G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)因子2在調(diào)控口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、侵襲中的作用及分子機(jī)制

林承重 劉喆麒 周文凱 季彤 曹巍

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔第二門(mén)診部，國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海200011；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面-頭頸腫瘤科，國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海200011

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcino‐ma，OSCC）是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，約占全身惡性腫瘤的3%。全球每年新發(fā)OSCC 病例超過(guò)28 萬(wàn)，死亡人數(shù)可達(dá)13 萬(wàn)[1]。雖然在過(guò)去的30年里，OSCC的診治規(guī)范得到不斷完善，但患者5 年生存率僅50%~60%，如何進(jìn)一步提高患者的治療療效和改善生存質(zhì)量是臨床亟需解決的問(wèn)題[2]。區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移一直是OSCC 治療面臨的最大難題，也被認(rèn)為是影響患者預(yù)后的首要因素。探究OSCC發(fā)展及轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的特殊性，挖掘新的相關(guān)生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高OSCC的臨床診治效果具有重要意義。

G 蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)因子（regulator of G-protein signaling，RGS）2是G 蛋白偶聯(lián)蛋白的抑制因子，其在各類(lèi)生理功能如血壓及神經(jīng)功能的調(diào)節(jié)中起重要作用[3-4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，RGS2 在部分惡性腫瘤如乳腺癌[5]、前列腺癌[6]及急性髓樣白血病[7]等中表達(dá)顯著下調(diào)，而且與腫瘤的增殖及分化有關(guān)。增強(qiáng)RGS2 表達(dá)能顯著抑制骨髓細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，而抑制RGS2 能促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖能力。RGS2 蛋白在細(xì)胞中的快速降解主要由蛋白質(zhì)泛素化相關(guān)E3 連接酶復(fù)合體的介導(dǎo)[8]，RGS2 在OSCC中的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究旨在通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析以及OSCC細(xì)胞系的細(xì)胞生物學(xué)研究，探討RGS2 在OSCC 中的作用，并通過(guò)泛素化水平分析探索RGS2 在OSCC 中的調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞及培養(yǎng)

人OSCC細(xì)胞系（HN4、HN6、HN30、Cal-27、SCC-9、Fadu）和人胚胎腎細(xì)胞HEK293T 由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面頭頸腫瘤實(shí)驗(yàn)室提供，永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院（北京）細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的高糖改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基（Dul‐becco's modified Eagle media，DMEM），置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2 主要試劑

胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、高糖DMEM（Gibco公司，美國(guó)）；蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；基質(zhì)膠（Matrigel）（BD公司，美國(guó)）；Transwell 小室（Millipore 公司，美國(guó)）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit，CCK）-8（Dojindo公司，日本）；結(jié)晶紫、4%多聚甲醛（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；RGS2 過(guò)表達(dá)慢病毒載體、陰性對(duì)照慢病毒載體（廣州銳博生物有限公司）；pACT2 空載質(zhì)粒、pACT2-RGS2 質(zhì)粒、pGBKT7 空載質(zhì)粒、pGBKT7-FHL1 質(zhì)粒、RGS2-HA 質(zhì)粒、RGS2-Flag 質(zhì)粒（北京義翹神州生物技術(shù)有限公司）；β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體、RGS2抗體（Abcam 公司，美國(guó)）；人流感病毒血凝素（HA）抗體、旗幟蛋白（Flag）抗體、IRDye?800熒光標(biāo)記二抗（Sigma 公司，美國(guó)）；泛素化蛋白（Ub）抗體、DNA 損傷結(jié)合蛋白（damage DNA-binding protein，DDB1）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫 酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（Santa Cruz公司，美國(guó)）。

1.3 檢測(cè)RGS2 在OSCC 組織、細(xì)胞系中的表達(dá)水平

1.3.1 數(shù)據(jù)庫(kù)分析 利用UCSC Xena 數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站（https://xenabrowser.net） 分析 RGS2 mRNA 在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌及配對(duì)癌旁組織中表達(dá)情況，分析RGS2與腫瘤臨床病理特征、預(yù)后等相關(guān)性。

