新型冠狀病毒肺炎患者輸注康復者恢復期血漿前后實驗室指標的變化

邵 明，楊乾坤，李建斌，朱偉濤，靳慧芳，趙言騰，王 靜，孔永奎，謝 瑩，呂先萍

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院輸血科 鄭州450052 2)河南省紅十字血液中心 鄭州450000 3)鄭州大學第一附屬醫(yī)院檢驗科 鄭州 450052

新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)是由SARS-CoV-2所致的急性呼吸道傳染病，已引起全球大范圍的感染[1]。該疾病可導致嚴重的呼吸系統(tǒng)癥狀，一部分患者會出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征及多器官功能衰竭，目前尚無治療特效藥?；謴推谘獫{(convalescent plasma,CP)作為一種被動免疫療法[2]，含有針對病原體的中和抗體，通常用于新出現(xiàn)的尚無特定疫苗或藥物治療的感染性疾病的治療。我國《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第五版)》[3]中首次納入CP治療，隨后在第六版、第七版以及《新冠肺炎康復者恢復期血漿臨床治療方案(試行第二版)》[4]中對獻血漿者的招募，血漿的采集、制備、檢測和臨床應用有了更詳細的描述。本研究對接受COVID-19 CP治療的11例重型和危重型COVID-19患者輸注前后各項實驗室指標的變化進行了分析。

1 對象與方法

1.1研究對象以2020年1月31日至2020年2月29日在鄭州大學第一附屬醫(yī)院接受COVID-19 CP治療的11例COVID-19患者為研究對象?；颊呔凑铡缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案(試行第五版)》的標準進行診斷、分型，其中重型4例，危重型7例。11例SARS-CoV-2核酸持續(xù)陽性，由醫(yī)院各科室會診及篩選后，符合COVID-19 CP治療的臨床適應證，并排除禁忌證。COVID-19 CP應用遵循以下原則：①原則上發(fā)病不超過3周，SARS-CoV-2核酸檢測陽性或臨床專家判定患者存在病毒血癥。②病情進展快的重癥患者、危重癥早期患者或經(jīng)臨床專家綜合評估認為需要進行血漿治療的患者。禁忌：有血漿、人體血漿蛋白類制品、枸櫞酸鈉過敏史者，有亞甲藍過敏史者，有其他嚴重過敏史或血漿使用禁忌者。不宜使用：危重型終末期者，多臟器功能衰竭無法逆轉者，非中和SARS-CoV-2目的的治療，臨床醫(yī)生綜合評估認為存在其他不宜輸注的情形。該研究符合赫爾辛基宣言的原則，通過該院倫理委員會的審核，倫理審查編號 2020-KY-227。

所有患者在輸注CP前已進行了氧療、抗病毒治療，同時防治并發(fā)癥；治療基礎疾病，預防繼發(fā)感染等。

1.2COVID-19CP的采集和制備捐獻者均符合《新冠肺炎康復者恢復期血漿臨床治療方案(試行第二版)》中要求的捐獻條件：距首發(fā)癥狀時間少于3周，符合最新版診療方案中解除隔離和出院標準，年滿18歲，原則上不超過55歲，體重男性不低于50 kg/女性不低于45 kg，無經(jīng)血傳播疾病史，經(jīng)臨床醫(yī)師綜合評估后認為可以捐獻血漿。捐獻者獻血前經(jīng)過身份核實并進行輸血前告知工作。由河南省紅十字會血液中心進行血漿的采集，采用美國血液技術公司MCS+型血細胞分離機采集，每次采集血漿200 mL，快速置于-20 ℃以下冰凍保存。同時留樣，遵照《血站技術操作規(guī)程(2019版)》[5]進行血液一般質量、乙肝、丙肝、艾滋病病毒標志物、梅毒抗體、ALT及SARS-CoV-2核酸檢測。乙肝、丙肝、艾滋病病毒標志物血清學及核酸檢測陰性，梅毒抗體兩次血清學檢測為陰性，ALT正常，SARS-CoV-2核酸單人份檢測結果陰性的血漿為合格。

