慢性鼻-鼻竇炎伴息肉發(fā)病中HIF-1α表達及對Alox5和炎癥因子分泌的影響研究

王 嘉，田東倩，魏英粉，楊澤垠，邸 斌

慢性鼻-鼻竇炎是一種鼻腔和鼻腔黏膜持續(xù)性的炎癥疾病，慢性鼻-鼻竇炎包括兩大類，慢性鼻-鼻竇炎伴息肉和慢性鼻-鼻竇炎不伴息肉[1]。兩種類型的慢性鼻-鼻竇炎發(fā)病機制不同，慢性鼻-鼻竇炎伴息肉的發(fā)病機制存在多種說法，總而言之是炎癥的過程，與鼻黏膜上皮反應密不可分，比如免疫缺陷、細菌和直菌定植、上皮防御功能降低和天然免疫功能降低等[2]。鼻黏膜上皮重要的功能需要細胞之間緊密連接，緊密連接構建了氣道和上皮組織間和氣道的物理屏障。鼻黏膜上皮是接受外界環(huán)境刺激的屏障，接受外界環(huán)境刺激后會導致下游的一系列的炎癥反應，這有可能是慢性鼻-鼻竇炎伴息肉發(fā)病機制啟動的關鍵因素[3]。但鼻息肉黏膜上皮變化如何引發(fā)的鼻息肉目前還未闡明。需要今后更多的研究。乏氧誘導因子1α(HIF-1α)在腫瘤中的相關報道較多，通常在氧濃度為5%時檢測到較高蛋白表達水平[4]。5-脂加氧酶(Alox5)屬于一種多形核蛋白，是巨噬細胞、單核細胞和肥大細胞中表達的膜結合蛋白，在很多腫瘤中高表達，比如前列腺癌和胰腺癌[5]。但目前關于HIF-1α和Alox5在鼻竇炎中的作用機制尚未見報道，本研究探討HIF-1α和Alox5在慢性鼻-鼻竇炎伴息肉發(fā)病機制中的作用，為臨床慢性鼻-鼻竇炎伴息肉的治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 病例資料 研究中涉及的組織標本，選取2019年1～10月在醫(yī)院接受手術治療的26例慢性鼻-鼻竇炎伴息肉患者的標本為鼻息肉組，選擇同期20例鼻竇炎但無鼻息肉患者的竇黏膜組織為無鼻息肉組，本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，并簽署知情同意書。所有患者通過鼻竇CT檢查或者鼻內鏡檢查確診，其診斷參照《慢性鼻-鼻竇炎診斷和治療指南》[6]。鼻息肉組男17例，女9例，平均年齡(44.19±7.36)歲；無鼻息肉組男16例，女4例，平均年齡(43.57±6.94)歲。另選同期接受治療的20例鼻中隔手術或鼻竇囊腫患者的鉤突或中鼻甲黏膜組織作為對照組，男14例，女6例，平均年齡(42.97±7.15)歲。納入標準：（1）病程已經超過12 w；（2）有鼻塞、黏性或黏性膿腫鼻涕等癥狀；（3）鼻竇CT檢查或者鼻內鏡檢查確診；（4）經術后病理證實。排除標準：（1）不符合慢性鼻-鼻竇炎伴息肉診斷的患者；（2）接受過鼻腔減充血劑或糖皮質激素治療的患者。

1.2 材料和儀器 蘇木素染液購于杭州蕭山化學試劑廠；Alox5抗體購于上海生工生物工程股份有限公司；HIF-1αshRNA重組質粒和空載（陰性對照）由吉凱公司設計合成；鼠抗人HIF-1α單克隆抗體、1L-4、1L-13、1L-17A抗體購自美國R&D Systems Inc公司；離心機購于德國Ependorf公司；倒置光學顯微鏡及成像系統(tǒng)購于德國Leica公司。

1.3 HE染色 把標本組織采用4%的多聚甲醛固定,然后進行酒精脫水，二甲苯透明，在進行石蠟包埋，切成4μm薄片進行HE染色，烤片，脫蠟、蘇木素染5 min,伊紅染2 min,PBS沖洗3次，觀察嗜酸性粒細胞浸潤情況。

1.4 免疫組織化學染色 4%的多聚甲醛固定,流水沖洗，4 h固定組織，乙醇浸泡2 h，脫水透明，然后包埋蠟塊，切成4μm的薄片，烤片，PBS沖洗，抗原，滴入3%的雙氧水溶液，孵育15 min，鼠抗人HIF-1α單克隆抗體按照1∶100稀釋，滴加在盒內，在將切片放入濕盒內，室溫孵育30 min，滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素在切片上，1∶200稀釋，沖洗5 min，DAB溶液進行發(fā)光，應用蘇木素染色，應用鹽酸酒精進行分化，不同濃度酒精脫水干燥，透明處理，中性樹膠，顯微鏡下閱片，HIF-1α陽性染色呈現褐色，使用Image pro-P1us6.0軟件處理免疫組化圖片，IOD為測量的分子的值，計算平均光密度(IOD/area)。