1.3.2 蛋白印跡法檢測(cè) 通過(guò)蛋白印跡法檢測(cè)OS‐CC 細(xì)胞系 （HN4、HN6、HN30、Cal-27、SCC-9、Fadu）及角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT中RGS2的表達(dá)情況：細(xì)胞總蛋白提取、定量，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，以400 V恒電壓轉(zhuǎn)膜70 min，轉(zhuǎn)移至0.22 μm孔徑的偏二氟乙烯膜中，5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，一抗4 ℃搖床過(guò)夜孵育，用IRDyeTM800熒光標(biāo)記二抗避光室溫孵育1 h，最后用ODYS‐SEY成像系統(tǒng)（LI-COR公司，美國(guó)）掃膜。

1.4 檢測(cè)RGS2對(duì)OSCC細(xì)胞侵襲能力的影響

1.4.1 RGS2 穩(wěn)定過(guò)表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染及驗(yàn)證選取RGS2相對(duì)最低表達(dá)的3個(gè)OSCC細(xì)胞系（SCC-9、Cal-27、Fadu），根據(jù)說(shuō)明書(shū)分別轉(zhuǎn)染RGS2過(guò)表達(dá)慢病毒（Lentiv-RGS2）、陰性對(duì)照慢病毒（Len‐tiv-control），構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)RGS2 的細(xì)胞株（Lentiv-RGS2 組）和陰性對(duì)照細(xì)胞株（Lentiv-con‐trol 組），用于后續(xù)檢測(cè)RGS2 對(duì)OSCC 細(xì)胞增殖、侵襲能力影響的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)蛋白印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.4.2 Transwell 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 分別取SCC-9、C-al-27、Fadu細(xì)胞的Lentiv-RGS2組和Lentiv-control組細(xì)胞，預(yù)先饑餓處理24 h；將Matrigel 膠與無(wú)血清培養(yǎng)基1∶3 的比例混勻，取40 μL 混合液均勻地鋪在Transwell 小室的內(nèi)室，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中干燥1 h；將預(yù)處理后的Lentiv-RGS2 組和Lentivcontrol 組細(xì)胞，消化、收集，用含1%的培養(yǎng)液重懸并細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每組5×104個(gè)細(xì)胞加入Transwell上室的內(nèi)室，下室24 孔板中加入600 μL 含10%FBS的培養(yǎng)基，共計(jì)6組，每組重復(fù)3復(fù)孔；37 ℃培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色20 min，濕棉簽輕柔擦去上室未穿出的細(xì)胞，倒置光學(xué)顯微鏡下每個(gè)樣本隨機(jī)取5個(gè)視野進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)，取平均值。

1.5 檢測(cè)RGS2對(duì)OSCC細(xì)胞增殖能力的影響

1.5.1 CCK-8 法細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)檢測(cè) 取SCC-9、Cal-27、Fadu 細(xì)胞的 Lentiv-RGS2 組和 Lentiv-con‐trol 組細(xì)胞，消化、收集、計(jì)數(shù)，以每孔2×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，共計(jì)6組，每組重復(fù)3個(gè)復(fù)孔。將CCK-8 試劑和培養(yǎng)液以1∶10 的體積比例混勻，加入待測(cè)孔中，37 ℃含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光度值，并記錄，連續(xù)測(cè)定4 d，繪制出細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

本研究對(duì)47例老年肺炎患者及20例健康老人的血清PCT、hs-CRP及D-Dimer水平進(jìn)行了檢測(cè)和比較，結(jié)果顯示老年肺炎患者血清PCT、hs-CRP及D-Dimer水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，可能是因?yàn)榘l(fā)生肺炎等肺部疾病時(shí)，患者機(jī)體存在的炎癥反應(yīng)會(huì)激活機(jī)體應(yīng)急反應(yīng)及凝血系統(tǒng)，最終表現(xiàn)為上述3個(gè)指標(biāo)的升高，本研究還發(fā)現(xiàn)高危組老年肺炎患者血清PCT、CRP及D-Dimer水平明顯高于中危及低危2組患者，且其升高水平與肺炎嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，隨著患者病情越重，其濃度越高。

