利用流式細胞術(shù)檢測甜菜染色體倍性和DNAC-值

沙 紅，高 燕，董心久，高衛(wèi)時，瑪依拉·玉素音，楊洪澤

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】甜菜(Beta.vulgarisL.)屬于藜科(Chenopodiaceae)甜菜屬(BetaL.)，2年生經(jīng)濟作物，是我國北方重要的產(chǎn)糖原料[1]。我國甜菜種質(zhì)多樣，主要有糖用、飼用、直接食用。糖用甜菜栽培品種多為在二倍體或四倍體，在育種過程中也會出現(xiàn)單倍體、三倍體，但是甜菜多倍體品種較二倍體品種具有更強的雜種優(yōu)勢。目前，我國糖用甜菜已進入廣泛應(yīng)用多倍體雜種優(yōu)勢階段，生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的品種以三倍體雜交種為主[2]。在利用手中資源選育品種時，及時、準(zhǔn)確了解掌握材料的倍性，有利于加快選育進程、提高選育目標(biāo)性。流式細胞術(shù)(flow, cytometry, FCM)是一種能夠?qū)θ后w細胞進行單細胞水平的多個參數(shù)同時快速定量分析和分選的技術(shù)，其在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用還有較大的發(fā)展空間[3]。流式細胞技術(shù)可以精準(zhǔn)地對鞘液中的熒光微粒進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，快速、準(zhǔn)確、簡便地檢測待測植物的倍性與細胞核DNA含量，并且非常適用于大樣本的檢測分析，是近年用來檢測染色體倍性的常用方法[4-6]。倍性水平的分析、鑒定對于植物分類及育種具有重要意義[5]。研究流式細胞術(shù)檢測甜菜染色體倍性和DNAC-值，對甜菜染色體倍性、分子生物學(xué)領(lǐng)域相關(guān)研究有實際意義?！厩叭搜芯窟M展】傳統(tǒng)的倍性鑒定多采用根尖、莖尖或花粉粒直接進行染色體計數(shù)來判斷倍性，傳統(tǒng)染色體倍性鑒定技術(shù)需要專業(yè)技術(shù)人員具有相當(dāng)熟練的操作技能，過程復(fù)雜，耗時多[7，8]。李盛賢[9]在1988年報道過以掃描顯微光密度測定法對甜菜植株和種子有生殖力的多倍性進行測定。董立[10]研究了甜菜染色體鏡檢的具體方法。魯文英[11]、魏良民[12]等利用甜菜葉片保衛(wèi)細胞中葉綠體個數(shù)或觀察氣孔性狀來判斷甜菜的倍性。但用甜菜葉片保衛(wèi)細胞中葉綠體個數(shù)或觀察氣孔性狀鑒定在糖用甜菜、飼用甜菜表現(xiàn)不一樣，判斷二倍體、四倍體的標(biāo)準(zhǔn)也不同，在材料選擇時容易混亂。同時測試材料取樣條件會受環(huán)境、植株自身狀態(tài)的影響。這些間接辦法過程復(fù)雜，耗時長，準(zhǔn)確性低。目前隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，流式細胞儀的使用越來越普及，采用流式細胞儀有效克服上述缺點，能快速、簡單、準(zhǔn)確的測定甜菜種質(zhì)的倍性，尤其是在早期快速高效地鑒定、篩選出目標(biāo)倍性水平植株材料已用于相關(guān)育種應(yīng)用[13]?！颈狙芯壳腥朦c】目前國內(nèi)尚無關(guān)于利用流式細胞術(shù)鑒定甜菜染色體倍性和DNAC-值的檢測方法的研究報道。研究利用流式細胞儀測定分析不同倍性甜菜的染色體。【擬解決的關(guān)鍵問題】以二倍體M39-8-4嫩葉為材料，以已知基因組的新疆野杏洛浦洪待克為外標(biāo)，建立適合于甜菜染色體倍性和基因組的流式細胞術(shù)測定方法，為甜菜的基因組學(xué)、細胞生物學(xué)和種質(zhì)資源研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

甜菜品種： M39-8-4超原 (二倍體)，02343劉福齊(二倍體)，7208 伊抗褐(四倍體)，需鑒定材料LSR88-5-1(二倍體或四倍體)均由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所甜菜育種研究室提供。

