拮抗茶輪斑病菌生防木霉菌的篩選、鑒定與應(yīng)用

盧聲潔， 趙興麗， 羅林麗， 張 欣， 程宇豪， 張金峰， 李 帥， 周玉鋒*

(1.貴州大學(xué) 茶學(xué)院， 貴州 貴陽550025； 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所， 貴州 貴陽 550006； 3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所， 貴州 貴陽 550006)

0 引言

【研究意義】茶是一種直飲品，茶葉的安全直接關(guān)乎飲茶者的健康。中國(guó)是世界上種植茶樹面積最廣、茶葉產(chǎn)出最多的國(guó)家。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年我國(guó)的茶園總面積達(dá)306.52萬hm2；干毛茶產(chǎn)量達(dá)279.34萬t，位居世界第一[1]，且我國(guó)的茶園面積和茶葉產(chǎn)量仍呈不斷增長(zhǎng)趨勢(shì)。茶輪斑病是茶樹重要的葉部病害，開展對(duì)茶輪斑病菌具較好拮抗作用生防木霉菌的篩選，對(duì)生物防治茶輪斑病及拓寬生防木霉菌的田間應(yīng)用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】茶輪斑病是茶樹栽培生產(chǎn)中一類主要的葉部病害，病原為擬盤多毛孢屬(PestalotiopsisSteyaert)真菌，病菌通常侵染成熟葉片，影響茶樹正常生理代謝，導(dǎo)致茶葉減產(chǎn)，甚至引發(fā)茶樹死亡[2-3]。生產(chǎn)上多采用化學(xué)農(nóng)藥防治該病害，但長(zhǎng)期施用化學(xué)農(nóng)藥不僅使病原菌產(chǎn)生抗藥性，達(dá)不到防治效果[4-5]；同時(shí)，化學(xué)農(nóng)藥的過量施用也對(duì)茶葉品質(zhì)、茶園生態(tài)及人體健康造成威脅[6-7]。近年來，隨著我國(guó)化學(xué)農(nóng)藥減施增效戰(zhàn)略實(shí)施，茶園減施化學(xué)農(nóng)藥成為必然趨勢(shì)[8-9]。生物防治具有綠色、安全、無抗藥性及無污染等優(yōu)勢(shì)，是推進(jìn)茶園有害生物進(jìn)行無害化治理的研究熱點(diǎn)，生防菌作為化學(xué)農(nóng)藥的替代品得到越來越多研究者的青睞。有研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、熒光假單胞桿菌(Pseudomonasfluorescens)和綠粘帚霉(Gliocladiumvirena)等生防菌對(duì)茶輪斑病菌具有較好的防治效果[10]；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)不僅對(duì)茶輪斑病病菌有明顯抑制作用，室內(nèi)盆栽條件下平均防效可達(dá)77.6%[11-12]，同時(shí)，對(duì)氯氰菊酯也表現(xiàn)出較強(qiáng)的降解能力；接種茶輪斑病菌前先接種木霉菌，可有效抑制茶輪斑病菌的侵染[13]。【研究切入點(diǎn)】木霉菌(Trichodermaspp.)具有生長(zhǎng)速度快、繁殖能力強(qiáng)、抑菌譜廣、能提高植物抗性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)，是目前應(yīng)用較為廣泛的生防真菌之一[14]。目前有關(guān)應(yīng)用生防木霉菌防治茶輪斑病菌的研究國(guó)內(nèi)雖已有文獻(xiàn)報(bào)道，但在貴州鮮見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。研究立足本地茶園生境，分離能定殖于茶樹根際的木霉菌，不僅能豐富當(dāng)?shù)啬久咕Y源，而且可為生防木霉菌的開發(fā)利用拓寬途徑。【擬解決的關(guān)鍵問題】篩選對(duì)茶輪斑病有明顯抑制效果的木霉菌，并通過田間試驗(yàn)探究木霉發(fā)酵液對(duì)茶葉品質(zhì)的影響，以期為茶輪斑病的生物防治及木霉菌的田間應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病原菌株 茶輪斑病病原菌菌株ZYP04-5(Neopestalotiopsisellipsospora)為貴州省生物技術(shù)研究所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室特色作物病害研究室分離保存。

1.1.2 土樣 共計(jì)29份土樣，于2019年9月至2020年4月采自貴州省都勻市、興義市、安龍縣、獨(dú)山縣和湄潭縣健康茶園的茶樹根際土壤，

1.1.3 試劑 葡萄糖、瓊脂、虎紅鈉鹽及氯霉素，市購；蒸餾水，自制。Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)；引物ITS4和ITS5[15]，EF1-728F/EF1-986R[16]，均由上海生工生物有限公司合成。

1.1.4 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、PDB液體培養(yǎng)基和虎紅酸鈉培養(yǎng)基，自制，滅菌后備用[17]。