1.5.2 克隆形成實(shí)驗(yàn) 取SCC-9、Cal-27、Fadu 細(xì)胞的Lentiv-RGS2 組和Lentiv-control 組細(xì)胞，消化、收集、計(jì)數(shù)，分別取1×103個(gè)細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻，培養(yǎng)10 d；4%多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色20 min，清洗、干燥后掃描、計(jì)數(shù)。

1.6 檢測(cè)RGS2與FHL1、DBB1蛋白的相互作用

1.6.1 酵母雙雜交技術(shù)檢測(cè)RGS2 與FHL1 蛋白間的直接相互作用 用酵母轉(zhuǎn)化PEG/LiAC法將pACT2 空載質(zhì)粒、pACT2-RGS2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 AH109 酵母菌株，制成感受態(tài)細(xì)胞。再將pGBKT7 空載質(zhì)粒、pGBKT7-FHL1 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后同時(shí)涂布在二缺板SD-2（SD-Leu-Trp）和4 缺板SD-4（SD-Leu-Trp-His-Ura）的營(yíng)養(yǎng)缺陷板，檢測(cè)感受態(tài)細(xì)胞在各板中的生長(zhǎng)情況，如果pACT2-RGS2+pGBKT7-FHL1 共轉(zhuǎn)染菌株能在SD-4 上生長(zhǎng)說(shuō)明有自激活效應(yīng)，RGS2 和FHL1 蛋白存在直接相互作用。

1.6.2 谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase，GST）蛋白沉降實(shí)驗(yàn) 以GST-FHL1 融合蛋白為誘餌蛋白，帶HA 標(biāo)簽的RGS2 蛋白（RGS2-HA）為捕獲蛋白，利用GST 蛋白沉降實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證RGS2 與FHL1 蛋白的直接結(jié)合：HEK293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染RGS2-HA 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞，在免疫共沉淀裂解液中裂解，將GST 和GST-FHL1融合蛋白分別加入含有RGS2-HA 的細(xì)胞裂解液，然后分別加入等量谷胱甘肽瓊脂糖凝膠（GSH-beads），并補(bǔ)充緩沖液到總體積500 μL，4 ℃充分混勻4 h，蛋白印跡法檢測(cè)GST-FHL1 組、GST 組、GSH-beads組HA標(biāo)簽的蛋白水平。

1.6.3 免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)DBB1、FHL1 與RGS2的結(jié)合 將帶有Flag 標(biāo)簽的RGS2 質(zhì)粒（RGS2-Flag） 和帶有 HA 標(biāo)簽的 FHL1 質(zhì)粒 （FHL1-HA）轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，分為RGS2-Flag 組、RGS2-Flag+FHL1-HA組，轉(zhuǎn)染48 h后收取細(xì)胞，RIPA裂解液進(jìn)行裂解，其中留取50 μL上清樣本，加入5×十二烷基硫酸鈉樣品緩沖液，煮沸10 min，?20 ℃保存留作陽(yáng)性對(duì)照的樣品（Input）。加入1 μg抗體，充分混勻后4 ℃過(guò)夜。再加入20 μL用細(xì)胞裂解液平衡過(guò)的G蛋白修飾瓊脂糖珠，4 ℃充分混勻4 h。加 1 mL 細(xì)胞裂解液，4 ℃、1 000 r·min-1離心3 min，棄上清液，重復(fù)洗滌3次。蛋白印跡法檢測(cè)樣品泛素蛋白（ubiquitin，Ub）、蛋白質(zhì)泛素化相關(guān)E3連接酶復(fù)合體主要蛋白DDB1水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，RGS2 過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RGS2 在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)水平及其臨床病理相關(guān)性