1.2 方 法

1.2.1 解離液及 DNA 熒光染料的配制

配制細胞核解離液，所有解離液均需用真空泵抽濾(0.22 μm 濾膜)，去除大的顆粒、細菌等。預(yù)先配好的解離液均于4℃保存。核酸熒光染料是能插入雙鏈的碘化丙啶(propidium iodide, PI)，用于裝備488 nm激光 。在解離液中PI染液的終濃度50 μg/mL。并在PI 染液中加入適量 RNA 酶，排除RNA 的干擾。PI染液配制方法參照田新民[14]。表1

表1 常用細胞核解離液配方[5，7]

1.2.2 細胞核懸浮液的制備

避開主葉脈的選取葉片1.5～2 cm2，用蒸餾水沖洗2～3遍，再用去離子水沖洗2～3遍，濾紙吸干后放在清洗好的預(yù)冷培養(yǎng)皿中，加入解離液1.5 mL。將培養(yǎng)皿放在平整的冰袋上用刀片垂直、快速切碎后用200目濾膜過濾到1.5 mL離心管中， 4℃下孵育5～10 min，4℃1 000 r/min離心5 min，吸取上清棄之，在管中保留100 μL，再加入100 μL預(yù)冷的解離液。加入150 μL預(yù)冷的PI染料，輕輕混勻，在4℃下孵育10 min，上機待測。每個樣本獲得約250 μL細胞懸浮液。

1.2.3 上機檢測

流式細胞儀型號為 AccuriC6 (BD, 美國), 藍色激光488 nm激發(fā)，接受通道為波長范圍在585/40 nm的FL2的熒光。每個樣本做3次平行試驗，每次至少收集1×104個顆粒。變異系數(shù)控制在5%以內(nèi)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

FCM通過記錄樣品的 G1/G0 和G2/M 期細胞的熒光強度，反應(yīng)基于對照和樣品的G1/G0峰的熒光強度值來計算 2C DNA 含量。所有植物的單倍體 DNA含量，也以質(zhì)量值pg和Mb (1 pg=978 Mb)計算。未知樣品的倍性水平和 DNA 含量計算如下：待測樣本DNA含量(pg/Mb)=對照樣本 DNA 含量×(待測樣品 G0/G1 峰熒光均值)/(對照樣品G0/G1峰熒光均值)[7]。使用Cytometer software workspace 軟件直接讀取變異系數(shù)的、進行DNA 含量和倍性數(shù)據(jù)進行相應(yīng)分析。用Excel 2016 對數(shù)據(jù)做相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞核解離液的篩選

研究表明，用WPB解離液所制備的懸浮液上樣后不能形成峰值 ，其無法將甜菜嫩葉中細胞核完整釋放出來，收集細胞數(shù)少。Galbraith's、GP、LB01 、HEPES、MgSO4解離液有完整的峰，但峰幅較寬，在峰左右兩側(cè)出現(xiàn)背景碎片，有干擾峰出現(xiàn)。Marie's解離液制備甜菜嫩葉的細胞核解離液上樣后能形成左右對稱主峰，峰幅窄，CV值都在5%以下，上樣速率超過 200 events/μL，可重復(fù)性好，結(jié)果清晰、可靠。圖1

圖1 檢測甜菜倍性及 DNA 含量

2.2 檢測甜菜倍性

A、B分別是已確定倍性的M39-8-4超原(二倍體)和7208伊抗褐(四倍體)2份材料。二倍體材料M39-8-4超原，CV值為1.94%小于5% ，G0/G1峰值的均值為295 175.98，數(shù)據(jù)可靠；已知四倍體7208伊抗褐，CV值為 1.69%，G0/G1 峰值的均值為631 946.40，數(shù)據(jù)可靠。7208伊抗褐的熒光通導(dǎo)值約為M39-8-4超原的2倍，且CV值均小于5%，可以認為用Marie's作為流式細胞術(shù)的解離液檢測甜菜樣本倍體是可行的。待測材料 LSR88-5-1的G0/G1 峰值的均值為295 390.29，CV值為 1.52%，與二倍體材料M39-8-4超原的值很接近，熒光通導(dǎo)值約為四倍體7208伊抗褐的一半，LSR88-5-1材料為二倍體材料。表2，圖2

注：A:M39-8-4超原; B:7208 伊抗褐; C:LSR88-5-1；D：洛浦洪待克

2.3 檢測甜菜DNA值

以新疆野杏洛浦洪待克為外標(biāo)，分別測定二倍體甜菜懸浮液和新疆野杏洛浦洪待克懸浮液的熒光強度為300 000左右，新疆野杏洛浦洪待克熒光強度為110 000。研究表明，二倍體M39-8-4超原、02343劉福齊和LSR88-5-1的均值分別是295 175、320 335和295 390，DNA含量分別是821.88 Mb、 891.94 Mb和822.48 Mb。四倍體7208伊抗褐均值631 946， DNA含量1 759.59 Mb，是二倍體材料的約2倍。表2

