tae-miR167d及靶基因ARF12在小麥中的表達模式分析

宋國琦，李瑋，張淑娟，張榮志，李玉蓮，高潔，李吉虎，陳明麗，李根英

（山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所／農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室／小麥玉米國家工程實驗室，山東 濟南 250100）

小麥（Triticum aestivurn L.）是世界上最主要的糧食作物之一，在糧食安全中占有舉足輕重的地位。低溫是影響作物生長發(fā)育的重要環(huán)境因子之一。近來，許多研究闡述了植物miRNAs在冷脅迫響應中的作用。擬南芥中發(fā)現(xiàn)16個miRNAs參與冷脅迫響應［1-3］。在楊樹中鑒定出19個冷脅迫響應miRNAs［4］，其中6個與擬南芥中相同。Zhang等［5］在短柄草中發(fā)現(xiàn)了25個冷脅迫響應的特異性miRNAs。這些研究表明冷響應miRNAs既具有保守性又具有調(diào)控特異性。在普通小麥中，許多保守的、小麥屬特異的及小麥中特異的miRNAs被鑒定出來，包括小麥A基因組的祖先、B基因組的祖先及AABBDD異源六倍體小麥［6-11］。小麥中許多miRNAs在脅迫響應中發(fā)揮著 重 要 的 作 用［8，12，13］。 在 冷 脅 迫 響 應 中，miR167c、tae-miR167d、tae-miR172a、tae-miR393、tae-miR396a和tae-miR444c.1這6個miRNAs在小麥溫敏核不育系（TGMS）中響應冷脅迫［14］；miR159、miR164、miR169、miR319、miR398、miR1029和miR1126這7個miRNAs在小麥苗期響應冷脅迫［8］。分析小麥中應答不同脅迫反應的miRNAs發(fā)現(xiàn)，對于多樣性的生物脅迫和非生物脅迫，miRNAs表現(xiàn)出交叉應答反應，這表明小麥已經(jīng)發(fā)展了復雜的miRNA介導途徑應對不斷變化的環(huán)境［15］。因此，研究小麥幼穗中miRNAs的冷脅迫響應機制，有助于在miRNAs層面上理解小麥生殖階段的冷響應機制，為提高小麥春季抗凍性提供理論依據(jù)。

本課題組對處于藥隔期的濟麥22幼穗低溫脅迫后進行了miRNA分析和降解組分析。共發(fā)現(xiàn)來自105個家族的192個保守miRNAs和9個新miRNAs，其中34個保守miRNAs和5個新miRNAs在冷脅迫前后表達差異顯著。對這些miRNAs的靶基因預測和降解組驗證表明，差異表達miRNAs的靶基因多數(shù)具有應答刺激、調(diào)控轉(zhuǎn)錄和離子運輸?shù)墓δ?。其中?3個miRNAs的靶基因參與花發(fā)育過程，如ARF（auxin response factor），SPB（squamosa promoter binding like protein）和AP2（AP2-like ethylene-responsive transcription factor）等，其中miR160和miR167的靶基因均為ARF。前期結(jié)果顯示，tae-miR167d在藥隔期的幼穗中低溫誘導后下調(diào)表達，而其靶基因ARF12則上調(diào)表達［15］。這一結(jié)果與Tang等［14］在小麥冷誘導溫敏不育系過程中的發(fā)現(xiàn)一致，他們推測tae-miR167d和靶基因ARF在小麥溫敏核不育系的穗發(fā)育中可能控制冷誘導的雄性不育。另有研究表明，miR167家族參與調(diào)控植物花和果實的發(fā)育［16-19］，而其靶基因ARF則是一類響應生長素信號的轉(zhuǎn)錄因子，通過特異性的結(jié)合生長素初期響應基因啟動子區(qū)域AuxRE元件（TGTCNC）調(diào)控生長素響應基因的表達，從而引發(fā)生長素介導的許多生理效應［20-22］。

