不同污染時(shí)長(zhǎng)土壤中石油烴的生物去除特性及影響因素

侯爽爽，吳蔓莉，肖賀月，段旭紅，易寧

（陜西省環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，西安 710055）

生物刺激修復(fù)是目前廣為采用的土壤有機(jī)污染修復(fù)技術(shù)[1-2]。石油污染土壤中由于外碳源的大量輸入，造成氮磷營(yíng)養(yǎng)相對(duì)缺乏，制約了土著微生物的代謝活性及其對(duì)石油烴的降解能力。向土壤中補(bǔ)充氮磷營(yíng)養(yǎng)或添加調(diào)理劑是一種常用的生物刺激修復(fù)方式[3-6]。一些研究對(duì)加入外源氮修復(fù)石油污染土壤進(jìn)行了詳細(xì)報(bào)道[7-9]。所采用的氮源包括無(wú)機(jī)氮源NH4Cl、KNO3、NH4NO3、（NH4）2SO4和有機(jī)氮源尿素 CO（NH2）2等多種類(lèi)型[10-13]。研究認(rèn)為，當(dāng)土壤C/N/P 接近100/10/1 時(shí)，土壤微生物活性最好，對(duì)石油烴的去除能力最強(qiáng)[14]。

微生物修復(fù)對(duì)石油烴的去除效果不僅與土壤pH值、濕度、養(yǎng)分、土壤微生物活性和數(shù)量有關(guān)，還與土壤污染時(shí)長(zhǎng)有關(guān)[15]。一些研究認(rèn)為新污染土壤中存在的大量輕質(zhì)烴具有較好的生物可利用性，容易被土壤微生物降解代謝。然而，也有研究認(rèn)為在新污染土壤中，降解菌數(shù)量少且活性低，石油污染使得土壤土著微生物處于“擾動(dòng)期”，菌群結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定降低了石油烴的生物去除效率[16-18]。陳舊性污染土壤中存在的穩(wěn)定菌群和數(shù)量較多的功能降解菌有利于石油烴的去除，但老化石油烴可能會(huì)被土壤有機(jī)質(zhì)吸附鎖定，導(dǎo)致其生物可利用性變差[19-21]。

我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，向陜北采油區(qū)污染土壤中加入有機(jī)肥可有效去除土壤中的石油烴。通過(guò)對(duì)比幾種無(wú)機(jī)氮源發(fā)現(xiàn)，KNO3對(duì)污染土壤中石油烴的去除有較好的促進(jìn)作用。脫硫石膏作為常用的土壤調(diào)理劑，可以調(diào)節(jié)土壤pH 值并改善土壤的持水性[22-23]。因此本文選取上述3 種物質(zhì)作為生物刺激劑，比較施入有機(jī)肥、KNO3、脫硫石膏對(duì)不同污染時(shí)長(zhǎng)土壤的修復(fù)效果，同時(shí)對(duì)土壤微生態(tài)變化情況進(jìn)行研究，結(jié)果可為明確土壤受到污染后的最佳修復(fù)時(shí)期及影響因素提供一定的理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 石油污染土壤

在陜北子長(zhǎng)某油井附近取受石油污染5 a以上的表層黃綿土（0～20 cm），并在附近取潔凈的未受污染土壤（土壤中石油烴背景值低于500 mg·kg-1），密封儲(chǔ)存于聚乙烯袋中帶回實(shí)驗(yàn)室。兩種土樣分別經(jīng)風(fēng)干、除雜、破碎、過(guò)2 mm篩混勻后備用。石油污染黃綿土的土壤質(zhì)地和主要理化性質(zhì)如表1所示。

新污染土壤的制備：向6.5 kg 潔凈土壤中加入130 g 原油，原油取自陜北子長(zhǎng)油田區(qū)，原油中總烴含量為81.24%，瀝青和膠質(zhì)含量低于1%，其他非烴化合物含量約為17.76%，石油烴組分的測(cè)定方法為柱層析法[24]和氣相色譜法[25]（對(duì)16 種多環(huán)芳烴進(jìn)行測(cè)定）。將土壤與原油利用滅菌鏟攪拌混勻，自然條件下放置7 d后進(jìn)行修復(fù)處理，土壤中總石油烴、烷烴和多環(huán)芳烴的含量分別為16 847、13 067 mg·kg-1和2 000 mg·kg-1。