表2 利用流式細胞儀檢測甜菜倍性及DNA含量

3 討 論

FCM是通過流式細胞分析儀對大量處于分裂間期的細胞核內(nèi)DNA含量進行檢測，經(jīng)儀器附設(shè)的計算機軟件統(tǒng)計分析，最后繪制出含量倍性的分布曲線圖，進而推斷細胞的倍性[4-6]。具體是用G1期的DNA含量間接反映染色體倍性水平。用FCM一般可同時獲得植物細胞核DNA含量和倍性的數(shù)據(jù)。自1983年Galbraith運用FCM測定了17種植物的細胞核DNA含量，流式細胞術(shù)越來越多利用在測定植物DNA含量和倍性上，如新疆野杏[7]、苜蓿[8]、梨樹[15]、棗和酸棗[16、17]、櫻屬[18]、鼠尾草[19]、草莓[20]等多種作物上開展。

流失細胞術(shù)測定的細胞必須處于單細胞懸浮液狀態(tài)，該技術(shù)關(guān)鍵在制備細胞核懸浮液和核酸熒光染色。如果細胞懸浮液制作不成功，會與未染色的陰性對照沒有顯著差別。不同植物的組織結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分存在較大差異，不同細胞核提取緩沖液及酶解液對植物的提取效果也不相同，大量研究報道表明，目前還沒有一種通用的植物細胞核解離液[5]。如報道中WPB解離液更多用在木本植物上，但新疆野杏并不適用[7]。在不同物種應(yīng)用FCM時，需要適當(dāng)改變緩沖液成分，從而獲得較高分辨率、提高結(jié)果的可靠性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性。如果想要FCM檢測甜菜倍性和DNA含量，篩選適合甜菜幼嫩葉片的細胞核解離液十分必要。常用于木本植物解離液WPB完全不適合，沒有峰形成。使用 Galbraith's、GP、LB01 、HEPES、MgSO4核解離液時，可以形成峰，但峰幅較寬，碎片較多，會形成干擾；Marie's細胞核解離液相對效果最好。與已發(fā)表其他植物相比，甜菜幼嫩葉片為材料時會多出一個較明顯的峰，其原因還需進一步探討。試驗中PI是一種目前相關(guān)DNA流式細胞術(shù)中普遍的熒光染料，用于裝備488 nm激光，能插入雙鏈DNA中。PI具有較高的分辨率及較低的毒性。這類染料除了能與雙鏈DNA結(jié)合，同樣也能與雙鏈RNA結(jié)合，在使用時同時加入了適量的RNAase。試驗結(jié)果表明，加適量RNAase的50 μg/mL PI能作為探針。

在利用FCM時，一般要選著一個已知倍性或DNA-C值得作為參考，確定待測植物的倍性[21、22]。試驗用FCM來檢測甜菜倍性和DNA含量。通過試驗確定了FCM的適用性及其具體操作步驟、細胞核解離液及注意事項方法。因此，在試驗時選擇了已明確倍性的、純度高的甜菜品系材料二倍體M39-8-4超原、02343劉福齊和四倍體7208伊抗褐和未知倍性LSR88-5-1的待測材料，同時選擇選取二倍體新疆野杏'洛浦洪待克'幼葉為外標(biāo)。試驗結(jié)果能很好的區(qū)分甜菜二倍體和四倍體材料，數(shù)據(jù)重復(fù)性好、可靠。因試驗材料的限制，沒對甜菜單倍體、三倍體進行檢測。據(jù)耿小麗等[6]報道，利用FCM鑒定紫花苜?；ㄋ幱鷤M織的變異時，能清晰的檢測出二倍體、三倍體、四倍體以及二倍體加四倍體的嵌合體。利用FCM檢測甜菜倍性對今后甜菜育種和遺傳學(xué)研究應(yīng)用很有意義。

4 結(jié) 論

Marie's是最佳的解離液，測定值變異系數(shù)均小于5.0%。甜菜幼嫩葉片可作為進行流式細胞術(shù)檢測的理想材料，通過FCM檢測供試樣本可區(qū)分甜菜二倍體和四倍體，所測的二倍體DNA含量范圍為821～891 Mb/C，四倍體DNA 含量1 759 Mb/C。