糖基化改性大豆蛋白溶解特性

盧亞東，梁亞萍，王愈，陳振家

1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（晉中 030801）；2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院（晉中 030801）

大豆中蛋白質(zhì)含量較高而且營(yíng)養(yǎng)豐富，其蛋白質(zhì)含量約為38%，是谷類的4～5倍，除糖類較低外，其他營(yíng)養(yǎng)成分，如脂肪、鈣、磷、鐵和維生素B1、B2等人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都明顯高于谷類和薯類食物[1]。大豆蛋白含有8種人體必需氨基酸，且比例比較合理，只是賴氨酸含量相對(duì)稍高，而蛋氨酸和半胱氨酸含量較低[2]。大豆蛋白是一種重要的蛋白資源，特別是大豆分離蛋白，含蛋白質(zhì)90%以上，是一種優(yōu)良的食品原料[3]。用于大豆分離蛋白改性的方法很多，通過(guò)物理法、化學(xué)法或生物酶法可對(duì)大豆蛋白進(jìn)行改性，經(jīng)改性后的大豆蛋白功能特性得到改善，常用的是化學(xué)法，主要有酸作用、磷酸化、酯化、?；吞腔?。其中，糖基化修飾由于其具有自發(fā)進(jìn)行，無(wú)需添加化學(xué)試劑，加熱即可加速反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)而成為一種較為理想的改性方法[4]。試驗(yàn)的大豆蛋白糖基化改性是利用大豆蛋白自身糖分，使其氨基酸與多羥基化合物葡萄糖在堿性環(huán)境中發(fā)生美拉德反應(yīng)（羰氨反應(yīng)），生成葡萄糖-大豆分離蛋白復(fù)合物，促使蛋白結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，提升大豆蛋白功能特性與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[5-7]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)原料

脫脂豆粕：山東山松生物制品有限公司（蛋白質(zhì)≥51%）。

1.1.2 主要試劑

石油醚、無(wú)水乙醇、甲醇、氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸、濃硫酸（均為分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；考馬斯亮藍(lán)G250、SDS、β-巰基乙醇、溴酚藍(lán)、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺、過(guò)硫酸銨、氫氧化鉀、甘油、低分子量蛋白質(zhì)Marker（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.3 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

DYY-7C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；723可見分光光度計(jì)（上海菁華科技有限儀器公司）；HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-III循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；TS-2000多用脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；HC-2064高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆分離蛋白的提取

采用堿提酸沉法將脫脂大豆內(nèi)的蛋白質(zhì)溶解在稀堿溶液中，50 ℃恒溫?cái)嚢? h，離心除去豆粕中的不溶物，用酸將大豆蛋白提取液的pH調(diào)至等電點(diǎn)，使大豆蛋白沉淀析出，再經(jīng)分離水洗，回調(diào)pH至中性，冷凍干燥備用[2,8-9]。

1.2.2 糖基化改性大豆蛋白

采用堿提酸沉法將脫脂大豆內(nèi)的蛋白質(zhì)溶解在稀堿溶液中，50 ℃恒溫?cái)嚢? h，離心除去豆粕中的不溶物，用酸將大豆蛋白提取液的pH調(diào)至等電點(diǎn)，使大豆蛋白沉淀析出，經(jīng)分離水洗，按一定比例加入5%的葡萄糖，置于95 ℃水浴攪拌，反應(yīng)一段時(shí)間后水浴冷卻，調(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn)，回調(diào)pH至中性，冷凍干燥備用[5]。

1.2.3 不同溫度下的溶解度

配制1%蛋白溶液攪拌均勻后，于不同溫度梯度（50，60，70，80，90和100 ℃）恒溫水浴下加熱1 h，調(diào)節(jié)至pH 7，取1 mL樣液，離心后取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中蛋白濃度。

1.2.4 不同pH下的溶解度

配制1%蛋白溶液攪拌均勻后，調(diào)節(jié)pH（2，3，4，4.5，5，6，7，8，9，10，11和12），于不同梯度下取1 mL樣液，離心后取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中蛋白濃度。

1.2.5 不同離子強(qiáng)度下的溶解度

配制1%的蛋白溶液攪拌均勻后，稱取氯化鈉以配備不同濃度（0.01，0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90和1.00 mol/L）的鹽離子溶液，各取1 mL樣液，離心后取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中蛋白濃度。

