籽粒高效特異性表達(dá)啟動(dòng)子的克隆與表達(dá)分析

王美華，高潔，李玉蓮，張淑娟，宋國(guó)琦，張榮志，李瑋，李吉虎，李根英

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所／農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／小麥玉米國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100）

啟動(dòng)子是一段位于基因上游能夠與RNA聚合酶結(jié)合的DNA序列，也是RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合序列，CAAT-box和TATA-box是啟動(dòng)子的典型特征。啟動(dòng)子上游的順式作用元件是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，也是決定轉(zhuǎn)錄激活和抑制關(guān)鍵因子，因此啟動(dòng)子是調(diào)控基因表達(dá)的重要元件［1］。啟動(dòng)子分為組成型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子［2］。組成型啟動(dòng)子調(diào)控下的基因，在不同組織器官中沒(méi)有明顯差異。植物中最常使用的組成型啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動(dòng)子［3］、玉米的泛素蛋白（ubiquitin）啟動(dòng)子［4］、水稻的肌動(dòng)蛋白（actin）啟動(dòng)子等［5］。組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的外源基因在整株中表達(dá)，而有些器官人們并不想讓它表達(dá)外源蛋白，因?yàn)楫愒吹鞍踪|(zhì)或代謝產(chǎn)物的積累容易打破植物原有的生理生化平衡，影響植株正常生長(zhǎng)，有些產(chǎn)物甚至有毒，造成植物死亡。另外，同一種啟動(dòng)子用于多個(gè)外源基因的驅(qū)動(dòng)，可能引起基因沉默或共抑制現(xiàn)象［6］。因此，尋找多種類型的組織特異性啟動(dòng)子，減少組成型啟動(dòng)子的使用是科學(xué)家一直努力的方向。

組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因一般在根、莖、葉、果實(shí)和種子等某一個(gè)特異性的器官組織中特異表達(dá)。隨著基因工程的發(fā)展，人們從禾谷類作物中克隆了許多種子特異性啟動(dòng)子，并將它們應(yīng)用于禾谷類籽粒品質(zhì)的改良之中。應(yīng)用較多的是來(lái)源于普通小麥的高分子量麥谷蛋白亞基1DX5、Bx17和水稻的G1t等［7-9］。但這些啟動(dòng)子的啟動(dòng)外源基因表達(dá)活性存在差異，不能滿足基因工程的需要，而且在需要多基因串聯(lián)時(shí)，如果利用同一啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)不同的基因表達(dá)，很容易導(dǎo)致基因沉默。本研究擬尋找轉(zhuǎn)錄效率更高的種子特異性啟動(dòng)子，用于提高目標(biāo)基因的表達(dá)，改良禾谷類植物的加工和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

質(zhì)粒pGEM-Teasy和pCAMBIA3301購(gòu)自長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒和轉(zhuǎn)基因小麥基因組DNA的提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；配制培養(yǎng)基所需無(wú)機(jī)鹽、維生素、抗生素以及激素、GUS染色所需藥品購(gòu)自Sigma-Aldrich中國(guó)公司；農(nóng)桿菌菌株購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司；PCR擴(kuò)增所需的Pfu、rTaq酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

用于克隆胚乳特異性啟動(dòng)子（glo啟動(dòng)子）的燕麥品種為四倍體大燕麥，由張家口農(nóng)業(yè)科學(xué)院楊才研究員提供；用于基因轉(zhuǎn)化的小麥品種為Fielder。

1.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

采用DNA提取試劑盒從黑暗中萌發(fā)的燕麥幼苗中提取基因組DNA，用作擴(kuò)增啟動(dòng)子的模版，擴(kuò)增引物根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考序列AY795082進(jìn)行設(shè)計(jì)，上游引物5′-CGAAGCTTTGGAAAGTCATTTTGCCTC-3′，下游引物5′-GCCCATGGTAGATTGTAGAAGGTGGATTGG-3′（劃線處分別為Hin dⅢ和NcoⅠ的酶切位點(diǎn)）。PCR反應(yīng)體系（20μL）：基因組DNA（50 ng／μL）1μL，上、下游引物（10 pmol／L）各2 μL，dNTPs（250μmol／L）2μL，10×buffer（50 mmol／L KCl，10 mmol／L Tris-HCl，1.5 mmol／L MgCl2，pH 8.3）2μL，Pfu高保真酶1μL，水10 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃3 min；94℃45 s，60℃45 s，72℃1 min，36個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中分離，EB染色后進(jìn)行紫外觀察并拍照保存。

1.3 基因轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)

