

2.4 不同提取方法對(duì)花色苷提取量的分析比較

3種花色苷單體的總含量約為總花色苷含量[18]。如圖7可知，同溶劑提取法和超聲波輔助提取法提取花色苷的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較[19-20]，高壓脈沖提取法提取花色苷的量最多。

圖7 不同提取工藝下花色苷提取量的比較分析

4 結(jié)論與討論

研究通過(guò)響應(yīng)面分析方法結(jié)合高壓脈沖電場(chǎng)提取方法提取黑果腺肋花楸果實(shí)中的花色苷，得到黑果腺肋花楸花色苷高壓脈沖提取法的最佳工藝條件為電場(chǎng)強(qiáng)度25 kV·cm-1、料液比1：50 g·mL-1、溫度35℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%。在此條件下，花色苷的提取量為8.79 mg·g-1。經(jīng)計(jì)算，PEF的花色苷提取量比其他兩種常用提取方法各提高36.70%和9.87%。與此同時(shí)，高壓脈沖提取方法不僅原材料耗費(fèi)更少、溫度更低、提取速度更快，而且更適合性質(zhì)不穩(wěn)定，見光受熱易分解等物質(zhì)的提取。