1.2.6 SDS-PAGE電泳

依照Laemmli[10]的方法。濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，樣品上樣量5 μL。恒壓電泳，電流16 mA，濃縮膠電壓100 V，分離膠電壓150 V。電泳結(jié)束后，電泳膠片先固定3 h后，染色，脫色結(jié)束后，用成像儀進(jìn)行成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖基化改性前后大豆蛋白的溶解度

2.1.1 溫度對(duì)改性前后大豆蛋白溶解度的影響

由圖1可知，溫度70～90 ℃之間，未改性的大豆蛋白溶解度下降明顯，這是由于熱動(dòng)能的增加破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)氫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開（變性），蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，促使蛋白質(zhì)聚集沉淀。

90～100 ℃溶解性增加，可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高導(dǎo)致蛋白亞基和展開的肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生折疊，使上清液中的蛋白濃度略有增大[11-12]。

圖1 溫度對(duì)改性前后大豆蛋白溶解度的影響

糖基化改性大豆蛋白在50～90 ℃溶解性增加，80～90 ℃尤為明顯。這是由于糖基化反應(yīng)在大豆蛋白表面接枝糖分子并引入親水性羥基，大豆蛋白與水分子之間的作用增強(qiáng)，且接枝的糖分子使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)增大并趨于穩(wěn)定，阻礙蛋白質(zhì)分子聚集，從而增大蛋白質(zhì)的溶解度[12-14]。90～100 ℃溶解度降低，是由于糖基化使大豆蛋白部分分子結(jié)構(gòu)得以展開，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，使其數(shù)量增加，分子間的疏水作用增強(qiáng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子相互聚集沉淀從而使溶解性降低[13]。

2.1.2 pH對(duì)改性前后大豆蛋白溶解度的影響

由圖2可知，大豆分離蛋白的溶解度和溶液pH的變化有密切關(guān)系，成明顯的U字型結(jié)構(gòu)。pH在4.3等電點(diǎn)附近時(shí)大豆蛋白的溶解性最低，pH 2～4.3蛋白溶解度隨pH升高而降低，pH 4.3～12之間蛋白溶解度隨pH升高而升高，pH 12時(shí)達(dá)到最大。因?yàn)榇蠖沟鞍追肿雍邪被土u基，是兩性分子。在酸性介質(zhì)中，蛋白質(zhì)分子主要以正離子狀態(tài)存在，電荷相互排斥，分子分散性好，溶解度較高；隨著pH升高，蛋白質(zhì)所帶電荷被中和，由電荷引起的各殘基之間的靜電排斥力消失，蛋白質(zhì)分子便緊密地排列在一起，降低與水分子的結(jié)合能力，此時(shí)蛋白質(zhì)最不穩(wěn)定；隨著pH繼續(xù)升高，大豆蛋白變?yōu)樨?fù)離子，電荷相互排斥，溶解度升高[15]。

圖2 pH對(duì)改性前后大豆蛋白溶解度的影響

改性后的大豆蛋白在等電點(diǎn)附近的溶解度略微高于未改性的大豆蛋白，但在其余兩側(cè)溶解性比未改性的大豆蛋白低。這是因?yàn)樘欠肿拥倪€原末端與大豆蛋白的自由氨基發(fā)生反應(yīng)，減少了大豆蛋白所帶的正電荷，相對(duì)增加其所帶的負(fù)電荷，使其在等電點(diǎn)處溶解性增強(qiáng)。

糖基化修飾使大豆蛋白在等電點(diǎn)區(qū)域具有了更好的親水性，在等電點(diǎn)附近有較高的溶解度，這在食品加工中有很重要的應(yīng)用。在偏離等電點(diǎn)的范圍，糖基化改性大豆蛋白的溶解性表現(xiàn)出降低趨勢(shì)。

2.1.3 離子強(qiáng)度對(duì)改性前后大豆蛋白溶解度的影響

由圖3可知，離子強(qiáng)度0.01～0.05 mol/L時(shí)，未改性大豆蛋白溶解度降低，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)溶液凈電荷量增加，因此帶上較厚的水化膠層導(dǎo)致大豆蛋白的溶解性下降；離子強(qiáng)度0.05～0.5 mol/L時(shí)，溶解度升高，是由于鹽離子結(jié)合親水基，增加蛋白質(zhì)分子表面的電荷，從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子與水分子的作用，使蛋白質(zhì)溶解度增大，這種現(xiàn)象稱為鹽溶；離子強(qiáng)度0.5～1.0 mol/L時(shí)，溶解度降低，是由于高濃度中性鹽，破壞蛋白質(zhì)的水化層和電荷，從而使蛋白質(zhì)沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析[16]。