來(lái)自TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)44 例頭頸鱗狀細(xì)胞癌及匹配的癌旁組織中RGS2 表達(dá)分析顯示，RGS2 在頭頸鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)顯著低于對(duì)應(yīng)的癌旁組織（P=0.023）（圖1A）。進(jìn)一步基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析514 例頭頸鱗狀細(xì)胞癌患者的RGS2 表達(dá)水平與腫瘤大小、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后等臨床相關(guān)性，如表1 所示，RGS2 高表達(dá)患者的腫瘤病理淋巴血管侵犯顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），而與臨床腫瘤大小、臨床淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤部位、患者性別、神經(jīng)侵犯等無(wú)顯著相關(guān)。預(yù)后相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，RGS2 水平與患者總體生產(chǎn)率無(wú)明顯相關(guān)性（圖1B），但在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的頭頸鱗狀細(xì)胞癌亞群中，RGS 高表達(dá)的患者具有更好的總生存率（Log Rank檢驗(yàn)P=0.005）（圖1C）。

表 1 RGS2表達(dá)與頭頸鱗狀細(xì)胞癌臨床病理相關(guān)性分析Tab 1 Associations between RGS2 expression and the indicated clinical and histopathological categories

圖 1 RGS2在頭頸鱗癌中的表達(dá)水平及其臨床預(yù)后相關(guān)性Fig 1 The expression and the clinical significance of RGS2 in HNSCC

2.2 RGS2 在OSCC 細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)OSCC 細(xì)胞侵襲能力的影響

通過(guò)蛋白印跡法檢測(cè)OSCC細(xì)胞系以及永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT中RGS2蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，RGS2 蛋白在OSCC 細(xì)胞系中的表達(dá)低于HaCaT 細(xì)胞中表達(dá)，其中 SCC-9、Cal-27、Fadu 細(xì)胞表達(dá)水平最低（圖2A）。

進(jìn)一步將SCC-9、Cal-27、Fadu 細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染，構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)RGS2的細(xì)胞株（Lentiv-RGS2組）和空載對(duì)照細(xì)胞株（Lentiv-control 組），如圖2B 所示，Lentiv-RGS2 組 RGS2 蛋白表達(dá)顯著高于Lentiv-control組。

通過(guò)Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，如圖2C 所示，在SCC-9、Cal-27、Fadu 三個(gè)細(xì)胞系中，相比于Lentiv-control 組，Lentiv-RGS2 組細(xì)胞的侵襲能力均顯著減弱（P<0.001）。

圖 2 RGS2在口腔鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響Fig 2 The expression level and the effect of Lentiv-RGS2 transfection on invasion of OSCC cell lines

2.3 RGS2 對(duì)OSCC細(xì)胞增殖能力的影響

通過(guò)CCK-8檢測(cè)RGS2過(guò)表達(dá)后的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，如圖3A 所示，相比于Lentiv-control 組，Len‐tiv-RGS2組細(xì)胞的增殖能力均顯著減弱（P<0.001）?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)也表明，Lentiv-RGS2 組細(xì)胞的克隆形成能力顯著下降（P<0.001）（圖3B）。

圖 3 RGS2對(duì)OSCC細(xì)胞增殖能力的影響Fig 3 Effects of RGS2 overexpression on OSCC cell proliferation

2.4 RGS2與FHL1蛋白的相互作用

基于已有的cDNA文庫(kù)分析，采用酵母雙雜交方法證實(shí)RGS2 能與FHL1 直接相互作用，如圖1所示，ACT2-RGS2 或pGBKT7-FHL1 分別轉(zhuǎn)染后的菌株可在SD-2 營(yíng)養(yǎng)缺陷板上生長(zhǎng)，不能在SD-4營(yíng)養(yǎng)缺陷板上生長(zhǎng)，而ACT2-RGS2 和pGBKT7-FHL1 共轉(zhuǎn)染后的菌株，可在SD-4 營(yíng)養(yǎng)缺陷板上生長(zhǎng)，說(shuō)明RGS2與FHL1蛋白存在直接相互作用。

