基于拉曼光譜的成團泛菌快速鑒別

宋 莉，張 孟，李 悅，郝澤壯，丁長虹，趙 妍，周長龍，段明華

微生物污染了藥品，會將藥品中的主要活性成分破壞，使得藥品失去作用效果并產(chǎn)生不良反應。所以，對藥品進行微生物限度檢查是控制和監(jiān)測藥品質(zhì)量的重要指標[1]?！吨袊幍洹芬?guī)定了控制藥品中存在的微生物范圍：霉菌、酵母菌、細菌和控制菌[2-3]。

成團泛菌，屬腸桿菌，革蘭陰性菌，黃色黏性[4]。可從水果、植物或種子中分離獲得[5-6]。 在臨床上，由成團泛菌感染引起的疾病稱為成團泛菌敗血癥，此證為急癥，病情嚴重，臨床表現(xiàn)為畏寒，高熱，病人體溫可達到39℃以上[7]。

截至目前，有一系列方法可用于菌株鑒定，主要包括：菌落培養(yǎng)后的形態(tài)學觀察、革蘭染色觀察和生化反應判定。這些方法繁瑣，耗時長，且只能對菌株進行初步鑒定。而且，確定菌株僅僅依靠一種鑒定方法是遠遠不夠的，必須結(jié)合幾種方法對菌株進行鑒定，才能得出相對準確的結(jié)論。因此，從不同角度和儀器自動化層面對菌株進行鑒定，并綜合不同的鑒定方法對菌株進行定性判定成為控制藥品質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。

本實驗從3個角度對成團泛菌進行了鑒別，應用BD Phoenix M50細菌鑒定藥敏分析儀對成團泛菌進行種屬鑒別[8-9]，微生物鑒定飛行時間質(zhì)譜儀對成團泛菌中的蛋白質(zhì)進行鑒別[10-13]，共聚焦顯微拉曼色譜儀對成團泛菌表面物質(zhì)進行掃描鑒別[14-15]。通過3個層面的鑒別，以期實現(xiàn)對成團泛菌科學準確的定性，從而控制藥品質(zhì)量，保證人民用藥安全。

1 材料與方法

1.1 儀器 木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，批號：20201222）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（揚州慧科電子有限公司，型號：GHP-9162）；微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（美國BD公司，型號：BD Phoenix M50）；微生物飛行時間質(zhì)譜儀（江蘇天瑞儀器股份有限公司福建公司，型號：JJF1528-2015）；共聚焦顯微拉曼光譜儀（RENISHAWRinVia Raman Microscop,型號：Gloucestershire,UK）。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 成團泛菌培養(yǎng) 藥品在進行微生物限度檢測時，在檢測目標菌沙門菌的培養(yǎng)板中，發(fā)現(xiàn)在XLD（木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂）培養(yǎng)基中有黃色黏性菌落生長，與沙門菌菌落形態(tài)判定不一致，所以懷疑藥品中存在其他微生物，為了藥品的安全性，對該可疑菌落進行進一步純化與鑒定。

在無菌超凈工作臺內(nèi)，采用接種針挑取單顆菌落，在XLD培養(yǎng)基平皿中劃線，然后放置于（36±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。根據(jù)觀察結(jié)果進行初步判斷，然后應用BD Phoenix M50細菌鑒定藥敏分析儀對該菌的種屬進行鑒別，應用飛行時間質(zhì)譜儀對細菌的蛋白質(zhì)進行鑒別，應用共聚焦顯微拉曼光譜儀對菌落拉曼光譜進行掃描鑒別。

1.3 鑒定方法

1.3.1 BD Phoenix M50細菌鑒定藥敏分析儀鑒定可疑菌落 根據(jù)進行的革蘭染色結(jié)果，確定該菌為革蘭陰性菌，所以在進行細菌鑒定時，選取革蘭陰性板卡進行實驗。從XLD培養(yǎng)基上挑取單一菌落，放置于鑒定肉湯管，配制菌懸液，混合均勻。應用Phoenix比濁儀監(jiān)測菌濃度，使得空白鑒定肉湯管最終菌濃度為0.5～0.6麥氏單位，60 min內(nèi)使用。取革蘭陰性板卡，使用無熒光的標記筆在板卡上進行標記，將板卡放置于加樣盤上，將鑒定菌懸液連續(xù)傾倒于板卡內(nèi)，使菌懸液充滿每一個反應孔。用密封蓋將板卡封住，將加樣完成后的板卡在30 min內(nèi)放入BD Phoenix M50細菌鑒定藥敏分析儀進行檢測。應用鑒定板轉(zhuǎn)移器進行鑒定板轉(zhuǎn)移，并保持直立狀態(tài)。

1.3.2 JJF1528-2015飛行時間質(zhì)譜儀鑒定成團泛菌（1）基質(zhì)液配制(1.0 ml)稱取15.0 mgα-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）放置于體積為1.5 ml的離心管中，向其中依次加入乙腈500μl、去離子水475μl和三氟乙酸25μl。渦旋震蕩2～3 min，常溫或置于4℃保存，有效期為1～2 w。（2）70%甲酸配制(10.0 ml)：吸取7 ml甲酸放置于體積為15.0 ml的離心管中，向其中加入蒸餾水3.0 ml，充分混勻，常溫或置于4℃，避光保存。（3）波譜采集：用10.0μl規(guī)格的移液槍頭挑取菌體，適量即可。均勻涂抹在靶點內(nèi)，向其中滴加70%甲酸1.0μl，晾干。再滴加基質(zhì)液1.0μl覆蓋樣品，晾干后進行圖譜采集。