我們前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)tae-miR167d和靶基因ARF12在小麥生殖發(fā)育階段響應冷脅迫［15］，但其在小麥中的時空表達情況仍不清楚。本研究通過分析tae-miR167d及其靶基因ARF12在小麥不同發(fā)育時期的表達模式和組織表達特異性，以及冷脅迫下不同小麥品種tae-miR167d和ARF12的表達水平，探討了tae-miR167d及其靶基因ARF12在小麥中的時空表達模式及冷脅迫后二者的調(diào)控關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為濟麥22、臨麥4號、京411、豫麥47、魯原502、周麥22、西農(nóng)889和濮麥053。將小麥種子浸水至萌發(fā)后，置于4℃冰箱春化30 d，將芽苗修剪后移栽至直徑20 cm的花盆中，花盆基質(zhì)為草炭土，每盆種植6株。濟麥22和西農(nóng)889每個材料種植21盆，其余6個材料每個種植9盆。在人工氣候室的可控環(huán)境下生長，設置晝／夜溫度為22℃／16℃，光／暗周期為16 h／8 h，光照強度300μmol·m-2·s-1，相對濕度為60%～70%。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣方法 濟麥22和西農(nóng)889每個時期取生長發(fā)育一致的材料9株，每3株為一個重復，共3個重復。分別取三葉期、二棱期（7葉）的葉片，取雌雄蕊分化期（拔節(jié)）、四分體期（挑旗）和開花期的葉片、葉鞘、莖和幼穗，用錫箔紙包好，放入液氮中速凍，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

小麥品種濟麥22、西農(nóng)889、魯原502、臨麥4號、周麥22、豫麥47、濮麥053和京411每6株為1個重復，共3個重復。在雌雄蕊分化期進行0℃處理48 h，分別取正常生長和0℃處理48 h的葉片和幼穗，用錫箔紙包好，放入液氮中速凍，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小麥RNA提取及cDNA合成 分別取0.1 g樣品于液氮研磨后，利用miRcute多糖多酚植物miRNA提取分離試劑盒（天根，北京）進行總RNA的提取，利用Nanodrop 2000／2000C分光光度計（Thermo，美國）進行RNA濃度的測定。利用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit（Clontech，美國）進行反轉(zhuǎn)錄用于tae-miR167d的qRT-PCR分析；利用PrimeScript RT Reagent Kit With gDNA Eraser（TaKaRa，大連）進行反轉(zhuǎn)錄用于ARF12的qRT-PCR分析。

1.2.3 熒光定量PCR tae-miR167d定量PCR引物為tae-miR167d-F和miRNA-specific Primer，內(nèi)參為U6 Forward Primer和U6 Reverse Primer。tae-miR167d-F引物序列如下：CTGAAGCTGCCAGCATGATCTA，miRNA-specific Primer、U6 Forward Primer和U6 Reverse Primer為Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit（Clontech，美國）提供。qRTPCR按 照Light Cycler 480 SYBR GreenⅠ（Roche，德國）說明書進行反應體系配制和反應程序設定，在Light Cycler 480實時定量PCR儀（Roche，德國）上進行反應，反應程序為：95℃預變性5 min；95℃5 s，60℃20 s，72℃20 s，共40個循環(huán)。

ARF12定量PCR引物為ARF12-F／R，以小麥Actin為內(nèi)參，引物序列如下：ARF12-F／R，ATAGATCAGGCTGGCAGCTTGT／GCACATCCTCTGGTGAAAGTATCT；TaActin-F／R，GCCACACTGTTCCAATCTATGA／TGATGGAATTGTATGTCGCTTC（AB181991）。反應程序為：95℃預變性5 min；95℃變性5 s，56℃20 s，72℃20 s，共40個循環(huán)。

反應結(jié)束后分析熒光值變化曲線和熔解曲線。每個反應3個技術(shù)重復，采用2-ΔΔCt法分析試驗結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 tae-miR167d和ARF12在小麥相同發(fā)育時期不同器官中的表達分析