1.3輸注過程根據(jù)《新冠肺炎康復者恢復期血漿臨床治療方案(試行第二版)》給予患者200～400 mL(4～5 mL/kg)ABO同型的COVID-19 CP，患者及其家屬被詳細告知使用目的和風險并簽署治療同意書。輸注起始的15 min內(nèi)慢速輸注，嚴密監(jiān)測是否發(fā)生輸血不良反應，若無不良反應，可根據(jù)病情調整滴速至120～300 mL/h。若出現(xiàn)輸血不良反應，及時記錄，并根據(jù)《AABB技術手冊(第18版)》[6]中輸血不良反應的處理方案對癥處理。主要輸血不良反應包括輸血相關循環(huán)超負荷、輸血相關急性肺損傷、輸血相關呼吸困難、過敏反應、輸血相關低血壓反應、非溶血性發(fā)熱反應、急性溶血性輸血反應、遲發(fā)性溶血性輸血反應、感染性輸血反應、其他/未知等。

1.4實驗室指標檢測方法患者輸注COVID-19 CP前后每日監(jiān)測咽拭子SARS-CoV-2核酸，檢測試劑盒為上海博杰生物科技有限公司和上海之江生物科技股份有限公司產(chǎn)品。至少間隔24 h連續(xù)2次核酸陰性者判定為核酸轉陰，核酸轉陰時間以第1天轉陰時間為準。輸注前及輸注后根據(jù)病情每8～12 h抽取動脈血進行血氣分析，計算動脈氧分壓(PaO2)和氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)。24 h內(nèi)留取靜脈血查血常規(guī)，檢測C反應蛋白(CRP)、降鈣素原、ALT、白蛋白、總膽紅素、肌酐、PT、APTT、D-二聚體、纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物、超敏肌鈣蛋白T、肌酸酶同工酶、N端腦鈉肽前體(NT-proBNP)、LDH水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

2 結果

2.1患者一般情況及COVID-19CP輸注效果重型患者4例，男/女為2/2，年齡32～79歲，≥60歲2例； 2例有基礎疾病，其中慢性乙型肝炎1例，2型糖尿病1例。4例從確診到輸注COVID-19 CP的時間為10～25 d，輸注200 mL者2例， 400 mL者2例；輸注CP后1～2 d咽拭子核酸全部轉陰；輸注過程中及輸注后均未發(fā)生輸血不良反應。

危重型7例，男/女為6/1，年齡30～83歲，≥60歲6例；6例有基礎疾病，其中冠心病2例，慢性支氣管炎1例，妊娠期糖尿病1例，高血壓合并腦梗死及乙肝1例，慢性阻塞性肺疾病合并高血壓1例。7例從確診到輸注CP的時間為13～24 d，輸注200 mL者5例， 400 mL者2例；5例輸注后2～5 d咽拭子核酸轉陰；輸注過程中及輸注后均未發(fā)生輸血不良反應；1例輸注后第3天心臟驟停死亡，1例于輸注后第6天CO2潴留、病情惡化死亡，均排除輸血不良反應。

2.2重型患者輸注前后各實驗室指標的變化主要指標測定結果見表1。重型4例輸注前PaO2和氧合指數(shù)降低2例，輸注后24 h和48 h全部正常。

輸注前，白細胞計數(shù)增高1例，輸注后24 h全部正常。輸注前淋巴細胞絕對值降低3例，CRP和降鈣素原水平升高3例；輸注后24 h，2例CRP、1例淋巴細胞絕對值正常；輸注后48 h，1例CRP、1例淋巴細胞絕對值、3例降鈣素原水平仍未正常。

輸注前，1例ALT、1例總膽紅素、3例D-二聚體、1例纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物水平增高，2例白蛋白水平降低；輸注后48 h，仍有1例白蛋白、1例總膽紅素、3例D-二聚體、1例纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物水平未正常，1例PT、APTT增高，1例纖維蛋白原水平降低。

輸注前，1例肌酸酶同工酶、3例NT-proBNP、2例LDH水平增高；輸注后48 h，1例LDH水平正常，余指標異常者未有改善。

表1 4例重型患者輸注COVID-19 CP前后主要實驗室指標的變化

2.3危重型患者輸注前后各實驗室指標的變化主要指標測定結果見表2。危重型7例輸注前PaO2降低5例,氧合指數(shù)降低7例；輸注后24 h和48 h，有3例PaO2正常，但6例氧合指數(shù)仍降低。

