沙棘黃酮類物質(zhì)的提取及純化工藝

李曉華，宋緒磊

1. 新疆石河子職業(yè)技術(shù)學院（石河子 832000）；2. 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司（北京 100015）

沙棘果中有超過190種天然活性營養(yǎng)組分，如多種維生素、脂肪酸、氨基酸、類黃酮、酚類、萜烯類及單寧鞣質(zhì)[1]。黃酮類化合物是沙棘最重要的活性組分，主要包括異鼠李素及其配糖體、槲皮素及其配糖體、山奈酚、黃芩苷、兒茶素及楊梅酮等[2]，其營養(yǎng)價值和藥用價值非常高，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、日化等領(lǐng)域。該類提取物大多具有酚羥基結(jié)構(gòu)，可溶于極性較大的有機溶劑。在黃酮類活性物質(zhì)提取方案設(shè)計，即要考慮溶解度，又要考慮物質(zhì)的化學穩(wěn)定性。孫江曉等[3]用乙醇-水溶液提取沙棘葉中的活性組分，所得提取液以0.5～3 BV/h流速通過樹脂柱，適量水清洗樹脂柱，用體積分數(shù)為50%的乙醇溶液以0.5～2 BV流速洗脫，濃縮精制后得到淺棕色提取物，其沙棘總黃酮（苷）含量為20%～40%。該方法操作簡單、易于工業(yè)化，但溶劑損失率較高，雜質(zhì)溶出率高，黃酮提取物不易從樹脂柱上洗脫，洗脫溶劑用量比較大，樹脂預(yù)制、再生過程繁瑣。

以沙棘果渣為原料，采用索氏抽提方式提取沙棘黃酮類化合物，考察不同濃度的溶劑、提取時間、料液比對提取效果的影響；Flash快速制備色譜分離純化黃酮類提取物，綜合優(yōu)化沙棘總黃酮提取工藝和精制條件，為進一步工業(yè)推廣提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

沙棘果渣（內(nèi)蒙古赤峰）；石油醚（沸程60～90℃，國藥集團化學試劑有限公司）；乙醇（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇（色譜純，阿拉丁試劑）；X-5大孔樹脂（AR，杭州市拱墅區(qū)凱英儀器經(jīng)營部）；鐵氰化鉀（AR，天津市化學試劑三廠）；維生素C（標準品，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司）；超純水（實驗室自制）。

LG-2010高效液相色譜（島津）；PuriFlash215快速制備色譜儀（法國Interchim公司）。

1.2 黃酮類化合物提取

脫膠：沙棘果渣除雜自然風干后磨粉。三口燒瓶內(nèi)加入適量果渣粉末及HCl溶液（pH 2），料液比1︰20（g/mL），55 ℃加熱2 h后過濾，適量蒸餾水洗滌濾渣至中性，干燥待用。

脫脂：中速濾紙石油醚抽提2 h后干燥備用。取適量脫膠果渣粉末，濾紙包裹嚴密，裝入提取器內(nèi)，燒瓶內(nèi)加入適量石油醚，開啟冷凝回流，加熱燒瓶至溶劑沸騰，回流抽提2 h，停止加熱，取出濾紙包，脫脂后的沙棘果渣粉末干燥后待用。索氏提取裝置如圖1所示。

提?。悍Q取適量脫膠、脫脂后的果渣，濾紙包裹嚴密，置于提取器內(nèi)，燒瓶內(nèi)裝入一定量的乙醇溶液，加熱燒瓶至溶劑沸騰，回流抽提一定時間，旋蒸濃縮提取液，得到沙棘黃酮粗品Ⅰ。分析乙醇體積分數(shù)、料液比、抽提時間對沙棘黃酮粗品產(chǎn)量及活性影響。

圖1 索氏提取器示意圖

1.3 黃酮類化合物色譜條件

HPLC反相色譜條件[4]：色譜柱，DiamonsilTMC18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動相，甲醇-水-0.4%磷酸（40︰20︰40）；流速1.2 mL/min；紫外檢測波長330 nm；柱溫25 ℃；定量方法蘆丁標準物外標法。