分析濟麥22和西農(nóng)889中相同發(fā)育時期葉片、葉鞘、莖和穗中tae-miR167d及靶基因ARF12的表達情況（圖1），發(fā)現(xiàn)在雌雄蕊發(fā)育時期以葉片為參照，濟麥22葉鞘和莖中tae-miR167d表達上升，幼穗中tae-miR167d表達下降，而葉鞘中ARF12表達下調(diào)，莖和幼穗中ARF12表達上調(diào)；西農(nóng)889葉鞘、莖和幼穗中tae-miR167d表達均下降，ARF12表達均上升。在挑旗期和開花期以葉片為參照，濟麥22和西農(nóng)889葉鞘、莖和幼穗中tae-miR167d表達下調(diào)，靶基因ARF12的表達上調(diào)，二者呈負調(diào)控關(guān)系。比較濟麥22和西農(nóng)889中tae-miR167d和ARF12表達差異發(fā)現(xiàn)，在雌雄蕊發(fā)育時期，濟麥22的葉鞘和莖中tae-miR167d的表達高于ARF12，而西農(nóng)889中正好與濟麥22相反。

圖1 tae-miR167d及靶基因ARF12在濟麥22（A）和西農(nóng)889（B）相同時期不同器官中的表達分析

2.2 tae-miR167d和ARF12在小麥不同發(fā)育時期相同器官中的表達分析

分析濟麥22和西農(nóng)889不同發(fā)育時期葉片、葉鞘、莖和穗中tae-miR167d及靶基因ARF12的表達情況（圖2），發(fā)現(xiàn)隨著生育進程推進，與三葉期葉片相比，濟麥22葉片中tae-miR167d表達下調(diào)，靶基因ARF12表達上調(diào)；在西農(nóng)889葉片中，除開花期tae-miR167d表達上調(diào)，其他3個時期均下調(diào)，而靶基因ARF12表達上調(diào)。與雌雄蕊發(fā)育時期的葉鞘相比，濟麥22挑旗期和開花期葉鞘中的tae-miR167d的表達下調(diào)，靶基因ARF12的表達上調(diào)；在西農(nóng)889中，挑旗期葉鞘中的taemiR167d的表達下調(diào)，靶基因ARF12的表達上調(diào)，而開花期葉鞘中tae-miR167d和ARF12均下調(diào)。與雌雄蕊發(fā)育時期相比，濟麥22在挑旗期和開花期的莖和幼穗中tae-miR167d的表達均下降，靶基因ARF12的表達均上升；西農(nóng)889挑旗期莖中tae-miR167d的表達上調(diào)，靶基因ARF12的表達下調(diào)，在開花期莖中tae-miR167d和靶基因ARF12的表達均下降；西農(nóng)889幼穗中挑旗和開花期tae-miR167d和靶基因ARF12的表達也呈負調(diào)控關(guān)系。比較濟麥22和西農(nóng)889相同時期不同器官中tae-miR167d和靶基因ARF12表達差異，發(fā)現(xiàn)在葉鞘中兩個品種差異明顯。

圖2 tae-miR167d及靶基因ARF12在濟麥22（A）和西農(nóng)889（B）不同時期相同器官中的表達分析

2.3 冷脅迫前后不同小麥品種tae-miR167d及ARF12的表達分析

每個小麥品種冷脅迫后分別與自己的對照相比較，分析耐倒春寒不同8個小麥品種中taemiR167d及靶基因ARF12冷脅迫后的表達模式，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)，在葉片中，濟麥22、京411、豫麥47、魯原502和西農(nóng)889冷脅迫后tae-miR167d表達下調(diào)而ARF12上調(diào)，臨麥4號tae-miR167d上調(diào)而ARF12下調(diào)，在上述6個品種中，taemiR167d和ARF12二者呈負調(diào)控關(guān)系；周麥22和濮麥053中tae-miR167d和ARF12同時上調(diào)表達。在幼穗中，濟麥22、京411、豫麥47、魯原502、周麥22和西農(nóng)889冷脅后tae-miR167d表達下調(diào)而ARF12上調(diào)，濮麥053中tae-miR167d上調(diào)而ARF12下調(diào)，在這7個品種中tae-miR167d和ARF12二者呈負調(diào)控關(guān)系；臨麥4號taemiR167d和ARF12存在同時上調(diào)表達情況。通過分析發(fā)現(xiàn)冷脅迫前后tae-miR167d和ARF12的表達在多數(shù)品種中存在負調(diào)控關(guān)系。