轉(zhuǎn)化普通小麥參考Zhang等［10］的方法，PCR檢測(cè)所用引物為：上游引物5′-GGTCACTCATTACGGCAAAGT-3′，下游引物5′-GACGACCAAAGCCAGTAAAGT-3′。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：基因組DNA（50 ng／μL）1μL，上、下游引物（10 pmol／L）各2μL，dNTPs（250μmol／L）2μL，10×buffer（50 mmol／L KCl，10 mmol／L Tris-HCl，1.5 mmol／L MgCl2，pH 8.3）2μL，rTaq高保真酶1μL，水10μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃3 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃45 s，36個(gè)循環(huán)；72℃8 min。PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳分離，EB染色后進(jìn)行紫外觀察并拍照保存。

1.4 不同部位GUS基因表達(dá)活性分析

GUS組織染色液的配制：0.2 mol／L磷酸鈉緩沖液100 mL；0.1 mol／L亞鐵氰化鉀和0.1 mol／L鐵氰化鉀各1 mL；0.5 mol／L Na2-EDTA 8 mL；已溶于400μL DMSO中的200 mg X-gluc；水90 mL。

GUS組織染色：待轉(zhuǎn)基因植株開花后兩周，挑選PCR鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因苗，取其部分籽粒、葉和根分別裝入5 mL離心管中，用GUS染色液完全浸沒(méi)，37℃振蕩過(guò)夜，次日用70%乙醇沖洗3次，觀察GUS基因表達(dá)強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚乳特異性啟動(dòng)子的克隆

胚乳特異性啟動(dòng)子大小約960 bp（圖1），將其與pGEM-Teasy載體進(jìn)行連接，含有該啟動(dòng)子的重組載體命名為pTglo。

圖1 glo啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增

將獲得的啟動(dòng)子序列與已報(bào)道序列（AY795082）進(jìn)行比對(duì)，相似性達(dá)99%。兩個(gè)序列之間存在9個(gè)SNPs，其中在85 bp處A變?yōu)镚，364 bp處T變?yōu)锳，369 bp處A變?yōu)門，620 bp處發(fā)生A堿基的插入，640 bp處T變?yōu)镃，701 bp和788 bp處G變?yōu)锳，858 bp處T變?yōu)镃，961 bp處C變?yōu)锳（圖2）。對(duì)啟動(dòng)子組成元件進(jìn)行分析表明，該啟動(dòng)子含有胚乳特異表達(dá)所必須的5個(gè)Skn-1（GTCAT）基序，其中3個(gè)位于正鏈上，分別在第7、235、873 bp處，2個(gè)位于負(fù)鏈上，分別在第176 bp和551 bp處（綠色覆蓋并加邊框的區(qū)域）。在啟動(dòng)子的正鏈第622 bp和830 bp處存在胚乳表達(dá)相關(guān)的順式調(diào)控元件GCN4（加框部分）。在啟動(dòng)子的正鏈550 bp和負(fù)鏈869 bp處有兩個(gè)O2位點(diǎn)，曾在玉米中被驗(yàn)證為醇溶蛋白的代謝順式調(diào)控元件（紅色斜體序列）。在啟動(dòng)子的869 bp處有一個(gè)回文結(jié)構(gòu)ACATGTCATCATGT，該序列是胚乳特異表達(dá)所必需的。這些結(jié)構(gòu)元件與啟動(dòng)子的活性是否存在聯(lián)系，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。除了上述與胚乳特異性表達(dá)有關(guān)的元件，該啟動(dòng)序列中還有許多與逆境響應(yīng)有關(guān)的序列元件，包括負(fù)鏈573 bp處有一個(gè)ABA順式響應(yīng)元件ABRE（紅色字母部分）；正鏈825 bp處有一個(gè)赤霉素順式響應(yīng)元件（藍(lán)色字母部分）；正鏈561 bp處有一個(gè)TC-rich重復(fù)序列（灰色覆蓋部分），該序列在煙草中是逆境和防御反應(yīng)的順式作用元件；負(fù)鏈第725 bp處有一個(gè)水楊酸反應(yīng)順式調(diào)控元件TCA-element（綠色覆蓋部分）；正鏈的694 bp和負(fù)鏈的697 bp處各有一個(gè)TGACG-motif，該序列在大麥中與茉莉酸的順式調(diào)控有關(guān)。這些與抗逆有關(guān)的結(jié)構(gòu)單元的存在或許與燕麥的高度抗逆性有關(guān)。