1.4 黃酮類提取物純化

FLASH快速制備色譜對沙棘果渣黃酮粗品進行分離純化。天然植物提取物相對分子質(zhì)量較高，黃酮提取物具有極性多酚結(jié)構(gòu)和糖苷鏈，有一定親水性。色譜柱固定相選擇孔徑較大、非極性樹脂有助于黃酮粗品的吸附和展開分離，固定相樹脂選型X-5。

表1 X-5樹脂物理性質(zhì)

1.4.1 色譜柱裝填

干法裝填色譜柱：將75 g樹脂勻速倒入色譜柱內(nèi)，洗耳球輕輕敲打柱子兩側(cè)，使樹脂高度不再下降，真空泵與色譜柱底部相接抽出樹脂中多余空氣，將樹脂層壓縮緊密，足量淋洗劑通過色譜柱，樹脂層不再因吸附溶劑而放熱（恢復(fù)室溫），停止淋洗。

干法上樣：少量乙醇溶解500 mg沙棘黃酮粗品，加入X-5樹脂2.0 g，搖勻后旋蒸去除乙醇，將此樹脂加至色譜柱頂層，其上鋪一層脫脂棉。

完成色譜柱裝填和上樣，將其裝入快速純化制備色譜中。

1.4.2 黃酮提取物分離純化

以異鼠李素、槲皮素為參照物，對沙棘黃酮粗品純化的淋洗液可選用甲醇-水（1︰5，V/V）體系。沙棘黃酮類物質(zhì)具有2-苯基色原酮的基本構(gòu)型，在300～400 nm處（Ⅰ帶）、240～285 nm處（Ⅱ帶）具有特定的紫外吸收峰，收集2處吸收峰位置的淋洗液，旋蒸回收溶劑，30 ℃真空干燥，得到純化后的沙棘黃酮Ⅱ[5]。

1.5 還原性試驗

配制不同濃度沙棘黃酮粗品Ⅰ、沙棘黃酮Ⅱ、VC（參照物）待測溶液。移取2.5 mL待測液，加入2.5 mL 0.2 mol/L Na3PO4緩沖液（pH 6.6），2.5 mL 1%的K3[Fe(CN)6]溶液，混合液搖勻放入50 ℃烘箱20 min；加入2.5 mL 10%三氯醋酸，離心10 min（800 r/min），取5 mL離心后清液，繼續(xù)加入5 mL超純水和1 mL 0.1%的FeCl3溶液，測定700 nm下吸光度[6]。

2 結(jié)果與討論

2.1 沙棘黃酮類化合物提取

2.1.1 檢測方法建立

天然植物提取物成分繁雜，標準物質(zhì)選取困難，可根據(jù)沙棘黃酮的主要成分以槲皮素、異鼠李素為標準物質(zhì)分析提取物中總黃酮類化合物含量。標準物質(zhì)HPLC譜圖如圖2所示，槲皮素保留時間7.15 min，異鼠李素12.04 min。

圖2 槲皮素、異鼠李素標準物質(zhì)譜圖

2.1.2 均勻設(shè)計試驗

稀酸溶液與非極性溶劑石油醚對沙棘果渣的脫膠脫脂處理，可減少提取過程溶劑對非黃酮類物質(zhì)的過多溶解，減輕后續(xù)物質(zhì)純化負擔。沙棘黃酮類物質(zhì)的2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)，既有苯環(huán)類疏水非極性基團，又有酚羥基等親水極性基團，因此選擇低碳鏈具有一定極性的無毒、易回收的乙醇為提取溶劑。

在單因素探索試驗驗證基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間為主要影響因素，考慮試驗點的“均勻散布”選用混合水平均勻均勻設(shè)計表U6(32×21)設(shè)計試驗方案，以提取物中總黃酮含量為評價指標，對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，明確提取過程的主要影響因素得到最佳提取方案，試驗方案和結(jié)果見表2。