陳舊性污染土壤：稱(chēng)取6.5 kg 從陜北子長(zhǎng)采集的陳舊性污染土壤，土壤中總石油烴、烷烴和多環(huán)芳烴的含量分別為17 746、12 667 mg·kg-1和3 567 mg·kg-1。

表1 石油污染黃綿土的基本理化性質(zhì)及土壤質(zhì)地Table 1 Physicochemical properties and soil textures of oil contaminated loessal soil

1.2 修復(fù)方案

分別利用有機(jī)肥（取自西北農(nóng)林科技大學(xué)，以干質(zhì)量比1∶2 的豬糞∶稻殼并加入5.0%的木炭渣經(jīng)堆制腐解而成，基本性質(zhì)[26]見(jiàn)表 2）、KNO3、脫硫石膏（GYP，取自西安熱電陽(yáng)光熱力有限公司，理化性質(zhì)見(jiàn)表3）作為生物刺激劑對(duì)新污染和陳舊性污染土壤進(jìn)行連續(xù)150 d 修復(fù)，具體修復(fù)方案如表4 所示。每個(gè)處理3 個(gè)平行。定期向土壤中加入滅菌純水以保持土壤含水率為15%，每3 d翻動(dòng)一次進(jìn)行通氧。

分別于修復(fù)的第 15、30、45、60、90、120、150 d 取樣，對(duì)土壤中的石油烴含量、pH 值、微生物數(shù)量及微生物活性進(jìn)行測(cè)定。

1.3 分析測(cè)定方法

1.3.1 石油烴的提取和測(cè)定

利用超聲波萃取土壤中的總石油烴并用質(zhì)量法進(jìn)行測(cè)定。稱(chēng)取5 g 待測(cè)土樣置于通風(fēng)櫥風(fēng)干研磨后，準(zhǔn)確稱(chēng)取3.0 g 干土壤于50 mL 離心管內(nèi)，加入10 mL 正己烷和二氯甲烷的等體積混合液，冰浴條件下利用超聲波破碎儀（JY96-ⅡN，寧波新芝生物科技股份有限公司）超聲萃取10 min，功率為180 W。在-4 ℃條件下，以8 000 r·min-1的速度離心15 min，過(guò)濾，收集濾液于稱(chēng)質(zhì)量后的30 mL 稱(chēng)量瓶?jī)?nèi)，重復(fù)上述操作兩次，每次加入10 mL 提取劑，合并濾液，將稱(chēng)量瓶置于通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干至恒質(zhì)量[27]。

1.3.2 土壤微生物數(shù)量的測(cè)定

采用稀釋平板法[28]對(duì)土壤中的微生物數(shù)量進(jìn)行測(cè)定，主要測(cè)定步驟如下：

土壤中微生物的提取：配制足夠量的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基（Na2HPO4·H2O 17.689 g，KH2PO43.0 g，NH4Cl 1.0 g，NaCl 0.5 g，MgSO41 mL 1 mol·L-1，微量元素 2.5 mL，純水1 000 mL）于錐形瓶中，將錐形瓶用封口膜封住，放入高壓蒸汽滅菌鍋，在121 ℃、103.4 kPa條件下滅菌30 min。待培養(yǎng)基冷卻至室溫后，準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g 土壤放入離心管內(nèi)，加入9.0 mL 滅菌的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，渦旋振蕩1 min 后，靜置20 min，潷析獲得上清液即為土壤中的微生物懸液。

土壤中微生物數(shù)量的測(cè)定：配制適量的LB 固體培養(yǎng)基（NaCl 10 g，酵母浸膏5 g，蛋白胨10 g，純水1 000 mL，固體培養(yǎng)基加18 g 瓊脂，pH 值為7.0）于錐形瓶中，按上述方法滅菌30 min。滅菌完成后，在無(wú)菌條件下將冷卻至60 ℃左右的LB 培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，冷卻待用。

將上述潷析獲得土壤微生物懸液在10 mL 離心管中進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)ㄏ♂屩?0-4～10-7），吸取100 μL的稀釋液于培養(yǎng)皿中，在酒精燈附近用涂布棒進(jìn)行涂布。將涂布好的培養(yǎng)皿倒置在30 ℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱中48 h 后，選取菌落數(shù)在30～300 之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.3 降解菌活性測(cè)定

