鈉離子通道蛋白相關(guān)miRNA hsa-let-7i-5p 在房顫患者 冷凍球囊消融術(shù)前后表達(dá)變化及其臨床意義

宋遷甲，姚娟，燕建鋒，方舒，黃城

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830000；3.新疆石河子大學(xué)，新疆 石河子 832000)

0 引言

心房顫動(dòng)(atrialfibrillation，AF，以下簡(jiǎn)稱房顫)是近數(shù)十年來(lái)愈加熱門(mén)的心律失常疾病，現(xiàn)房顫的發(fā)病率不斷增高，老年人的房顫發(fā)病率可達(dá)3%-5%[1]，由于房顫常導(dǎo)致心衰和腦卒中，使住院率、病死率升高，小到家庭，大至社會(huì)均帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。異常調(diào)控的離子通道蛋白引發(fā)的離子流重構(gòu)和電重構(gòu)是房顫發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)，隨著醫(yī)療衛(wèi)生技術(shù)的不斷更新進(jìn)步，與房顫相關(guān)的miRNA 的研究引起了愈多的重視。雖有一些房顫射頻消融術(shù)后患者外周血及心房組織中miRNAs 表達(dá)水平的報(bào)道[2-3]，但關(guān)于冷凍球囊消融術(shù)的上述相關(guān)研究目前國(guó)內(nèi)罕有報(bào)道，本文探討冷凍球囊消融術(shù)對(duì)調(diào)控鈉離子通道蛋白的miRNA 的影響和調(diào)控作用，分析與房顫發(fā)生發(fā)展相關(guān)的預(yù)警標(biāo)志物，可能會(huì)為房顫的治療提供不同的思路與方向。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

樣本取自于2017 年1 月至2019 年10 月在新疆自治區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科住院的陣發(fā)性房顫患者45 例，男35 例，女 10 例，年齡(57.8±9.6)。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)依據(jù)國(guó)內(nèi)外通用的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，根據(jù)病史、發(fā)病時(shí)癥狀、體征、ECG 或動(dòng)態(tài)ECG 資料明確診斷陣發(fā)性房顫且接受冷凍消融術(shù)隨訪3 個(gè)月無(wú)復(fù)發(fā)者；排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡＞75 歲，甲亢，糖尿病，血壓控制不良[收縮 壓＞140mmHg 和(或) 舒張壓＞90mmHg(1mmHg=0.133 kPa)]，左室功能減低(EF＜40%)，嚴(yán)重冠動(dòng)疾病，肝、腎功能障礙，急、慢性感染疾病，心肌結(jié)構(gòu)性病變?；颊呷虢M后均接受血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素受體抑制劑(ARB)、他汀類等藥物規(guī)范控制血壓、血脂等治療。停用β阻劑和其他抗心律失常藥物，后期隨訪房顫復(fù)發(fā)者予以排除。對(duì)照組為同病區(qū)無(wú)房顫的患者15 人，男10 例，女 5 例，年齡(59.0±10.0)。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 標(biāo)本采集

在實(shí)驗(yàn)組中，患者在冷凍消融術(shù)前空腹下分別抽取4mL外周靜脈血，對(duì)照組同期抽取相同性質(zhì)血樣4mL，分別置于EDTA 抗凝管中，2 h 之內(nèi)分離血漿，1500 r/min，離心15 min，吸上清液至凍存管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?duì)于術(shù)后轉(zhuǎn)復(fù)為竇律，期間無(wú)復(fù)發(fā)的手術(shù)患者在術(shù)后3 月后我科復(fù)診，按先前同樣條件下再次采取靜脈血保存。

1.3 主要試劑及儀器

TRhol Reagent 和miRNeasv mini 試劑盒、miRCURYTM Array Power Labeling kit 標(biāo)記試劑盒、CIP 和CIP buffer 的混合物(1:1)、標(biāo)記緩沖液、熒光探針(Hy3a、9、DMSO 和標(biāo)記酶、總RNA 提取試劑盒(上海羽朵)，DEPC 處理水(無(wú)錫菩禾)，氯仿/無(wú)水乙醇(上海國(guó)藥)，SYBRGreen PCR 試劑盒(Thermo F-415XL)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo #K1622)，紅細(xì)胞裂解液(無(wú)錫菩禾)、低溫冷凍離心機(jī)(Sigma 3K15)，Real-time 檢 測(cè)儀(ABI-7500)。