表2 試驗方案及結(jié)果

直觀分析法可知，試驗6方法所得提取物中總黃酮含量最高，可將試驗6作為較優(yōu)試驗條件。

由表3的回歸分析結(jié)果可知，R2為0.991 36，回歸方程非常顯著。對偏回歸系數(shù)進行t檢驗時，t值越大，所對應(yīng)系數(shù)越顯著，所以乙醇體積分數(shù)是最重要因素。乙醇體積分數(shù)的p＜0.01，該因素對試驗結(jié)果影響非常顯著；料液比的p在0.01～0.05之間，該因素對試驗結(jié)果影響顯著；提取時間p＞0.05，該因素對結(jié)果影響不顯著。根據(jù)偏回歸系數(shù)的正負可知，乙醇體積分數(shù)升高，增加提取劑體積，延長提取時間，有助于提高指標含量，綜合各因素主次和顯著性，最佳方案可設(shè)計為提取劑乙醇體積分數(shù)75%，料液比1︰12（g/mL），提取時間1 h。驗證此方案，提取物中總黃酮含量53.05%，如圖3。

表3 回歸分析結(jié)果

圖3 驗證試驗提取物HPLC譜圖

2.1.3 溶劑循環(huán)使用

提取液通過旋蒸脫除溶劑，溶劑回收循環(huán)進行沙棘果渣黃酮索氏提取試驗，溶劑使用次數(shù)與提取物中總黃酮含量如圖4所示，試驗方案采用乙醇體積分數(shù)75%、料液比1︰12（g/mL）、提取時間1 h。溶劑隨使用次數(shù)的增多，對黃酮的提取能力逐漸減少，在第5次使用時提取物中總黃酮含量為40.17%，之后快速降低。通過旋蒸回收溶劑，可能會存在低沸點雜質(zhì)與溶劑同時以氣態(tài)形式被冷凝后收集，不利于溶劑作為提取劑循環(huán)使用。溶劑循環(huán)次數(shù)不宜超過4次，使用回收溶劑時，可考慮補加適量新鮮溶劑，保證物質(zhì)的提取效果。

圖4 溶劑循環(huán)使用與提取物中總黃酮含量關(guān)系

2.2 沙棘黃酮提取物純化

混合物質(zhì)的純化，是根據(jù)不同組分的理化性質(zhì)差異，不同組分間在流動相、固定相中的分配系數(shù)、吸附能力、保留時間差異?；旌衔镔|(zhì)在流動相和固定相間不斷重新分配，混合物質(zhì)得到有效分離。制備色譜技術(shù)可應(yīng)用于大規(guī)模純物質(zhì)生產(chǎn)，也可用于實驗室級毫克級樣品分離純化。

2.2.1 快速制備色譜設(shè)置步驟

接通電源，啟動快速制備色譜；進入主界面→[Chemistry]→[Lamp On]→紫外燈預(yù)熱8.0 min；[Solvents]選擇methanol及water的溶劑進口；進入[Method tab]，選擇[New]新建方法或[Open]打開已有方法；進入[Parameters]設(shè)置參數(shù)，選擇methanol-water溶劑體系，[cartridge]選擇Reverse chromatographic column，[flowrate]設(shè)置默認值→[OK]；[Collection]，選擇ultraviolet detection、wavelength雙波長分別設(shè)置為300～400nm、240～285 nm→[OK]；[Collection mode]→[Threshold]→[OK]；[Rack Allocation]為默認設(shè)置→[OK]；[Gradient]界面編輯淋洗劑的洗脫梯度，梯度圖上進行拖動修改；保存方法[Save]；[Run]運行方法。

