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    一起雞H9亞型禽流感和傳染性支氣管炎共感染病例的診斷

    2021-06-07 01:52:16孟斌郭繁霞王紅梅孫培明薛聰
    山東畜牧獸醫(yī) 2021年5期
    關(guān)鍵詞:禽流感亞型支氣管炎

    孟斌,郭繁霞,王紅梅,孫培明,薛聰*

    一起雞H9亞型禽流感和傳染性支氣管炎共感染病例的診斷

    孟斌1,郭繁霞2,王紅梅3,孫培明1,薛聰*1

    (1.臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院,山東 臨沂 276000;2.臨沂科技職業(yè)學(xué)院,山東 臨沂;3.山東省莒南縣檢驗(yàn)檢測(cè)中心,山東 莒南)

    為了對(duì)送檢的一起以呼吸道癥狀為主要臨床表現(xiàn),以氣管黏膜彌漫性出血、肺臟出血為主要剖檢變化的病例進(jìn)行診斷,本試驗(yàn)采集病死雞組織樣本進(jìn)行RT-PCR以及測(cè)序鑒定。結(jié)果表明,使用H9亞型禽流感病毒HA基因、雞傳染性支氣管炎病毒M基因特異性引物,分別可以擴(kuò)增獲得528 bp、740 bp的目的片段。測(cè)序分析結(jié)果進(jìn)一步確證該病例為H9亞型禽流感病毒和雞傳染性支氣管炎病毒混合感染所致。

    隨著我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的快速發(fā)展和養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大,雞的傳染病尤其是呼吸道疫病的發(fā)生逐漸增加并趨于復(fù)雜化。在雞群中,有一類由多種致病因子協(xié)同作用,形成很難用針對(duì)單個(gè)病原體的方法防制的復(fù)合型呼吸道疾病[1]。其中,禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)H9亞型和傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)是臨床常見的兩種呼吸道病毒。

    H9亞型AIV屬于正黏病毒科,A型流感病毒屬,是H9亞型禽流感(Avian influenza, AI)的病原。雞感染H9亞型AI后會(huì)出現(xiàn)呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋率下降、孵化率降低、免疫力降低。IBV屬于冠狀病毒科(Coronaviridae),冠狀病毒屬(Coronavirus),可以導(dǎo)致雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis,IB)。IBV主要侵害雞的呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和泌尿生殖系統(tǒng),導(dǎo)致呼吸道癥狀,產(chǎn)蛋率下降、產(chǎn)畸形蛋以及腹瀉。H9亞型AI和IB兩種呼吸道疾病都能通過(guò)空氣在雞群迅速傳播,咳出的飛沫經(jīng)呼吸道傳播,經(jīng)污染的飲水、飼料等間接地經(jīng)消化道傳播,并且兩者的混合感染時(shí)有發(fā)生[2]。本試驗(yàn)基于山東省臨沂市某雞場(chǎng)的呼吸道癥狀病雞,經(jīng)臨床診斷初步確定為H9亞型AI和IB混合感染,進(jìn)一步采集組織樣本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)、測(cè)序驗(yàn)證,最終確診為H9亞型AIV和IBV混合感染。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料 動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒、M-MLV購(gòu)自杭州新景生物公司;RNA酶抑制劑、2×Taq PCR MasterMix(含染料)購(gòu)自北京索萊寶生物公司;dNTP Mixture(10 mM)購(gòu)自寶日醫(yī)生物公司;GeneGreen核酸染料、DNA Marker、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技公司。無(wú)水乙醇、DEPC等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

    1.2 樣品采集與處理 2019年12月,山東臨沂某養(yǎng)雞場(chǎng)飼養(yǎng)的25日齡雛雞出現(xiàn)明顯呼吸道癥狀,大群表現(xiàn)為精神不振、食欲減退,咳嗽、噴嚏、氣管啰音,并伴有呼吸困難表現(xiàn)。癥狀嚴(yán)重的雛雞迅速消瘦,繼而死亡,給養(yǎng)殖戶造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。剖檢病死雞,記錄眼觀病變,并采集氣管、肺臟等病料作為檢測(cè)樣品。