1.2 方法

1.2.1 茶樹根際木霉菌的分離 采用梯度稀釋法對(duì)采集的茶樹根際土樣進(jìn)行木霉菌株分離。稱取5 g風(fēng)干土樣倒入裝有45 mL無菌水的錐形瓶中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)30 min，充分混勻后靜置30 s，取上清液獲得濃度為10-1倍的土樣懸液。無菌條件下逐一稀釋成10-2倍、10-3倍和10-4倍土樣稀釋液，靜置后用移液槍分別取濃度為10-3倍和10-4倍土樣稀釋液的樣品懸液100 μL滴于虎紅酸鈉培養(yǎng)基平板上，無菌涂布棒涂勻后封口，28℃培養(yǎng)箱中黑暗、倒置培養(yǎng)，待有菌落形成后將其轉(zhuǎn)接至新鮮PDA培養(yǎng)基上純化，得到純化菌株后用硫酸紙袋進(jìn)行低溫保存(-20℃)。

1.2.2 茶輪斑病菌拮抗木霉菌的篩選

1) 平板對(duì)峙初篩。采用2點(diǎn)對(duì)峙法篩選對(duì)茶輪斑病菌具有競(jìng)爭(zhēng)作用的木霉菌。在距離PDA平板中心2.5 cm處的直徑上分別接種直徑均為6 mm的培養(yǎng)7 d的木霉菌菌餅和茶輪斑病菌菌餅，3次重復(fù)，以單接茶輪斑病菌為對(duì)照，25℃避光培養(yǎng)7 d后測(cè)量并計(jì)算木霉菌對(duì)茶輪斑病菌的抑制效果。

2) 抑菌圈復(fù)篩。無菌條件下取8個(gè)直徑6 mm的木霉菌菌餅接種至120 mL的PDB培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d，靜置2 d，經(jīng)滅菌過濾紙初步過濾后，7 830 r/min常溫離心10 min，取上清液通過0.22 μm濾膜。按10%的比例將木霉菌發(fā)酵液加至PDA培養(yǎng)基中，混勻倒平板，取茶輪斑病菌餅(直徑6 mm)接種于平板中央，3次重復(fù)，以加等量無菌水為對(duì)照。25℃培養(yǎng)7 d，十字交叉法測(cè)量茶輪斑病菌菌落半徑，計(jì)算其抑菌效果。

3) 木霉發(fā)酵液處理對(duì)茶葉品質(zhì)的影響。試驗(yàn)在貴州省茶葉研究所茶園實(shí)施。將室內(nèi)篩選得到的有明顯拮抗效果的木霉發(fā)酵液采用常規(guī)噴霧法噴施于茶樹蓬面，以噴施清水為對(duì)照，用量8 L，3次重復(fù)，小區(qū)面積約33 m2，共約150株茶樹，隨機(jī)區(qū)組排列。30 d后采集50 cm×50 cm樣框中一芽2葉，茶樣帶回實(shí)驗(yàn)室后，先用微波爐中火進(jìn)行殺青處理90 s；再置于80℃烘箱中進(jìn)行烘干處理，干樣內(nèi)含物依托貴州省茶葉研究所采用高效液相法檢測(cè)茶葉品質(zhì)。

1.2.3 木霉菌株鑒定

1) 形態(tài)學(xué)觀察。挑取培養(yǎng)7 d的木霉菌菌落制成水玻片，于顯微鏡下觀察木霉菌分生孢子梗和分生孢子等的形態(tài)特征。

2) 分子鑒定。收集木霉菌菌絲及分生孢子，采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA；采用真菌引物ITS1/ITS4[15]和EF1-728F/EF1-986R[16]分別擴(kuò)增該菌株的ITS和EF-1α序列。擴(kuò)增產(chǎn)物送于上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)Gene Bank中的BLAST比對(duì)分析后下載相似性較高的序列，采用BioEdit進(jìn)行比對(duì)和校正；利用MAGA 6.0將ITS和EF-1α基因序列連接起來，比對(duì)拼接后的序列采用RA×ML構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定該菌與同屬菌株間的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶輪斑病菌拮抗木霉菌的分離

根據(jù)木霉菌的生長(zhǎng)特性和菌落形態(tài)特征，從29份茶樹根際土樣中分離純化出木霉菌35株。以茶輪斑病菌ZYP04-5為靶標(biāo)菌，采用平板對(duì)峙法共篩選出7株對(duì)菌株ZYP04-5生長(zhǎng)具有明顯抑制效果的木霉菌，7 d后各處理病原菌的生長(zhǎng)半徑為1.317～1.400 cm，與CK間差異顯著；抑菌率為71.07%～72.43%，均達(dá)70%以上(圖1和表1)。對(duì)7株木霉菌進(jìn)行抑菌圈復(fù)篩，僅有菌株BLS17112505和菌株DS-GSC-3表現(xiàn)抑制作用，其病原菌的生長(zhǎng)半徑分別為3.09 cm和1.17 cm，與CK間及二者間差異均顯著。其中，菌株DS-GSC-3發(fā)酵液的抑菌效果最好，對(duì)病原菌ZYP04-5的抑制率達(dá)70.53%(表2)。

注：CK為對(duì)照，單接種病原菌，其余為木霉菌與病原菌對(duì)峙培養(yǎng)；同一平板中左側(cè)為病原菌ZYP04-5，右側(cè)為木霉菌。

表1 木霉菌株對(duì)茶輪斑病菌的抑制效果

表2 木霉菌株發(fā)酵液對(duì)茶輪斑病菌的抑制效果

2.2 木霉發(fā)酵液處理茶葉的品質(zhì)