2.2.2 純化過程

采用快速制備色譜的反向色譜技術(shù)純化沙棘果渣黃酮提取物，將多種黃酮苷與非黃酮類化合物（多糖、蛋白質(zhì)等）分離。反向色譜柱裝填，固定相吸附劑選用X-5型樹脂，流動相淋洗劑選用甲醇-水（1︰5，V/V）體系。紫外檢測器的使用，可提高分離純化效率，節(jié)約淋洗溶劑。沙棘黃酮粗品Ⅰ與淋洗劑在X-5型樹脂上競爭吸附中心，黃酮粗品Ⅰ中不同組分對樹脂吸附能力差異，致使各組分保留時間不同，實現(xiàn)黃酮粗品的純化，黃酮提取物Ⅱ中總黃酮含量如圖5所示，純化后總黃酮含量為71.21%，含量較粗品Ⅰ提高33.60%。天然植物成分復(fù)雜中提取高純的單一產(chǎn)品難度較大。

圖5 黃酮提取物Ⅱ中總黃酮含量HPLC圖

2.3 沙棘黃酮提取物活性分析

天然抗氧化作用是沙棘黃酮提取物的主要生物活性?？寡趸饔弥饕獧C制是自由基清除能力，抗氧化組分作為氫供體與制劑自由基反應(yīng)生成惰性化合物，終止鏈式自由基反應(yīng)。理論上，較低的提取溫度有助于提取物生物活性的保留，在乙醇提取黃酮類化合物過程中可能存在活性物質(zhì)的失活，隨提取劑溶出的雜質(zhì)可能會抑制活性組分的抗氧化能力，沙棘黃酮類提取物的抗氧化活性有待進一步驗證。

生化反應(yīng)中，F(xiàn)e3+離子可催化Haber-Weiss反應(yīng)中O2+生成·OH；Cu2+可催化低密度脂蛋白LDL氧化。物質(zhì)還原能力的大小可反應(yīng)其清除自由基能力，黃酮類化合物可絡(luò)合過渡態(tài)的Fe3+、Cu2+等金屬離子，終止其催化氧化自由基反應(yīng)[7]，避免體內(nèi)形成過量·OH和其他活性氧自由基，達到防衰老、抗腫瘤、保護心腦血管的目的。

圖6 3種物質(zhì)還原能力

具有還原性的活性物質(zhì)可還原Fe3+成Fe2+，通過顯色反應(yīng)來判斷Fe3+的還原程度，700 nm處的吸光度越高，說明物質(zhì)的還原能力越強。試驗測定VC、純化黃酮Ⅱ和黃酮提取物粗品Ⅰ的還原能力，試驗結(jié)果見圖6。3種物質(zhì)的還原性隨質(zhì)量濃度升高而增長，VC還原能力最高，純化黃酮Ⅱ次之，黃酮粗品Ⅰ的還原能力最低。純化黃酮Ⅱ質(zhì)量濃度0.50 mg/mL時，吸光度達到0.21，之后隨著質(zhì)量濃度增長，其還原性增長的趨勢平緩。由此推測，黃酮粗品I中所含的雜質(zhì)，抑制其抗氧化活性。

3 結(jié)論

對沙棘總黃酮的提取、分離純化及還原能力開展試驗研究并取得進展。以沙棘果渣為原料，采用索氏抽提方式提取沙棘黃酮類化合物，考察不同乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間對總黃酮含量的影響，通過均勻設(shè)計試驗和回歸分析得到，乙醇體積分數(shù)對指標影響非常顯著、料液比的影響顯著、提取時間果影響不顯著。最佳方案為提取劑乙醇體積分數(shù)75%、料液比1︰12（g/mL）、提取時間1 h。在此條件下，提取物中總黃酮含量53.05%。從提取物中總黃酮含量分析，提取劑回收循環(huán)利用不易超過4次。Flash快速制備色譜分離純化黃酮類提取物，固定相吸附劑選用X-5型樹脂，流動相淋洗劑選用甲醇-水（1︰5，V/V）體系，純化后總黃酮含量為71.21%，天然植物成分復(fù)雜中提取高純的單一產(chǎn)品難度較大。沙棘黃酮提取物還原能力分析發(fā)現(xiàn)，在相同濃度下，純化黃酮Ⅱ的還原能力優(yōu)于黃酮粗品Ⅰ。