    1.3 核酸提取 將采集的病理組織樣品,按照核酸提取試劑盒說(shuō)明書所述方法提取核酸,用于后續(xù)病原檢測(cè)。

    1.4 病原檢測(cè) 根據(jù)GenBank發(fā)表的H9亞型AIV HA基因保守區(qū)序列,設(shè)計(jì)一對(duì)特異性檢測(cè)引物Flu-H9-F、Flu-H9-R(見表1)。IBV檢測(cè)引物參照《雞傳染性支氣管炎診斷技術(shù)》(GB/T 23197-2008)。另外,參照文獻(xiàn)[3]方法對(duì)送檢樣品進(jìn)行NDV、ILTV、FAV檢測(cè)。試驗(yàn)所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反轉(zhuǎn)錄(RT)為10 μl體系:5×M-MLV Buffer 2 μl、dNTP Mixture(10 mM)0.5 μl、Random Primers(25 μm)1 μl、RNA酶抑制劑 0.5 μl、M-MLV1 μl,RNA Template 5 μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min,42 ℃孵育60 min,95 ℃ 5 min,最后在冰上冷卻,用于后續(xù)PCR反應(yīng)。PCR采用20 μl反應(yīng)體系:2×Taq PCR MasterMix 10 μL,特異性上游、下游引物各1 μl,cDNA模板2 μl,補(bǔ)加ddH2O至20 μl。反應(yīng)條件為:94 ℃ 預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,52 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸45 s,34個(gè)循環(huán),循環(huán)結(jié)束后72 ℃ 延伸10 min,4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物,經(jīng)1 % 瓊脂糖凝膠電泳后,在紫外凝膠呈像儀下觀察結(jié)果。

    1.5 測(cè)序分析 參照《雞傳染性支氣管炎診斷技術(shù)》檢測(cè)與判定標(biāo)準(zhǔn),為進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,將上述RT-PCR獲得的IBV擴(kuò)增產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收純化后送生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)進(jìn)行BLAST分析。以上述同樣方法,對(duì)RT-PCR獲得的H9亞型AIV擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序與分析。

    表1 PCR引物序列

    2 結(jié)果與分析

    2.1 剖檢病變 對(duì)病死雞進(jìn)行剖檢,呼吸系統(tǒng)的病理變化非常明顯,主要表現(xiàn)為:氣管黏膜彌漫性出血,黏膜表面有較多黏液。有的病例發(fā)生支氣管栓塞,管腔中有黃色栓塞物。肺臟出血、腫脹,呈暗紅色。采集有明顯病變的肺臟、氣管樣本用于后續(xù)病原檢測(cè)。

    2.2 病原檢測(cè) 病原檢測(cè)結(jié)果表明:使用H9亞型AIV特異性引物Flu-H9-F、Flu-H9-R可以擴(kuò)增獲得約528bp大小的目的片段(圖1A);而使用IBV特異性引物IBV-Ms、IBV-Mx可以擴(kuò)增獲得約740bp大小的目的片段(圖1B),電泳結(jié)果均與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相一致。樣本的NDV、ILTV、FAV檢測(cè)結(jié)果均為陰性。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果初步表明:該病例存在H9亞型AIV與IBV混合感染。

    圖1 PCR鑒定結(jié)果

    A. H9亞型AIV鑒定; B. IBV鑒定M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); 1-2分別為臨床樣本、陰性對(duì)照

    2.3 測(cè)序分析 將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收純化后,送生物公司測(cè)序。使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析,結(jié)果表明:上述H9亞型AIV PCR產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)結(jié)果與A/chicken/ Jiangsu/J2177/2017(H9N2)株(登錄號(hào)MK 553996)核苷酸序列同源性最高,為99.6 %;參考株J2177屬于國(guó)內(nèi)流行較為廣泛的Y280-like分支。IBV PCR產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)結(jié)果與IBV YX10株(登錄號(hào)JX840411)核苷酸同源性最高,為99.8 %;IBV參考株YX10屬于QX型。測(cè)序分析結(jié)果進(jìn)一步確證該病例存在H9亞型AIV與IBV混合感染。