1.5 Western blot檢測 取標本迅速放入PBS緩沖液的EP管中，在將組織轉移至無菌平皿中反復沖洗，將組織剪切成小塊，浸在0.25%的胰蛋白酶中，消化后，吹打至上皮片脫落，棄掉組織塊，將細胞懸液膠乳胰蛋白酶和胎牛血清，離心處理后，進行細胞培養(yǎng)。取對數生長期的細胞分為兩組，陰性對照組和siHIF-1α組，陰性對照組轉染空載質粒，siHIF-1α組HIF-1αshRNA重組質粒。進行蛋白進行提取,采用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度,SDS-PAGE電泳,轉膜,用5%脫脂乳封閉膜,在4℃下,添加一抗Alox5(1:500稀釋)孵育過夜,二抗孵育2 h,采用增強化學發(fā)光試劑,β-actin作內參,檢測Alox5蛋白表達。

1.6 qRT-PCR檢測 將鼻息肉標本的提取RNA,反轉錄cDNA,按照試劑的使用說明進行嚴格操作,用DNA熒光染料SYBR GreenⅠ對1L-4、1L-13、1L-17A mRNA水平進行檢測,1L-4 mRNA上游5'-GTAGGCCATTTGAGAATCCT-3',下游5'-GTTCCA TTGGAACCHAACCGT-3';1L-13 mRNA上游5'-GGA ATGCCACAAGATTCTACT-3',下游5'-GCTTAGGAC CTTGGCCAGTT-3';1L-17A mRNA上游5'-GGTTCG CGCGAATAGCTTACGT-3',下游5'-GATGAATTGGTT AGAGCGCGATG-3';β-actin作為內參,引物序列為上游5'-ACCATCTTHGATCACCTCTATC-3',下游5'-GC GCGCTATAGATACAGTCCATAGC-3',反應條件為95℃,10 min、80℃,30 min、72℃,20 s、65℃,5 min,循環(huán)次數為40次,用相對定量2-ΔΔCT計算1L-4、1L-13、1L-17A mRNA水平。同時對陰性對照組和siHIF-1α組中的1L-4、1L-13、1L-17A mRNA水平進行檢測，方法同上。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 23.0進行數據處理。符合正態(tài)分布的定量數據以±s表示，兩組間資料比較采用t檢驗，多組間資料比較采用SNK-q檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 鼻息肉組織病理學觀察 HE染色結果顯示，與對照組和無鼻息肉組相比，鼻息肉組的嗜酸性粒細胞明顯增多（P<0.05）。見圖1。

圖1 鼻息肉組織HE染色（×100）

2.2 鼻息肉組織中HIF-1α的表達 免疫組織化學染色檢測結果顯示，對照組、無鼻息肉組和鼻息肉組中HIF-1α的IOD值分別為0.14±0.02、0.21±0.02和0.46±0.03，無鼻息肉組中的HIF-1α的IOD值明顯高于對照組（P<0.05），鼻息肉組的HIF-1α的IOD值顯著高于無鼻息肉組（P<0.05）。見圖2。

圖2 鼻息肉組織中HIF-1α的表達（×100）

2.3 炎癥因子在鼻息肉組織中的表達 qRT-PCR檢測結果顯示,無鼻息肉組中的1L-4、1L-13、1L-17A mRNA的相對表達水平均明顯高于對照組（P<0.05），鼻 息 肉 組 中 的1L-4、1L-13、1L-17A mRNA的相對表達水平均顯著高于無鼻息肉組（P<0.05）。見表1和圖3。

表1 炎癥因子的表達

2.4 抑制HIF-1α對Alox5表達的影響 Western blot檢測結果顯示,陰性對照組和siHIF-1α組的蛋白表達分別為3.76±0.07和0.11±0.01，siHIF-1α組中Alox5蛋白表達水平顯著低于陰性對照組（P<0.05）。見圖4。

圖3 炎癥因子在鼻息肉組織中的表達

圖4 Alox5蛋白表達

2.5 抑制HIF-1α對炎癥因子表達的影響qRT-PCR檢測結果顯示,與陰性對照組相比，siHIF-1α組中1L-4、1L-13、1L-17A mRNA的相對表達水平均顯著降低（P<0.05）。見表2和圖5。