輸注前，2例白細胞計數(shù)升高，5例淋巴細胞絕對值降低，7例CRP和降鈣素泵水平均增高；輸注后24 h，指標異常者無改善；輸注后48 h，僅1例淋巴細胞絕對值恢復正常，余指標未有改善。

輸注前，4例總膽紅素、1例肌酐、2例PT和APTT增高，2例白蛋白、2例纖維蛋白原水平降低，7例D-二聚體和纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物水平均增高；輸注后48 h，仍有3例總膽紅素水平增高，1例PT、APTT水平增高，3例纖維蛋白原水平降低。

輸注前，2例超敏肌鈣蛋白T、1例肌酸酶同工酶、6例NT-proBNP水平增高，7例LDH均增高；輸注后 均未恢復正常。

表2 7例危重型患者輸注COVID-19 CP前后主要實驗室指標的變化

2.4典型病例患者重型1號，男，32歲，無基礎疾病，確診第9 天入院，確診第10天輸注COVID-19 CP 400 mL，同時應用干擾素α-2b霧化吸入和羥氯喹。輸注前患者發(fā)熱(38.6 ℃)，PaO2(66.7 mmHg)降低，氧合指數(shù)(190.0 mmHg)降低；白細胞計數(shù)(12.92×109個/L )增高，淋巴細胞絕對值(0.75×109個/L)降低；CRP(68.30 mg/L)、降鈣素原(0.13 ng/L)、NT-proBNP(788.70 ng/L)水平增高，白蛋白(29.30 g/L)降低，D-二聚體(0.25 mg/L)正常，余指標基本正常。輸注CP后，患者體溫下降，PaO2和氧合指數(shù)仍高， 白細胞計數(shù)、CRP、降鈣素原和NT-proBNP水平降低，淋巴細胞絕對值仍高，輸注后第2天和第3天連續(xù)核酸檢測陰性，輸注后第7天出院。

患者危重型4號，男，62歲，既往患高血壓、腦梗死和慢性乙肝，確診后第14 天入院，入院時患者氣管切開、呼吸機輔助通氣，肺部合并細菌感染和繼發(fā)真菌感染，肝功能損傷，確診后第18天輸注COVID-19 CP 400 mL，同時應用克立芝、磷酸氯喹抗病毒及對癥治療。輸注前24 h患者間斷發(fā)熱(36.4～38.2 ℃)，PaO2波動于87.9～108.0 mmHg，氧合指數(shù)波動于214.0～240.0 mmHg，白細胞計數(shù)(8.98×109個/L)增高，淋巴細胞絕對值(0.30×109個/L)降低，CRP(67.10 mg/L)、降鈣素原(0.15 ng/L)、總膽紅素(31.50 μmol/L)、D-二聚體(4.33 mg/L)、纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(11.08 mg/L)，NT-proBNP(1 033.00 ng/L)、LDH(332.00 U/L)水平增高，白蛋白(27.20 g/L)降低，余指標基本正常。輸注CP后24 h體溫正常，白細胞計數(shù)、總膽紅素、D-二聚體、纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物、NT-proBNP、LDH降低，余無明顯改善；輸注后48 h，體溫持續(xù)正常，白細胞計數(shù)、CRP和降鈣素原、總膽紅素、D-二聚體、纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物、NT-proBNP、LDH水平較輸注后24 h降低，PaO2、氧合指數(shù)、淋巴細胞絕對值和白蛋白水平無明顯改變；輸注后第4天和第5天連續(xù)核酸檢測陰性。