    3 討論

    (1)雞的呼吸道傳染病一直是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重要疫病。AIV和IBV作為雞呼吸道疾病的常見病原體,在我國(guó)許多地區(qū)均有報(bào)道[4]。禽流感有多個(gè)亞型,在我國(guó)流行最為廣泛的是H9亞型AIV,在分類上屬于低致病性禽流感病毒(LPAIV)。H9亞型AIV感染雞后,常表現(xiàn)輕微的呼吸道癥狀,產(chǎn)蛋量、種蛋受精率、孵化率會(huì)受到較大影響,并且會(huì)導(dǎo)致免疫力降低[5]。(2)雖然單純H9亞型AIV感染死亡率一般不高,但是當(dāng)與IBV等病原共感染時(shí),會(huì)加重雛雞的臨床癥狀以及病理變化,導(dǎo)致較高的發(fā)病率和死亡率,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1,6]。近年來(lái),AIV與IBV混合感染現(xiàn)象在國(guó)內(nèi)多地均有發(fā)生:2010-2013年從山東、遼寧、吉林、黑龍江等地規(guī)?;怆u場(chǎng)采集的111份H9亞型AIV陽(yáng)性樣品中,有74份同時(shí)檢測(cè)到IBV陽(yáng)性,混合感染率高達(dá)67 %,雞群死亡率達(dá)10 % 以上[4]?;旌细腥镜膮f(xié)同致病作用,被認(rèn)為是導(dǎo)致雞的呼吸道疾病愈加嚴(yán)重、防控更加困難的重要原因[1]。(3)目前,疫苗免疫接種是預(yù)防H9亞型AI和IB等呼吸道傳染病的重要舉措。雖然H9僅是A型流感病毒的1個(gè)亞型,但其譜系復(fù)雜,容易出現(xiàn)變異甚至抗原性改變,導(dǎo)致AIV很難得到有效控制。另外,目前眾多的H9亞型AIV疫苗也給養(yǎng)殖戶選用疫苗造成了諸多困惑[7]。如果選擇的疫苗毒株與現(xiàn)場(chǎng)流行毒株的抗原性不相符,免疫雞群仍可能會(huì)出現(xiàn)疫情。本研究中H9亞型AIV PCR產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)結(jié)果與Y280-like分支的H9N2參考毒株J2177/2017株同源性最高。Y280-like分支屬于國(guó)內(nèi)流行較為廣泛的H9亞型AIV,因此應(yīng)選擇與流行株抗原性匹配的Y280-like分支疫苗用于防控。與H9亞型AIV相似,IBV也處于不斷變異之中。IBV血清型較多,且各血清型間交叉保護(hù)作用差異較大,這為IB防控帶來(lái)挑戰(zhàn)[3]。本研究中IBV PCR產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)結(jié)果與QX型的毒株YX10株同源性最高。這與文獻(xiàn)中報(bào)道的QX型是目前山東省雞群中IBV流行的主要基因型相一致[3]。因此IB的免疫防控應(yīng)選擇QX型疫苗,或者與4/91型疫苗、H120疫苗聯(lián)合使用。(4)為了有效防控AI和IB,除了有針對(duì)性的選擇與流行株基因型、抗原性相匹配的疫苗,還應(yīng)注意疫苗免疫水平,制定科學(xué)合理的免疫程序。最后值的注意的是,疫苗免疫接種只是防控AI和IB流行的最后一道防線,只有結(jié)合平時(shí)飼養(yǎng)管理、生物安全、疫病防控等綜合措施,才能取得滿意的效果。

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    山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-11-17);山東省自然科學(xué)基金培養(yǎng)基金(ZR2019PC031);國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(201910452007)

    (2021–01–30)

    S858.3

    B

    1007-1733(2021)05-0026-03

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