GST 蛋白沉降實(shí)驗(yàn)顯示，GST-FHL1 組 HA 標(biāo)簽蛋白（RGS-HA）水平呈現(xiàn)明顯的高豐度，而GST 蛋白或GSH-beads 組無(wú)HA，說(shuō)明GST-FHL1能夠特異性結(jié)合RGS2，而GST 蛋白不能沉淀RGS2（圖4B）。

2.5 FHL1與DDB1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RGS2的檢測(cè)結(jié)果

免疫共沉淀技術(shù)結(jié)果顯示，RGS2-Flag+FHL1-HA 組RGS2 的泛素化水平降低（圖5A），RGS2-Flag+FHL1-HA 組 Flag 標(biāo)簽蛋白共沉淀的 DDB1 蛋白顯著少于RGS2-Flag 組（圖5B），說(shuō)明RGS2 與DDB1 的結(jié)合減弱，這說(shuō)明FHL1 可競(jìng)爭(zhēng)性與RGS2相結(jié)合，從而降低RGS2的泛素化水平。

3 討論

G蛋白偶聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)通路是真核細(xì)胞中最重要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，目前已經(jīng)證實(shí)，G蛋白信號(hào)通路在一系列惡性腫瘤包括頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中，可以直接激活表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）或EGFR 非依賴(lài)性信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9-10]。

RGS蛋白家族是一類(lèi)具有120個(gè)氨基酸殘基保守序列的蛋白家族，RGS 家族成員通過(guò)加速三磷酸鳥(niǎo)苷（guanosine triphosphate，GTP）水解調(diào)控G蛋白信號(hào)通路，參與不同生物學(xué)過(guò)程，如淋巴細(xì)胞分化和腫瘤形成[11-12]。RGS2 是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量2.4×104的蛋白，最早是在人淋巴細(xì)胞激活基因篩選中被發(fā)現(xiàn)的，一些細(xì)胞應(yīng)激、細(xì)胞周期或是分化狀態(tài)能夠調(diào)控RGS2的表達(dá)，因其具有G 蛋白調(diào)控區(qū)域，能夠顯著抑制G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)，因而被命名為RGS2[13-14]。近期研究發(fā)現(xiàn)，RGS2的表達(dá)變化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，包括乳腺癌[5]、卵巢癌[15]、前列腺癌[6]、急性髓樣白血病[7]等。然而，目前有關(guān)RGS2在腫瘤進(jìn)展中的具體作用尚無(wú)定論。多數(shù)研究認(rèn)為，RGS2 可能是一個(gè)抑癌基因，其在肺腺癌、前列腺癌等腫瘤組織中表達(dá)顯著低于其在癌旁組織中的表達(dá)，而且低表達(dá)RGS2患者的5 年生存率顯著低于高表達(dá)RGS2 的患者。而在肝癌中，也有研究[16]發(fā)現(xiàn)，RGS2 在肝癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁組織，且高表達(dá)的RGS2與肝癌惡性程度顯著正相關(guān)。而在OSCC 中，RGS2 的表達(dá)情況目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

圖 4 RGS2與FHL1蛋白相互作用檢測(cè)Fig 4 The interaction of RGS2 and FHL1 protein

圖 5 FHL1、DDB1與的RGS2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢測(cè)結(jié)果Fig 5 The competitive binding effect of FHL1 and DDB1 with RGS2