3 討論

CP療法是指采集康復者恢復期富含抗體的血液后輸注給其他患者，為一種被動免疫療法[2];其可能的作用機制包括直接中和病毒、控制高免疫反應和對高凝狀態(tài)的免疫調節(jié)等[7-8]。CP中的中和抗體在病毒清除中至關重要，被認為是預防病毒性疾病的關鍵[9]。除中和抗體外，CP中還含有其他保護性成分，包括IgG、IgM、抗炎細胞因子、凝血因子以及其他蛋白質。輸注CP可以抑制致病性抗體驅動的炎癥級聯(lián)反應、補體級聯(lián)反應激活導致的細胞損傷[7]。在SARS和埃博拉病毒感染的治療中，應用CP治療后患者體內(nèi)病毒載量下降，病毒特異性中和抗體增加[10-12]。目前也有多個研究[13-15]顯示，應用CP后COVID-19患者體內(nèi)病毒載量下降，體溫恢復正常，淋巴細胞水平增高，CRP和IL-6降低，氧合指數(shù)增加，隨后肺部影像學有所改善。本研究對重型和危重型COVID-19患者輸注CP前后的動脈血氣分析、血常規(guī)、CRP、降鈣素原、肝腎功能、凝血功能、心肌標志物等多個指標進行了檢測，以間接了解輸注CP對患者體內(nèi)各器官的影響。因被動免疫維持時間短，大多報道[10-15]應用CP后24 h患者體內(nèi)病毒載量下降，因此本研究選擇輸注后24 h、48 h作為檢測時間點。

本研究11例患者中，輸注CP后5 d內(nèi)，9例病毒核酸轉陰， 2例病毒核酸未轉陰者分別于輸注后第3天和第6天死亡。重型和危重型患者輸注后24 h內(nèi)均PaO2和氧合指數(shù)升高、白細胞計數(shù)下降、淋巴細胞絕對值增高、CRP和降鈣素原水平降低；提示輸注CP可抑制致病性抗體驅動的炎癥級聯(lián)反應，減輕細胞損傷，改善呼吸功能。

有文獻[16]報道COVID-19患者D-二聚體水平與死亡相關。本研究結果也顯示重型和危重型患者D-二聚體水平均增高，輸注CP后D-二聚體水平降低，因此CP可能對高凝狀態(tài)下的免疫調節(jié)[7]有一定影響。COVID-19重癥和危重癥患者易出現(xiàn)心肌損害，報道[16]顯示NT-proBNP水平升高是COVID-19患者死亡的獨立危險因素。本研究結果也顯示CP輸注前重型和危重型患者NT-proBNP水平均較高，輸注后逐漸下降，提示CP對患者心功能有一定改善作用。本組患者肝腎功能和PT、APTT異常者較少，但重型、危重型患者病情復雜不穩(wěn)定，用藥較多，可能隨時會出現(xiàn)肝腎功能、凝血紊亂的狀態(tài)。

本研究有一定的局限性。①本研究未對CP進行抗體效價的檢測。捐獻血漿者體內(nèi)的抗體效價不同，中和病毒的能力也有所差異，且抗體量會隨著時間的推移而減少[17]。本組兩名核酸未轉陰者所輸注的CP來自于同一捐獻者，核酸未轉陰可能與該份CP抗體效價較低有關。②CP治療時間對療效有影響。大多數(shù)病毒性疾病患者通常在感染后第10～14天發(fā)生主要的免疫反應，然后清除病毒。因此，在疾病早期病毒處于細胞之外時給予CP療效可能會更好[18]。本研究中重型1號患者在發(fā)病后第11天進行CP輸注，輸注后24、48 h內(nèi)PaO2持續(xù)升高，CRP、降鈣素原水平下降，淋巴細胞絕對值增高，輸注后第4天胸片顯示無明顯新發(fā)滲出影。而其他患者發(fā)病后較長時間才接受CP治療，雖各項指標有所改善，但療效不如重型1號。③其他抗病毒治療可能有助于患者的康復，或協(xié)同CP發(fā)揮治療作用。此外，一些患者接受糖皮質激素治療，這可能會干擾免疫反應和延遲病毒清除。④本研究為單中心回顧性分析，因受實驗室限制，患者治療過程中檢測項目不完整，未進行核酸定量、病毒抗體、細胞因子水平的動態(tài)監(jiān)測。

本研究初步證實了CP療法對COVID-19有效。因CP為血液制品，存在輸血不良反應等風險，輸注前應重視對患者的評估。