1.4 試驗(yàn)方法

(1)提取RNA；(2)RNA 的提取及標(biāo)記；(3)芯片雜交；(4)實(shí)時(shí)定量PCR(real—time PCR)；(5)靶基因預(yù)測(cè)：主要通過(guò)mirbase、miranda、targetscan 三大數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)進(jìn)行miRNA 靶基因預(yù)測(cè)。利用Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行信號(hào)通路歸類，然后根據(jù)GeneOntology project數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶基因參與的生化過(guò)程、細(xì)胞組分及分子功能進(jìn)行分析。篩選所得靶基因至少存在于2 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中；(6)對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證。5 個(gè)選擇qRT-PCR 的基因引物序列如表1：

表1

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)輸入EXCEL 表格，并使用SPSS 23.0 軟件包完成。使用VolcnoPIot 法獲得差異表達(dá)，以病例組與對(duì)照組外周血比值＞1.5 倍認(rèn)為是顯著上調(diào)，比值＜1.5 倍認(rèn)為顯著下調(diào)，均用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線資料比較

在冠心病、糖尿病、高血壓、心力衰竭、卒中患病率對(duì)比中，實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，左房?jī)?nèi)徑(LAD)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在性別、年紀(jì)、吸煙、飲酒、體重質(zhì)量指數(shù)(BMI)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、BNP 方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。詳見(jiàn)表2A、2B。

表2A

2.2 miRNA 表達(dá)譜

通過(guò)將結(jié)果與已知基因組進(jìn)行比較并通過(guò)mirdeep2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，可以獲得miRNA 表達(dá)定量，miRNA 表達(dá)閾值是將每組中的(Counts per million reads)CPM 平均值超過(guò)≥1 的miRNA 視為在該組中表達(dá)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。首先，設(shè)定閾值為1.5 倍差異，p-value ≤0.05 且組內(nèi)CPM 均值≧1 來(lái)篩選差異表達(dá)miRNA，我們分析了整個(gè)AF 組(n=45)和SR(n=15)組之間miRNA 的表達(dá)。(圖A)散點(diǎn)圖、(圖B)火山圖、(圖C)聚類熱圖顯示了手術(shù)后與手術(shù)前對(duì)比miRNA 顯著差異表達(dá)的變化。

表2B

圖A

2.3 miRNA 靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果

基于靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)，分別對(duì)差異顯著上、下調(diào)的miRNA進(jìn)行靶基因篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCN5A 相關(guān)聯(lián)的miRNA hsalet-7i-5p 與房顫明顯相關(guān)，術(shù)前與術(shù)后相比明顯上調(diào)，此外，DAAM2 基因相關(guān)聯(lián)的miRNA hsa-miR-18b-5p、CLEC4G 基因相關(guān)聯(lián)的miRNA hsa-miR-1255a 也顯著上調(diào)，發(fā)現(xiàn)代表KCNA5(鉀離子通道相關(guān)基因) 的miRNA hsa-miR-4433b-3p 與房顫明顯相關(guān)，術(shù)前與術(shù)后相比明顯下調(diào)。

2.4 差異表達(dá)miRNA 的qRT-PCR 驗(yàn)證結(jié)果

驗(yàn)證選擇了代表調(diào)控鈉離子通道蛋白miRNA 的SCN5A基因進(jìn)行了qRT-PCR 驗(yàn)證，其中用內(nèi)對(duì)照基因(管家基因 GAPDH)進(jìn)行校正，進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。qRT-PCR 結(jié)果顯示，與術(shù)前相比，術(shù)后SCN5A 的表達(dá)水平顯著上升，與測(cè)序結(jié)果相吻合。(*P＜0.05，**P＜0.01，與術(shù)前相比較)。如圖2A、2B。