圖3 不同小麥品種冷脅迫后葉片和幼穗中tae-miR167d和ARF12相對表達量

與濟麥22正常生長條件下的葉片相比較（圖4A），正常生長條件下，除魯原502中taemiR167d的表達量比濟麥22高，其余6個品種tae-miR167d的表達量均比濟麥22低；而ARF12的表達量除在京411、魯原502和周麥22中比濟麥22低，其余4個品種均比濟麥22高。冷脅迫后，tae-miR167d的表達量在臨麥4號、魯原502和濮麥053中比濟麥22中高，在其余4個品種中比濟麥22的表達量低；而ARF12的表達量除在周麥22和西農(nóng)889中比濟麥22高，在其余5個品種中均比濟麥22低。與濟麥22正常生長條件下的幼穗相比較（圖4B），發(fā)現(xiàn)正常生長條件下，7個品種中tae-miR167d和ARF12的表達量均比濟麥22中高。冷脅迫后，tae-miR167d的表達量除在京411中比濟麥22中低，在其余6個品種中均比濟麥22中高；而ARF12的表達量除在魯原502、周麥22和濮麥053中比濟麥22中低，在其余4個品種中均比濟麥22中高。比較葉片和幼穗中tae-miR167d和ARF12的表達趨勢發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下，在葉片中tae-miR167d的表達量低于ARF12，而幼穗中tae-miR167d的表達量高于ARF12。

圖4 相同對照下不同品種小麥葉片（A）和幼穗中（B）tae-miR167d和ARF12的相對表達量

3 討論與結(jié)論

本課題組在研究倒春寒脅迫響應miRNAs時，發(fā)現(xiàn)小麥幼穗中tae-miR167d參與冷響應，并發(fā)現(xiàn)其靶基因為ARF12。qRT-PCR結(jié)果顯示，小麥幼穗中tae-miR167d在低溫誘導后下調(diào)表達，而其靶基因ARF12則上調(diào)表達［15］。本研究的目的是驗證上述結(jié)果，并明確耐倒春寒品種和不耐倒春寒品種中tae-miR167d及其靶基因ARF12的表達特異性，為小麥耐倒春寒品種的篩選提供依據(jù)。因此，在設計試驗時，參考已經(jīng)發(fā)表的文獻選出耐倒春寒強的品種濟麥22、臨麥4號、京411和豫麥47，和耐倒春寒弱的品種魯原502、周麥22、西農(nóng)889和濮麥053，共8個品種參加試驗［23，24］。首先分析了倒春寒抗性不同品種濟麥22和西農(nóng)889中不同器官和不同時期taemiR167d和靶基因ARF12的表達差異。結(jié)果顯示，在多數(shù)情況下，tae-miR167d和靶基因ARF12呈負調(diào)控關(guān)系，這一結(jié)果驗證了前期的研究結(jié)果［15］。另外，在雌雄蕊發(fā)育時期，濟麥22和西農(nóng)889的葉鞘和莖中tae-miR167d和ARF12表達存在明顯差異，這是否是導致它們耐倒春寒能力不同的原因還需要進一步驗證。同時，該結(jié)果也表明在小麥耐倒春寒過程中，葉鞘和莖發(fā)揮著重要作用。

分析8個小麥品種葉片和幼穗冷脅迫前后tae-miR167d和ARF12表達差異，發(fā)現(xiàn)受到冷脅迫后，多數(shù)品種中tae-miR167d和ARF12的表達呈負調(diào)控關(guān)系，這一結(jié)果與前期的研究結(jié)果一致［15］。分別以濟麥22的葉片和幼穗為對照，分析不同抗性品種中tae-miR167d和ARF12表達差異發(fā)現(xiàn)，在葉片中，冷脅迫后除臨麥4號中taemiR167d的表達水平高于ARF12，其余6個品種中tae-miR167d的表達水平均低于ARF12的表達水平，與濟麥22中表達模式一致；在幼穗中，冷脅迫后濟麥22、京411、豫麥47和西農(nóng)889中taemiR167d的表達水平低于ARF12的表達水平，其余4個品種中tae-miR167d的表達水平高于ARF12的表達水平。這與最初耐倒春寒強的品種和耐倒春寒弱的品種的分類并不完全一致。分析可能的原因：一是上述小麥品種來自不同的生態(tài)區(qū)，對低溫的耐受性不同；二是小麥耐倒春寒是一個復雜的生物學過程，單純的從某個角度不能全面揭示耐倒春寒的機理［15，25-27］。