從表3看出，木霉菌株DS-GSC-3的發(fā)酵液處理茶樹后，茶葉內(nèi)含物中氨基酸含量為1.97%，較CK增加13.87%；兒茶素含量為6.96%，較CK增加8.92%。

表3 木霉發(fā)酵液處理茶葉的品質(zhì)

2.3 拮抗木霉菌株的種類鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)特征 從圖2看出， 在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d時(shí)，菌株DS-GSC-3的菌落長(zhǎng)至整個(gè)培養(yǎng)皿的2/3左右，菌落呈白色，氣生菌絲較少，無分生孢子產(chǎn)生；培養(yǎng)至7 d時(shí)，產(chǎn)生大量黃綠色分生孢子，聚集于菌落外圈，形成同心輪紋，無色素和特殊氣味產(chǎn)生。在PDA培養(yǎng)基上可產(chǎn)生半球狀分生孢子簇，散生，黃綠色或灰綠色，均呈棉絮狀。菌絲無色透明，具隔膜，直徑為3.35～4.84 μm；分生孢子梗松散對(duì)生于節(jié)上，在梗頂部瓶梗2～4個(gè)呈直角生出，安瓿瓶形；分生孢子黃綠色，亞球形至卵圓形，光滑，直徑為2.03～3.31 μm，無厚基孢子。

注：A為菌落正面，B為菌落反面，C為菌絲及分生孢子梗，D為分生孢子。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 對(duì)菌株DS-GSC-3基因組DNA的ITS和EF-1α片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序后得到序列長(zhǎng)度分別為498 bp和575 bp的片段。將序列提交NCBI比對(duì)分析后，選取并下載與菌株DS-GSC-3序列相似性高的菌株為內(nèi)群，以Nectriaberolinensis和Nectriaeustromatica為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖3)，菌株DS-GSC-3以99%的支持率與Trichodermabrevicompactum聚為一枝。結(jié)合該菌株形態(tài)學(xué)特征確定，菌株DS-GSC-3為短密木霉(Trichodermabrevicompactum)。

圖3 基于 ITS和 EF-1α構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

自1932年WEINDLING[18]首次發(fā)現(xiàn)木霉菌對(duì)立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)菌絲有重寄生作用后，有許多關(guān)于利用木霉菌防治植物病原真菌、細(xì)菌及病原線蟲等的研究報(bào)道[14]。如木霉菌株SMF2可有效抑制姜瘟青枯假單胞菌[19]；木霉菌Tr16和Tr50對(duì)桑椹菌核病病原菌核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)有明顯拮抗作用，發(fā)酵液的10倍稀釋液田間防效可達(dá)91.27%和82.53%，優(yōu)于80%多菌靈500倍稀釋液的防治效果[20]；哈茨木霉菌TRI2對(duì)田間黃瓜根結(jié)線蟲的防治效果可達(dá)72.2%，與阿維菌素的防治效果相近[21]；綠色木霉制劑36 kg/hm2處理大白菜可有效降低軟腐病和其他病害的發(fā)病率，增產(chǎn)達(dá)63.33%[22]；茶樹修剪后噴施木霉菌制劑，可有效抑制茶枝梢黑點(diǎn)病和茶根腐病發(fā)生[23]。可見，利用木霉菌防治茶輪斑病菌具有一定的可行性。據(jù)報(bào)道，現(xiàn)有超過250余種木霉商業(yè)化殺菌劑在全球范圍內(nèi)登記上市[24]，木霉在植物病害生物防治方面已展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。茶輪斑病發(fā)生危害對(duì)茶樹長(zhǎng)勢(shì)、茶葉品質(zhì)和產(chǎn)量影響較大，因此，分離篩選高效的生防木霉菌，合理利用生物防治手段控制茶輪斑病為害具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

4 結(jié)論

研究立足茶園生境，分離能定殖于茶樹根際的木霉菌，平板對(duì)峙和抑菌圈相結(jié)合篩選獲得對(duì)茶輪斑病菌具有拮抗作用的木霉菌株DS-GSC-3，該菌株對(duì)茶輪斑病菌的生長(zhǎng)抑制率為72.12%，發(fā)酵液對(duì)茶輪斑病菌的抑菌率為70.53%；發(fā)酵液噴施茶蓬30 d后，較對(duì)照分別提高茶葉中氨基酸和兒茶素含量13.87%和8.92%。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子發(fā)育分析，確定菌株DS-GSC-3為短密木霉(Trichodermabrevicompactum)。短密木霉菌株DS-GSC-3的發(fā)現(xiàn)為豐富木霉菌的開發(fā)利用拓寬了途徑，并為木霉菌防治茶輪斑病奠定了一定的理論基礎(chǔ)。關(guān)于短密木霉DS-GSC-3對(duì)茶輪斑病病原菌的拮抗機(jī)理、抗菌活性物質(zhì)以及適于田間防控應(yīng)用的劑型研發(fā)應(yīng)用還需深入開展研究。