1.3.3 成團泛菌拉曼光譜掃描 （1）白光成像：設(shè)置共聚焦顯微拉曼光譜儀(RENISHAWRinVia Raman Microscop,Gloucestershire,UK)的參數(shù)，白光成像過程中，需要調(diào)整顯微鏡放大倍數(shù)，以獲得一個較清晰的視野[16]。（2）拉曼光譜掃描：將光譜掃描設(shè)置為靜態(tài)掃描，掃描波長785 nm，掃描的光譜中心位置為500 cm-1。獲得的掃描圖譜如果沒有光譜峰，說明設(shè)置的laser power較弱；如果出現(xiàn)了虛線光譜峰，說明設(shè)置的laser power過高，信號已經(jīng)飽和。在設(shè)定的參數(shù)條件下，對成團泛菌進行靜態(tài)拉曼光譜掃描[17]。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用Graphpad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以x±s表示，采用t檢驗及單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 菌純化培養(yǎng) 在XLD培養(yǎng)基中對可疑菌落進行純化培養(yǎng)，結(jié)果見圖1，菌落呈黃色，有粘性。

2.2 BD Phoenix M50細菌鑒定藥敏分析儀鑒定BD Phoenix M50細菌鑒定藥敏分析儀在分析細菌對不同生化底物所產(chǎn)生的發(fā)熒光的物質(zhì)，通過讀數(shù)器測定熒光強度來判定細菌胞外酶；讀取數(shù)值后，自動將所測取的數(shù)據(jù)與存儲在硬盤中的菌種資料庫標準菌生物模型相比較，由電腦分析得出的結(jié)果做出鑒定。鑒定結(jié)果見表1，根據(jù)鑒定結(jié)果，將可疑菌落定性為成團泛菌。

2.3 微生物飛行時間質(zhì)譜 未知微生物通過它們各自的峰列表與數(shù)據(jù)庫的比較來鑒定。依據(jù)確定的質(zhì)量數(shù)和它們的強度的相關(guān)性生成一個匹配值，這個值用來對結(jié)果進行排序。

表1 成團泛菌生化特性檢測

應用JJF1528-2015飛行時間質(zhì)譜儀對成團泛菌進行進一步鑒定，鑒定結(jié)果見圖2。綜合分析，并與數(shù)據(jù)庫進行比對，鑒定結(jié)論為成團泛菌，儀器設(shè)備給定分數(shù)1.5以上為鑒定成功，此次檢定結(jié)果得分為1.97分，鑒定結(jié)果可信。

圖1 XLD培養(yǎng)基中菌落純化培養(yǎng)

圖2 成團泛菌飛行時間質(zhì)譜儀鑒定質(zhì)譜

2.4 拉曼光譜掃描

2.4.1 成團泛菌白光成像 對空白培養(yǎng)基和成團泛菌分別進行白光成像，見圖3（A、B），A為空白培養(yǎng)基白光成像圖，B為成團泛菌白光成像圖 。

2.4.2 成團泛菌拉曼光譜掃描 在設(shè)定的掃描參數(shù)下，對空白培養(yǎng)基和成團泛菌進行靜態(tài)掃描，獲得單一成分拉曼特征指紋圖譜?？梢钥闯?，成團泛菌的拉曼特征峰主要集中在100～1100 cm-1光譜范圍內(nèi)，在970 cm-1，1010 cm-1，附近處均出現(xiàn)明顯的特征峰，見圖3（C、D）。

3 討論

以往許多研究表明，通過外觀觀察、生化反應或單一的鑒別方法對可疑菌落得出的鑒別結(jié)論，可能會出現(xiàn)誤差甚至錯誤，從而影響對微生物的判定，影響藥品安全性。

在本實驗研究中，首先對可疑菌落在XLD培養(yǎng)基中進行了純化培養(yǎng)，應用BD Phoenix M50細菌鑒定藥敏分析對菌落進行了生物化學鑒定，初步鑒定為成團泛菌。然后應用飛行時間質(zhì)譜儀，對細菌內(nèi)的蛋白質(zhì)進行峰歸屬，進一步確定其為成團泛菌。最后應用共聚焦顯微拉曼光譜儀，對成團泛菌表面物質(zhì)進行了拉曼光譜掃描，獲得拉曼特征吸收峰。

藥品進行微生物檢測過程中[18-19]，必須證明使用的試劑對微生物無毒性。同時，在操作過程中，必須控制檢驗過程染菌，否則影響結(jié)果判定。

細菌鑒定藥敏分析方法對操作步驟要求嚴格，菌懸液配制的濃度以及應用時限都有嚴格規(guī)定。這樣就對檢驗人員的業(yè)務素養(yǎng)和能力提出了一定的要求，該方法實現(xiàn)了對菌株種屬的鑒定[20-21]。

微生物飛行時間質(zhì)譜在檢測過程中，菌株涂抹不可過厚，否則不能真實反應檢測結(jié)果。該方法對菌株中的蛋白質(zhì)進行峰歸屬檢測，檢測物質(zhì)的分子量范圍較大，同時掃描速度快[22-23]。

圖3 成團泛菌拉曼光譜掃描

拉曼光譜技術(shù)在建立成團泛菌拉曼特征指紋圖譜的過程中，將拉曼色譜峰作為鑒別不同菌株的指標。該方法能夠科學、細致、準確地實現(xiàn)菌株的快速鑒別[24-25]。

綜上所述，本實驗從通過3種不同的方法由表及里對可疑菌落進行了準確科學的判定，得出了正確的結(jié)論，有利于藥品安全和人民用藥健康。