改性后大豆蛋白在離子強(qiáng)度大于0.3 mol/L范圍內(nèi)溶解度不斷升高，這是由于蛋白與糖分子的結(jié)合比較緊密，蛋白質(zhì)基本不受高鹽的影響。

圖3 離子強(qiáng)度對(duì)改性前后大豆蛋白溶解性的影響

2.2 糖基化改性大豆蛋白組分SDS-PAGE分析

2.2.1 溫度變化

由圖4可知，非還原電泳圖譜中濃縮膠頂端顏色較深條帶在還原電泳中消失，而非還原電泳圖譜中條帶顏色很淺的B亞基和A3亞基在還原電泳中顏色變深，說(shuō)明不同溫度下糖基化大豆蛋白的B亞基和A3亞基通過(guò)分子間或分子內(nèi)二硫鍵形成分子質(zhì)量較大的可溶性聚集體。隨著溫度升高，濃縮膠頂端條帶顏色加深，說(shuō)明溫度升高加劇B亞基的聚集。隨著溫度升高，糖基化大豆蛋白的非還原電泳圖譜變化不大，而還原電泳圖譜中分離膠頂端的條帶顏色在100 ℃明顯變淺，結(jié)合圖1數(shù)據(jù)，說(shuō)明這部分大分子亞基在溫度從90 ℃到100 ℃的過(guò)程中變?yōu)椴蝗苄跃奂w，導(dǎo)致糖基化大豆蛋白溶解度出現(xiàn)大幅下降的結(jié)果[17]。

圖4 糖基化改性大豆蛋白非還原（N）和還原（R）電泳圖譜

2.2.2 pH變化

由圖5可知，非還原電泳圖譜中，等電點(diǎn)附近幾乎沒有條帶，而在還原電泳圖譜中雖能辨識(shí)α、A和B亞基，但顏色非常淺，與圖2結(jié)果相符。非還原和還原電泳圖譜中，pH 2的亞基條帶中β亞基缺失，說(shuō)明在酸性條件下β亞基的溶解性差。此外，非還原電泳圖譜中隨著等電點(diǎn)右側(cè)pH升高，B亞基條帶的顏色逐漸加深，說(shuō)明堿性增強(qiáng)有助于B亞基聚集體二硫鍵的斷裂。還原電泳圖譜中，等電點(diǎn)右側(cè)不同pH的亞基分布相似，說(shuō)明隨著pH升高，所有亞基的溶解度均有升高。

圖5 糖基化改性大豆蛋白非還原（N）和還原（R）電泳圖譜

2.2.3 離子強(qiáng)度變化

圖6可知，對(duì)比溫度條件和pH條件，非還原電泳圖譜中濃縮膠頂端條帶消失，說(shuō)明離子強(qiáng)度增加導(dǎo)致這部分亞基發(fā)生聚集變?yōu)椴豢扇苄跃奂w。隨離子強(qiáng)度增加，還原電泳圖譜中分離膠頂端的亞基條帶和B亞基逐漸消失又逐漸恢復(fù)，對(duì)照?qǐng)D3的結(jié)果分析可知，隨著離子強(qiáng)度增加，分離膠頂端的亞基條帶和B亞基的溶解度呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)，這是造成糖基化大豆蛋白溶解度變化的主要原因。

圖6 糖基化改性大豆蛋白非還原（N）和還原（R）電泳圖譜

3 結(jié)論

糖基化改性大豆蛋白隨著溫度的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在90 ℃達(dá)到最高；隨著pH增大呈現(xiàn)先減小后增大趨勢(shì)，pH在4.3等電點(diǎn)附近時(shí)大豆蛋白的溶解性最低；隨著鹽離子濃度增加，其溶解性先增大后減小再增大。SDS-PAGE結(jié)果表明，不同溫度下糖基化大豆蛋白的B亞基和A3亞基通過(guò)分子間或分子內(nèi)二硫鍵形成分子質(zhì)量較大的可溶性聚集體，加入β-ME后，部分大分子亞基形成不溶性聚集體；酸性條件下糖基化大豆蛋白表現(xiàn)出β亞基的缺失，而堿性條件下則有利于B亞基聚集體二硫鍵的斷裂從而提高溶解度；隨著離子強(qiáng)度增加，糖基化大豆蛋白B亞基的溶解度呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)。