急性肝衰竭大鼠肝星狀細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)HGF表達(dá)實(shí)驗(yàn)研究

藍(lán)遠(yuǎn)強(qiáng) 吳發(fā)勝 黃麗珍 梁敏

肝細(xì)胞內(nèi)存在大量?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)參與急性肝衰竭(ALF)的發(fā)生發(fā)展[1-3]。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)對(duì)ALF發(fā)生后肝臟組織細(xì)胞的修復(fù)再生具有重要意義[4]。有研究認(rèn)為ERS可能通過(guò)影響HGF延緩ALF，但尚缺乏足夠證據(jù)[5]，目前臨床有關(guān)ALF患者ERS與肝星狀細(xì)胞HGF關(guān)系的報(bào)道也較為罕見。本研究通過(guò)大鼠模型基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，探討ERS與HGF的關(guān)系及其相互作用的具體機(jī)制。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)試劑

SD大鼠鼠齡3～4 w，體質(zhì)量為180～240 g。脂多糖(LPS，貨號(hào)Sigma L2880)和衣霉素(貨號(hào)MS0013-1MG)均由上海懋康生物科技有限公司提供。D-氨基半乳糖(D-GaIN)由湖北賽搏醫(yī)藥化學(xué)品有限公司提供，4-苯基丁酸鈉(4-PBA)由美國(guó)Sigma公司提供。

二、ALF建模

常規(guī)喂養(yǎng)SD大鼠1 w。完成后將60只大鼠隨機(jī)分為A、B、C三組，每組20只。先通過(guò)腹腔注射給予D-氨基半乳糖 400 mg/kg、脂多糖 20 μg/kg。在注射完成1 h后給予A、C組大鼠0.6 mL/kg衣霉素，C組在完成上述操作后再注射4-PBA 500 mg/kg。在注射脂多糖后0 h(T1)、2 h(T2)、8 h(T3)和12 h(T4)時(shí)，各組分別處死5只動(dòng)物，留取尾靜脈血，離心取上清，備用。

三、檢測(cè)方法

采用ELISA法檢測(cè)血清HGF，試劑盒由南京卡米洛生物工程有限公司提供；檢測(cè)肝組織HGF mRNA(武漢優(yōu)博生物技術(shù)有限公司)。引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 引物序列

四、RNA慢性病毒載體構(gòu)建

設(shè)計(jì)并合成eIF2α-shRNA，另以NC-shRNA為陰性對(duì)照，序列分別為5′-GTACAAGAGACCTG-GATAT-3′和5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。兩組分別記為eIF2α敲除組和陰性對(duì)照組。采用GV248載體，依次進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、鑒定及共轉(zhuǎn)染處理，完成后8 h替換為完全培養(yǎng)基，常規(guī)條件下繼續(xù)培養(yǎng)2 d，收集上清液，進(jìn)行濃縮處理后，再行滴度檢驗(yàn)。在病毒感染3 d后收集細(xì)胞，提取蛋白，行熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢查，收集結(jié)果。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組HGF表達(dá)

在T1時(shí)，三組HGF表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在T2、T3和T4時(shí)，A組血清HGF水平顯著低于B組和C組，而C組顯著低于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組HGF表達(dá)(ng/mL)

二、三組HGF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

在T1時(shí)，三組SD大鼠HGF mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在T2、T3及T4時(shí)，三組HGF mRNA相對(duì)表達(dá)量水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在T2、T3及T4時(shí)，A組SD大鼠HGF mRNA顯著低于B、C兩組，C組顯著低于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 HGF mRNA相對(duì)表達(dá)量

三、eIF2α敲除組和陰性對(duì)照組HGF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

ERS時(shí)，eIF2α敲除組為0.4±0.2，顯著低于對(duì)照組(1.6±0.3，t=7.442，P=0.000)。

討 論

HGF作為肝組織再生調(diào)節(jié)因子，能加快組織增殖，促進(jìn)血管生成，已被臨床認(rèn)可[6]。Hardesty等[7]認(rèn)為HGF可刺激肝DNA合成。Liu等[8]基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)轉(zhuǎn)染HGF基因后的肝硬化小鼠肝功能獲得改善，ALF發(fā)生率顯著降低。Holman等[9]研究還顯示外源性HGF補(bǔ)充療法可減輕ALF局部炎癥，抑制肝病變進(jìn)展。而與外源性補(bǔ)充HGF相比，通過(guò)轉(zhuǎn)染增強(qiáng)HGF自分泌能力對(duì)促進(jìn)肝細(xì)胞再生可能效果更好。尤其對(duì)于ALF患者，可能更有助于保護(hù)肝功能，降低病死率，改善預(yù)后。

既往報(bào)道證實(shí)c-Met受體可通過(guò)與HGF β鏈內(nèi)絲氨酸蛋白酶樣結(jié)構(gòu)結(jié)合，進(jìn)而激活蛋白酪氨酸激酶，最終將信號(hào)傳至細(xì)胞核內(nèi)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖作用[10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是具有膜蛋白合成、加工、折疊作用的膜結(jié)合細(xì)胞器。而ERS多發(fā)生于氧化應(yīng)激、病毒感染等刺激后[11]。阿依西布·薩吾提等[12]報(bào)道發(fā)現(xiàn)ERS發(fā)生后對(duì)c-Met受體具有抑制作用。而4-PAB是目前臨床廣泛使用的ERS抑制劑[13]。因而，本研究采用ALF大鼠模型，給予A、C兩組衣霉素干預(yù)，誘導(dǎo)ERS發(fā)生，并給予C組ERS抑制劑4-PAB作為對(duì)照觀察，結(jié)果顯示A、C兩組T2、T3及T4時(shí)HGF低于B組，而A組血清HGF和HGF mRNA相對(duì)表達(dá)量低于C組，提示ERS抑制劑干預(yù)有助于抑制HGF的下降趨勢(shì)。因而，ERS對(duì)肝星狀細(xì)胞HGF具有調(diào)控作用，進(jìn)而參與病理進(jìn)程。

eIF2α是由端結(jié)構(gòu)域、螺旋結(jié)構(gòu)域及α-β結(jié)構(gòu)域組成的翻譯起始因子，在蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶通路發(fā)揮生物學(xué)作用中起關(guān)鍵作用[14]。研究還發(fā)現(xiàn)eIF2α磷酸化過(guò)程可激活轉(zhuǎn)錄因子4和未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白堆積，進(jìn)而改善細(xì)胞內(nèi)環(huán)境[15]。因此，eIF2α也被認(rèn)為是ERS的標(biāo)記。本研究也顯示三組eIF2α蛋白相對(duì)表達(dá)量在T2、T3及T4各時(shí)點(diǎn)表達(dá)水平存在顯著差異，說(shuō)明eIF2α可能與ERS調(diào)控HGF過(guò)程有關(guān)。為此，本研究采用對(duì)照實(shí)驗(yàn)方法，通過(guò)重組慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，構(gòu)建敲除eIF2α mRNA后的肝星狀細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR檢查結(jié)果顯示兩組HGF mRNA水平差異顯著，說(shuō)明ERS可能通過(guò)影響eIF2α表達(dá)調(diào)控HGF水平，這可為今后ALF治療提供新的靶向研究方向。

綜上，ERS可通過(guò)影響HGF表達(dá)，參與ALF病理進(jìn)程。