3 討論

AF 的主要病理生理過(guò)程是心房重構(gòu)，包括電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)異常[5]，近年來(lái)的研究認(rèn)為，異常調(diào)控的離子通道蛋白引發(fā)的離子流重構(gòu)和電重構(gòu)是房顫發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)，miRNA 參與心房電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)。在AF的動(dòng)物模型、房顫患者的心臟組織和血液中都有miRNA 的異常表達(dá)，且miRNA 表達(dá)調(diào)控能增強(qiáng)或減弱AF 的易感性[6]。SCN5A 基因位于3q21 人類染色體并編碼心臟鈉通道 Nav1.5蛋白，主要存在心肌細(xì)胞中，該通道蛋白負(fù)責(zé)鈉離子內(nèi)向電流的峰值，影響心房、心室細(xì)胞和特殊傳導(dǎo)組織(浦肯野細(xì)胞等)的興奮性和傳導(dǎo)、再極化、晚期鈉離子通道[7]。國(guó)外有科研表明，AF 發(fā)作時(shí)，AF 患者右心耳的SCN5A／Nav 1.5 表達(dá)降低和峰值鈉電流密度降低[8]。Zhao、Huang 等研究者發(fā)現(xiàn)在房顫患者心房組織中miR-192-5p 上調(diào)，SCN5A 基因表達(dá)下調(diào)[9]。Daimi 等人發(fā)現(xiàn)，miR-219 能正向調(diào)控SCN5A 的基因和蛋白表達(dá)[10]。有研究分析，對(duì)比房顫組、對(duì)照組以及房顫復(fù)發(fā)組研究對(duì)象的外周血miRNAs 表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，有25 種miRNAs 在消融復(fù)律術(shù)后表達(dá)減少或増多[11]。此外，miRNA能抑制不完全互補(bǔ)的靶基因，一種miRNA 可以調(diào)節(jié)多個(gè)靶基因，多種miRNA 又可共同調(diào)節(jié)同一個(gè)靶基因[12]。結(jié)合本研究，在預(yù)測(cè)差異表達(dá)的miRNA 靶基因時(shí)，基于靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)，分別對(duì)顯著差異上、下調(diào)的Top 10 miRNA 進(jìn)行靶基因篩選，hsa-let-7i-5p miRNA 提示顯著上調(diào)，推測(cè)其可能與SCN5A基因、SLC1A4 基因、IGF1R 基因相關(guān)聯(lián)，隨后采用qRTPCR技術(shù)驗(yàn)證SCN5A 在術(shù)后較術(shù)前明顯上調(diào)，符合上述說(shuō)法。

圖B

圖C

圖2A

圖2B

隨著年齡的增長(zhǎng)，房顫的發(fā)生率逐年上漲，即房顫的發(fā)生與年齡的增長(zhǎng)呈正相關(guān)[13]，針對(duì)房顫的治療，藥物治療為先推薦的手段，然而在治療過(guò)程中，有些患者藥物治療效果差或不能耐受藥物相關(guān)作用，故消融技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生并不斷發(fā)揚(yáng)光大，導(dǎo)管消融術(shù)成為上述人群的優(yōu)選治療方案。目前常用治療房顫的消融手段為射頻消融術(shù)(RFCA)和冷凍球囊消融術(shù)(CBA)，而CBA 作為一項(xiàng)新技術(shù)，較RFCA 學(xué)習(xí)快捷，操作簡(jiǎn)單且術(shù)后相關(guān)并發(fā)癥少，目前越來(lái)越多的的城市將其納入醫(yī)保范圍，發(fā)展前景光明。在本研究中，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，hsalet-7i-5p 在術(shù)后顯著上調(diào)，采用qRT-PCR 技術(shù)驗(yàn)證靶基因，結(jié)果與預(yù)測(cè)相符，可能機(jī)制為hsa-let-7i-5p 的調(diào)控使術(shù)前房顫的易感性增加，在術(shù)后使離子流和電活動(dòng)發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。此外，DAAM2 基因相關(guān)聯(lián)的hsa-miR-18b-5p、CLEC4G 基因相關(guān)聯(lián)的hsa-miR-1255a 在本次研究中均顯著上調(diào)，但上述基因目前與鈉離子通道是否有明確聯(lián)系，目前國(guó)內(nèi)外罕見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，需進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA hsa-let-7i-5p 在房顫患者接受CBA 前后的表達(dá)及其含量變化可體現(xiàn)其與房顫有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系，hsa-let-7i-5p miRNA 可能通過(guò)對(duì)SCN5A基因的調(diào)控，參與AF 的電重構(gòu)，由于SCN5A 是心臟動(dòng)作電位產(chǎn)生的關(guān)鍵，是抗心律失常治療的靶點(diǎn)[14]，因而miRNA hsalet-7i-5p 可能對(duì)于未來(lái)房顫的治療具有意義。但本實(shí)驗(yàn)局限是只對(duì)比了陣發(fā)性房顫手術(shù)病人樣本，在不同房顫類型中miRNA hsa-let-7i-5p 表達(dá)和含量變化是否相同，尚不明確。此外，本研究沒(méi)有進(jìn)一步行功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，若想進(jìn)一步了解及證實(shí)miRNA hsa-let-7i-5p 對(duì)SCN5A 編碼鈉通道的功能學(xué)作用，仍需更深層次的探索，如電生理及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)房顫發(fā)病機(jī)制的調(diào)控，治療的分子靶點(diǎn)的研究有重大意義。