利用原油、3 種多環(huán)芳烴混合物（菲1 g、蒽0.1 g、芘0.1 g，用二氯甲烷溶解并定容至100 mL）作為兩種自定義碳源。利用Biolog-MT2 板對(duì)石油烴降解菌活性進(jìn)行測(cè)定，具體步驟為：準(zhǔn)確稱(chēng)取各取樣周期的干土壤樣品1.0 g 放入含有99.0 mL 滅菌蒸餾水的錐形瓶?jī)?nèi)，振蕩 20 min 并靜置 30 min 后，分別移取 150 μL上清液接種到MT2 微孔板中，分別在每個(gè)微孔中加入5 μL 原油和多環(huán)芳烴作為自定義碳源，以不添加任何碳源的A1～H4 微孔為對(duì)照。將接種好的MT2 板放入恒溫培養(yǎng)箱（25 ℃）中培養(yǎng)168 h，每24 h 記錄一次數(shù)據(jù)，并記錄微孔的平均顏色變化率（Average well color development，AWCD），AWCD計(jì)算公式如下：

表2 有機(jī)肥的基本性質(zhì)（mg·kg-1）Table 2 Selected chemical characteristics of the organic fertilizer（mg·kg-1）

表3 脫硫石膏的理化性質(zhì)Table 3 Physicochemical properties of desulfurized gypsum

表4 石油污染土壤生物刺激修復(fù)方案Table 4 Experiment design for biostimulation of oil contaminated soil

式中：Ci為第i個(gè)反應(yīng)孔的光度值，Rj為第j個(gè)對(duì)照孔的光度值。

1.3.4 土壤pH值的測(cè)定

向50 mL離心管中加入10 g待測(cè)土樣及25 mL無(wú)二氧化碳蒸餾水，磁力攪拌1 min 后，靜置30 min，澄清后利用校準(zhǔn)過(guò)的pH 計(jì)（PHS-3CT，上海雷磁）進(jìn)行測(cè)定。

1.4 降解動(dòng)力學(xué)研究

利用零級(jí)、一級(jí)、偽一級(jí)、二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程對(duì)石油烴降解隨時(shí)間變化情況進(jìn)行擬合，相關(guān)系數(shù)最大者為反應(yīng)的降解動(dòng)力學(xué)模型。降解動(dòng)力學(xué)方程如下：

零級(jí)降解動(dòng)力學(xué)方程：

一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)方程：

二級(jí)降解動(dòng)力學(xué)方程：

式中：ct為隨時(shí)間變化的污染物濃度，mg·kg-1；c0為污染物初始濃度，mg·kg-1；k為零級(jí)降解動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)；t為降解時(shí)間，d；k1為一級(jí)降解速率常數(shù)，d-1；k2為二級(jí)降解速率常數(shù)，d-1。

對(duì)于石油烴降解率隨時(shí)間的變化可參考偽一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程：

式中：y為石油烴降解率，%；a為由非線性回歸曲線求得的常數(shù)；t為修復(fù)時(shí)間，d；k′為反應(yīng)速率常數(shù)，d-1。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 18.0 軟件對(duì)石油烴降解率、pH 值、微生物數(shù)量及硝氮、氨氮的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析[29-30]。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中石油烴的去除效果

新污染土壤（污染7 d）和陳舊性污染土壤（污染5 a以上）中石油烴的去除效果如圖1所示。

新污染土壤中石油烴初始含量為16 847 mg·kg-1。經(jīng)150 d的修復(fù)處理，CK、Y、Y+N、GYP 處理中的石油烴含量分別變?yōu)?2 646、6 716、7 398、10 882 mg·kg-1，石油烴降解率分別為24.94%、60.13%、56.09%、35.40%。加入有機(jī)肥和有機(jī)肥與硝酸鉀混合物對(duì)新污染土壤中石油烴的去除效果較好（圖1a）。

加入生物刺激劑對(duì)陳舊性污染土壤中石油烴的去除效果如圖1b 所示。經(jīng)過(guò)150 d 的修復(fù)，Y、GYP、Y+N 處理中石油烴含量由17 746 mg·kg-1分別降低至11 248、11 249、12 797 mg·kg-1，石油烴去除率分別為36.62%、36.61%、27.88%。對(duì)于陳舊性污染土壤，加入有機(jī)肥或脫硫石膏對(duì)土壤中石油烴的去除效果較好。

2.2 石油烴生物降解的動(dòng)力學(xué)特征

分別利用零級(jí)、一級(jí)、偽一級(jí)、二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程對(duì)石油烴降解隨時(shí)間變化的趨勢(shì)進(jìn)行擬合，擬合參數(shù)見(jiàn)表5和表6。