本研究發(fā)現(xiàn)，RGS2 mRNA 在OSCC 組織中表達(dá)顯著低于其在癌旁組織中表達(dá)，且RGS2 mRNA高表達(dá)患者的腫瘤淋巴血管侵犯顯著減少（P<0.001），在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的頭頸鱗狀細(xì)胞癌患者亞群中，RGS2 mRNA 高表達(dá)的患者具有更好的總生存率；同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)RGS2能顯著抑制OSCC 細(xì)胞的侵襲、增殖能力，這均提示RGS2在OSCC中發(fā)揮了抑癌作用。

泛素化-蛋白酶體降解蛋白途徑，在蛋白質(zhì)的定位、代謝、功能、調(diào)節(jié)和降解中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。泛素化與去泛素化的功能紊亂可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯、信號(hào)傳遞持續(xù)活化、炎癥反應(yīng)激活等，與乳腺癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、胃癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[17-18]。泛素化修飾需要一些特異性的酶來(lái)完成，包括泛素化激活酶E1、泛素化結(jié)合酶E2和連接酶E3。E3連接酶主要功能是對(duì)底物的識(shí)別，目前已知的E3 連接酶有在600 多種[19]。由于快速蛋白酶體降解途徑的存在，RGS2 蛋白的半衰期很短。近期研究[8]揭示，E3 連接酶復(fù)合體DDB1/CUL4B/FBXO44介導(dǎo)了RGS2蛋白的快速降解，從而間接影響了G 蛋白信號(hào)通路的激活。本研究也通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)，DDB1 可與RGS2相互結(jié)合，從而調(diào)控了RGS2蛋白的降解。

本研究發(fā)現(xiàn)，X 染色體相關(guān)基因FHL1 可與DDB1 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RGS2，從而通過(guò)泛素化-蛋白酶體途徑影響RGS2 蛋白的穩(wěn)定性。研究已知，F(xiàn)HL1是FHL蛋白家族成員之一，具有半個(gè)LIM 結(jié)構(gòu)域和4個(gè)全長(zhǎng)LIM保守結(jié)構(gòu)域，LIM結(jié)構(gòu)域是一個(gè)蛋白相互作用基序，主要涉及作為與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架或轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的連接蛋白。FHL1 在腦膠質(zhì)瘤、OSCC等多種實(shí)體惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)，且其表達(dá)下調(diào)與腫瘤患者不利預(yù)后密切相關(guān)。本課題組前期研究也證實(shí)了FHL1 是OSCC 新的抑癌基因，其表達(dá)下調(diào)與OSCC 的發(fā)生、發(fā)展顯著相關(guān)。FHL1 與RGS2 作為2 個(gè)抑癌基因，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的調(diào)控是否存在協(xié)同作用，目前尚無(wú)探究。本研究通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)，發(fā)現(xiàn)RGS2和FHL1存在直接相互作用，F(xiàn)HL1可競(jìng)爭(zhēng)性與RGS2相結(jié)合，降低DDB1與RGS2的結(jié)合，抑制RGS2 的泛素化過(guò)程從而延緩RGS2 的快速降解。已有研究提示，在OSCC 中，RGS 家族另一蛋白R(shí)GS5的表達(dá)，受鋅指蛋白750（ZNF750）的調(diào)控，ZNF750 可抑制RGS5 的表達(dá)。因此RGS 家族不同分子在OSCC中的作用機(jī)制及表達(dá)調(diào)控機(jī)制可能有所不同，需要進(jìn)一步研究。

綜上，本實(shí)驗(yàn)闡明了RGS2在口腔癌發(fā)生發(fā)展中的抑制作用，高表達(dá)RGS2 蛋白可抑制OSCC 細(xì)胞的增殖、侵襲，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，抑癌基因FHL1可與E3 連接酶復(fù)合體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RGS2，阻滯RGS2的泛素化進(jìn)程，維持RGS2蛋白的穩(wěn)定，這將為后續(xù)進(jìn)一步探索以聯(lián)合靶向RGS2 和FHL1 作為OS‐CC臨床治療靶點(diǎn)的研究提供一定的參考意見(jiàn)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。