2.2 表達(dá)載體構(gòu)建

為了驗(yàn)證新克隆的啟動(dòng)子與已報(bào)道的glo啟動(dòng)子啟動(dòng)后續(xù)基因表達(dá)強(qiáng)度的差異，委托生工生物工程（上海）股份有限公司對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的glo啟動(dòng)子序列（AY795082）進(jìn)行人工合成，并直接克隆到質(zhì)粒pCAMBIA3301的Hin dⅢ和NcoⅠ酶切位點(diǎn)之間，完成的重組質(zhì)粒命名為 pGloUdiA1。

將從大燕麥中新克隆到的glo啟動(dòng)子序列利用Hin dⅢ和NcoⅠ從pTglo上切下，電泳分離并做凝膠回收后與經(jīng)過(guò)同樣酶切的pCAMBIA3301大片段進(jìn)行連接，PCR鑒定陽(yáng)性克隆子（圖3）。

挑選部分陽(yáng)性克隆子進(jìn)行酶切鑒定（圖4），并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，完成的重組質(zhì)粒命名為pGloUdiA2，基因表達(dá)框見(jiàn)圖5。

選用載有GUS基因但沒(méi)有啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體pCAMBIA1381xb作為陰性對(duì)照。利用GUS基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為616 bp（圖6）。PCR結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)篩選后最終獲得轉(zhuǎn)pGloUdiA1、pGloUdiA2和pCAMBIA1381xb的陽(yáng)性小麥植株分別為8、12、5個(gè)。

圖3 PCR鑒定陽(yáng)性克隆子

圖4 陽(yáng)性克隆子的酶切鑒定

圖5 pGloUdiA2的表達(dá)框結(jié)構(gòu)

圖6 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定

2.3 基因特異性表達(dá)檢測(cè)

GUS染色結(jié)果顯示，無(wú)論是轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pGloUdiA1還是pGloUdiA2，其根和葉中都無(wú)藍(lán)色信號(hào)出現(xiàn)（圖7），與轉(zhuǎn)化pCAMBIA1381xb的陰性對(duì)照表現(xiàn)一致。但在轉(zhuǎn)化pGloUdiA1和pGloUdiA2的小麥籽粒中都有藍(lán)色信號(hào)出現(xiàn)（圖8），說(shuō)明該啟動(dòng)子具有良好的組織特異性。轉(zhuǎn)化pGloUdiA2的籽粒中藍(lán)色信號(hào)強(qiáng)度大約是轉(zhuǎn)化pGloUdiA1的5倍，表明新克隆的glo啟動(dòng)子序列的基因表達(dá)活性更強(qiáng)。轉(zhuǎn)化陰性對(duì)照質(zhì)粒pCAMBIA1381xb的籽粒中沒(méi)有觀察到藍(lán)色信號(hào)，說(shuō)明GUS基因表達(dá)差異是由啟動(dòng)子的表達(dá)所造成的。新克隆glo啟動(dòng)子序列的高效啟動(dòng)活性和高度的組織特異性表達(dá)特性為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良小麥籽粒性狀提供了良好的基礎(chǔ)材料。

圖7 轉(zhuǎn)基因植株根和葉的GUS染色

圖8 轉(zhuǎn)基因小麥植株的籽粒GUS染色

3 討論與結(jié)論

啟動(dòng)子是調(diào)控基因表達(dá)的重要元件，本研究利用已經(jīng)報(bào)道的燕麥啟動(dòng)子序列作為參考序列，從我國(guó)四倍體燕麥中克隆了燕麥球蛋白基因新的啟動(dòng)子序列，經(jīng)過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)新克隆的啟動(dòng)子序列長(zhǎng)960 bp，與參考序列AY795082存在9個(gè)SNPs。對(duì)該啟動(dòng)子組成元件進(jìn)行分析表明，該啟動(dòng)子含有胚乳特異表達(dá)所必須的5個(gè)Skn-1（GTCAT）基序，其中3個(gè)位于正鏈上，2個(gè)位于負(fù)鏈上；在啟動(dòng)子的正鏈第622 bp和830 bp處存在胚乳表達(dá)相關(guān)的順式調(diào)控元件GCN4；在啟動(dòng)子的正鏈550 bp和負(fù)鏈869 bp處有兩個(gè)O2位點(diǎn)，曾在玉米中被驗(yàn)證為醇溶蛋白代謝順式調(diào)控元件；在啟動(dòng)子的869 bp處有一個(gè)回文結(jié)構(gòu)ACATGTCATCATGT，該序列是胚乳特異表達(dá)所必需的。利用上述啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)，結(jié)果表明該啟動(dòng)子啟動(dòng)功能基因表達(dá)的強(qiáng)度約為參考序列的5倍，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良小麥籽粒性狀提供了良好的基因表達(dá)驅(qū)動(dòng)元件。