根據(jù)表5 和表6 可知，新污染和陳舊性污染土壤中石油烴的生物降解均符合偽一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。利用偽一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程對(duì)石油烴降解率隨時(shí)間變化趨勢(shì)進(jìn)行擬合，得到圖2。根據(jù)圖2可知，不同修復(fù)處理的土壤中石油烴生物降解隨時(shí)間變化均符合偽一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，相關(guān)系數(shù)R2在0.9以上。

2.3 生物刺激修復(fù)對(duì)土壤微生態(tài)環(huán)境的影響

2.3.1 土壤pH值

圖3 為修復(fù)過(guò)程中土壤pH 值的變化曲線。相比CK 土壤，經(jīng)生物刺激修復(fù)處理的土壤pH 值明顯降低，土壤 pH 值由 8.50～8.56 降低至 7.35～7.91。pH 值接近中性時(shí)土壤微生物活性最大，pH 值過(guò)高或過(guò)低都會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)。本研究中的污染土壤為堿性土，加入生物刺激劑降低了土壤的pH值，為土著微生物的生長(zhǎng)和代謝活性提供了有利條件。

2.3.2 土壤微生物數(shù)量

土壤微生物數(shù)量變化見(jiàn)圖4。對(duì)新污染土壤修復(fù)150 d，CK、Y、Y+N 和GYP 4 種處理中的微生物數(shù)量分別為4.7×104、8.1×106、6.9×106、5.2×105cfu·g-1土（圖4a）。經(jīng)CK、Y、Y+N 和GYP 處理的陳舊性污染土壤中微生物數(shù)量分別為 5.3×104、8.6×106、1.3×107、4.0×105cfu·g-1土（圖4b）。Y 和Y+N 修復(fù)的土壤中微生物數(shù)量最多，比CK 和GYP 處理的土壤中高出約2個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，向不同污染時(shí)長(zhǎng)土壤中加入有機(jī)肥可促進(jìn)土壤微生物的增殖，且陳舊性污染土壤中微生物數(shù)量略多于新污染土壤。

表5 新污染土壤中石油烴降解的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 5 Kinetic parameters of petroleum hydrocarbon biodegradation in the freshly contaminated soil

表6 陳舊性污染土壤中石油烴降解的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 6 Kinetic parameters of petroleum hydrocarbon biodegradation in the aged contaminated soil

2.3.3 降解菌的代謝活性

以石油烴和多環(huán)芳烴為自定義碳源，利用Biolog法測(cè)定了新污染土壤和陳舊性污染土壤中石油烴和多環(huán)芳烴降解菌的代謝活性，測(cè)定結(jié)果如圖5所示。

以石油烴為唯一碳源時(shí)，新污染和陳舊性污染土壤的 AWCD 值范圍分別為 0.08～0.51 和 0.06～0.49。不同污染時(shí)長(zhǎng)土壤中微生物對(duì)石油烴的代謝活性相差較小。新污染土壤分別在CK 和Y 修復(fù)30 d和45 d時(shí)，土壤微生物對(duì)石油烴的代謝活性最大，此后逐漸降低。陳舊性污染土壤均在Y 和Y+N 修復(fù)15 d 時(shí)，土壤微生物的代謝活性最大，此后活性隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而逐漸降低。

以多環(huán)芳烴為唯一碳源時(shí)，新污染和陳舊性污染土壤的 AWCD 值分別為 0.01～0.11 和 0.01～0.27。陳舊性污染土壤中微生物對(duì)多環(huán)芳烴的代謝活性總體大于新污染土壤。經(jīng)過(guò)120 d 的修復(fù)，新污染土壤中Y 處理對(duì)多環(huán)芳烴的代謝活性最大，CK 和Y+N 處理次之，GYP 處理中微生物對(duì)多環(huán)芳烴的代謝活性最低；陳舊性污染土壤中微生物對(duì)多環(huán)芳烴的代謝活性由高到低順序?yàn)閅＞Y+N＞CK＞GYP，與新污染土壤趨勢(shì)基本一致。結(jié)果表明，加入脫硫石膏修復(fù)處理的土壤中微生物對(duì)多環(huán)芳烴的代謝活性最差。