表2 HIF-1α對炎癥因子表達

圖5 炎癥因子的相對表達

3 討論

慢性鼻-鼻竇炎伴息肉是一種復雜的異質性疾病，嚴重的影響了患者的生存質量[7]。中鼻道和鼻竇是鼻息肉發(fā)病的主要部位，這可能與中鼻道纖毛分布不均勻，清除微生物的能力差及鼻黏膜上皮細胞生長乏氧等微環(huán)境相關[8]。由于此原因，鼻黏膜上皮免疫功能較弱，當微生物入侵該位置時，會加引發(fā)鼻黏膜上皮炎癥。相關研究表明，HIF-1α能夠介導上皮細胞向間充質細胞的轉化,而人類鼻黏膜上皮細胞轉化為間充質細胞是鼻息肉組織重塑的主要原因[9]。所以抑制HIF-1α可能成為治療慢性鼻-鼻竇炎伴息肉的新靶點。Alox5含有非血紅素鐵的雙加氧酶，也會炎癥介質的起始酶。相關研究表明，Alox5與很多疾病的發(fā)病相關，比如心血管疾病、變應性鼻炎以及腫瘤等[10]。但Alox5的表達至今未在慢性鼻-鼻竇炎伴息肉中出現過相關報道，本研究主要探討慢性鼻-鼻竇炎伴息肉發(fā)病中HIF-1α的表達及對Alox5和炎癥因子分泌的影響，為臨床在慢性鼻-鼻竇炎伴息肉靶向治療方面提供可靠依據。

嗜酸性粒細胞的激活和募集是嗜酸性粒細胞炎癥的主要特征，嗜酸性粒細胞炎癥與輔助的T細胞和HIF-1α表達關系密切[11]。本研究通過HE染色結果顯示，與對照組和無鼻息肉組相比，鼻息肉組的嗜酸性粒細胞明顯增多。為了驗證HIF-1α在鼻息肉組織中的表達，采用免疫組織化學染色檢測，結果顯示，無鼻息肉組中的HIF-1α的IOD值明顯高于對照組，鼻息肉組的HIF-1α的IOD值顯著高于無鼻息肉組。從而說明鼻息肉的患者中HIF-1α表達明顯升高，相關研究報道，鼻息肉組織與健康黏膜組織相比，HIF-1α的表達顯著增高[12]。鼻黏膜上皮是抵抗鼻腔微環(huán)境的第一道防線，當受到外界刺激時，通過合成和分泌相關細胞因子啟動下游的免疫反應[13]。有研究發(fā)現，HIF-1α在鼻息肉的血管內的血管細胞中也呈現高表達[14]。

研究表明，慢性鼻-鼻竇炎伴息肉是一種T細胞型細胞炎癥為主的疾病，表現為相關的細胞因子升高，以IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17a、IL-1b和IFN-γ分泌為主[15]。本實驗僅研究了鼻息肉組中的1L-4、1L-13、1L-17A的表達，通過qRT-PCR檢測結果顯示，無鼻息肉組中的1L-4、1L-13、1L-17A mRNA的相對表達水平明顯高于對照組，鼻息肉組中的1L-4、1L-13、1L-17A mRNA的相對表達水平顯著高于無鼻息肉組。不僅說明了鼻息肉的患者中1L-4、1L-13和1L-17A的表達明顯升高，而且也說明1L-4、1L-13和1L-17A參與了鼻息肉炎癥的變化。有研究證實，鼻息肉上皮細胞中HIF-1α與IL-17A分泌在低氧刺激時具有明顯相關性，推測抑制1L-17A炎癥反應，就抑制了淋巴血管生成[16]。進而采用沉默siHIF-1α表達， 驗證HIF-1α與1L-4、1L-13和1L-17A的相關性，結果發(fā)現，沉默HIF-1α的表達，能夠有效抑制1L-4、1L-13和1L-17A的水平，從而抑制了炎癥反應。同時也通過Western blot檢測證明發(fā)現，沉默HIF-1α的表達，也能夠降低Alox5蛋白表達。相關研究表明，在甲狀腺癌中誘導Alox5可有誘導炎癥的表達，從而促進腫瘤的侵襲，反之，抑制Alox5的表達，可以抑制炎癥反應[17]。

綜上所述，慢性鼻-鼻竇炎伴息肉中HIF-1α呈現高表達，沉默HIF-1α，能夠降低Alox5的表達和炎癥因子分泌，其機制可能通過抑制Alox5來降低炎癥因子的分泌。HIF-1α和Alox5可能成為慢性鼻-鼻竇炎伴息肉發(fā)病機制的重要靶點。