2.4 石油烴降解與硝氮、氨氮、pH 值及微生物數(shù)量的相關(guān)性分析

對(duì)石油烴降解率、pH 值、微生物數(shù)量及硝氮、氨氮進(jìn)行相關(guān)性分析所得的結(jié)果如表7所示。

由表7 可知，對(duì)污染時(shí)長(zhǎng)不同的土壤，影響石油烴降解的關(guān)鍵因素不同。新污染土壤中的石油烴降解率與硝氮、pH 值、微生物數(shù)量呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.686、-0.789、0.849（P＜0.01），與氨氮的相關(guān)性不顯著。陳舊性污染土壤中石油烴降解率與土壤pH 值呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.683（P＜0.01），與微生物數(shù)量及氮素含量無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系。

表7 石油污染土壤生物刺激處理的各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性分析Table 7 Correlation analysis of biological stimulation treatments of petroleum contaminated soil

3 討論

向污染土壤中施入有機(jī)肥進(jìn)行修復(fù)處理是一種環(huán)保經(jīng)濟(jì)的修復(fù)方法。有研究表明，向Cd 和Pb 污染的稻田土壤施用生物有機(jī)肥可以提高土壤pH值以及土壤養(yǎng)分含量，并顯著降低土壤有效態(tài)Cd 和Pb 的含量[31]。Wellman 等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于石油烴濃度為5 000 mg·kg-1的污染土壤，施加有機(jī)肥修復(fù)41 d后，石油烴去除率高出對(duì)照組49%。本研究中，相比脫硫石膏，施入有機(jī)肥對(duì)不同污染時(shí)長(zhǎng)土壤中的石油烴均有較好的去除效果。

有機(jī)肥中含有較高的有機(jī)質(zhì)和豐富的養(yǎng)分，向污染土壤中施入有機(jī)肥，可為土壤土著微生物提供豐富的養(yǎng)分。此外，有機(jī)肥的保水、保溫和透氣性能可為微生物的生長(zhǎng)增殖提供有利的環(huán)境條件。本研究中，向不同污染時(shí)長(zhǎng)的土壤中施入有機(jī)肥進(jìn)行修復(fù)處理，顯著提高了土壤中微生物數(shù)量和代謝活性，進(jìn)而提高了土壤中石油烴的去除效率。

生物刺激修復(fù)對(duì)新污染土壤中石油烴的去除效率高于陳舊性污染土壤，不同污染時(shí)長(zhǎng)土壤中影響石油烴降解的關(guān)鍵因素存在差異。影響新污染土壤中石油烴降解效率的主要因素包括土壤硝氮含量和微生物數(shù)量?？赡苁怯捎谠谛挛廴就寥乐?，進(jìn)入土壤中的石油烴使土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，土壤土著菌群處于“擾動(dòng)期”，此時(shí)向土壤中補(bǔ)充養(yǎng)分或者增加土壤微生物數(shù)量均可提高降解菌對(duì)石油烴的代謝活性。

陳舊性污染土壤中石油烴降解與微生物數(shù)量及氮素含量無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系。一些研究認(rèn)為[33-35]，影響陳舊性污染土壤中石油烴降解的主要因素是土壤有機(jī)質(zhì)對(duì)石油烴的吸附鎖定。陳舊性污染土壤中的石油烴經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的遷移轉(zhuǎn)化，會(huì)緩慢進(jìn)入有機(jī)質(zhì)中的玻璃態(tài)剛性區(qū)域，污染物一旦進(jìn)入介質(zhì)孔隙內(nèi)部，很難被微生物接觸利用，一部分污染物形成結(jié)合殘留態(tài)而直接被鎖定，幾乎不能被降解。

4 結(jié)論

（1）向石油污染黃綿土中加入有機(jī)肥可提高土壤微生物數(shù)量和活性，進(jìn)而促進(jìn)土壤中石油烴的去除。加入有機(jī)肥修復(fù)150 d，對(duì)新污染與陳舊性污染土壤中的總石油烴去除率分別為60.13%和36.62%。不同污染時(shí)長(zhǎng)的土壤中石油烴的生物降解均符合偽一級(jí)動(dòng)力學(xué)。

（2）新污染土壤中石油烴的去除效率與降解菌數(shù)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，影響新污染土壤中石油烴降解的關(guān)鍵因素為土壤中降解菌數(shù)量和硝氮含量。陳舊性污染土壤中的石油烴降解率與微生物數(shù)量及氮含量無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系。生物刺激修復(fù)處理使不同污染時(shí)長(zhǎng)的土壤pH 值降低，為微生物的生長(zhǎng)和活性提高提供了有利的環(huán)境條件。