柚皮素對心肌梗死大鼠血管新生的促進作用及機制研究

王欣 李磊 陳元友 吳瀟

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院彭水分院（彭水苗族土家族自治縣人民醫(yī)院） 重慶 409600

2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院（武漢市第四醫(yī)院）

心肌梗死是因冠狀動脈閉塞造成急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，臨床表現(xiàn)為劇烈胸骨后疼痛，可并發(fā)心律失常、心衰或休克，嚴重威脅人類生命健康[1]?！吨袊难懿蟾?018》結(jié)果顯示，中國心血管病的發(fā)病率及病死率仍在逐年上升，急性心肌梗死是心血管疾病患者死亡的主要原因[2]。血管新生指在原有血管基礎(chǔ)上生長形成新血管的過程，包括血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移、分化，毛細血管形成及管壁重構(gòu)等，是機體對缺氧狀態(tài)的一種自然響應(yīng)過程[3]。研究證實，治療性血管新生能夠恢復(fù)缺血心肌血液供應(yīng)，減少心肌組織梗死，改善患者預(yù)后，在心血管疾病治療領(lǐng)域逐漸受到重視[4]。

柚皮素是傳統(tǒng)中藥枳實、枳殼中的有效活性成分，屬二氫黃酮類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和心臟保護等多種藥理作用[5]。研究表明，柚皮素能夠有效改善心臟功能，減輕氧化應(yīng)激和心肌細胞凋亡，預(yù)防心肌梗死[6]。目前，雖已有研究證明柚皮素具有心臟保護作用，但其對心肌梗死后心臟的保護作用及機制仍需進一步探討。本研究通過建立大鼠心肌梗死模型，深入觀察柚皮素對血管新生及心功能指標的影響，并初步探究其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級SD大鼠50只，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量180～220g，購于河南省實驗動物中心［實驗動物生產(chǎn)許可證號碼：SCXK（豫）2017-0001］，飼養(yǎng)于河南省實驗動物中心實驗室獨立動物房［實驗動物使用許可證號碼：SYXK（豫）2016-0002］。 飼養(yǎng)條件：室溫（22±1）℃，濕度（50±10）%，每天定時換氣，保持12h光暗照明，食水不限。本研究方案獲華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院（武漢市第四醫(yī)院）倫理委員會批準（倫理審批號：HZKJDX201801002）。

1.2 主要試劑與儀器 柚皮素購于Sigma-Aldrich公司（批號：W530098）；阿司匹林腸溶片購于拜耳醫(yī)藥保健有限公司（批號：BJ49401）；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒、Masson染色試劑盒、免疫組化檢測試劑盒均購于北京索萊寶科技有限公司（批號：T8510、G1340、SP0041）；血小板內(nèi)皮細胞黏附分 子 -1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔源單克隆抗體、羊抗兔二抗均購于美國CST公司（批號：77699、2463、20102、5174、7074）。IX53顯微鏡為日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；G:BOX多功能凝膠成像系統(tǒng)購于Syngene公司；多普勒超聲儀購于美國Beckman公司；Multiskan MK3酶標儀為Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；TGL16MB高速冷凍離心機購于長沙湘智離心機儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與造模 將50只SPF級SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、阿司匹林組、柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組，每組10只。模型組、阿司匹林組、柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組大鼠參考文獻[7]的方法，通過結(jié)扎冠脈動脈前降支，建立心肌梗死模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺，經(jīng)口行氣管插管，連接呼吸機輔助呼吸。胸前區(qū)備皮消毒，于胸骨左側(cè)第3、4肋間開胸，暴露心臟，在冠脈動脈前降支下2～3mm處結(jié)扎冠狀動脈，可見局部心肌由紅色變?yōu)榘咨?，收縮減弱，將心臟回納胸腔，縫合傷口。若心電圖可見Ⅱ?qū)?lián)ST段較手術(shù)前抬高0.2mV以上則視為造模成功。術(shù)后觀察提示，模型組、阿司匹林組、柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組大鼠均造模成功，無大鼠死亡。假手術(shù)組大鼠僅開胸，不行冠脈結(jié)扎。從造模當天開始，各組大鼠予肌肉注射4萬U青霉素預(yù)防感染，1次/d，連續(xù)3d。

1.3.2 給藥方法 造模后第2天開始給藥。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組大鼠分別予100mg·kg-1和50mg·kg-1柚皮素（藥物以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液混合均勻）灌胃，阿司匹林組大鼠予100mg·kg-1阿司匹林腸溶片（藥物研磨后溶解于0.9%氯化鈉溶液）灌胃，假手術(shù)組和模型組大鼠予20mL·kg-10.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d，連續(xù)4周。

1.3.3 心功能指標檢測 末次給藥后2h采用多普勒超聲儀檢測大鼠心功能指標，檢測指標包括左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fractions，LVEF）、左室短軸縮短率（left ventricular factional shortening，LVFS）、左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic dimension，LVESD）和左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD），連續(xù)檢測3個心動周期，取平均值作為檢測數(shù)據(jù)。

1.3.4 標本制備 處死大鼠，分離心臟，每組各取5只大鼠心臟以4%多聚甲醛溶液固定，用于HE染色、Masson染色和免疫組化染色；每組余下5只大鼠心臟組織-80℃凍存，用于Western blot檢測。

1.3.5 大鼠心肌組織病理學(xué)觀察

1.3.5.1 HE染色觀察心臟組織病理變化 大鼠心臟組織在4%多聚甲醛溶液中固定48h后，蒸餾水清洗，梯度乙醇脫水，制作蠟塊，冰上預(yù)冷4μm切片，二甲苯脫蠟30min，梯度乙醇及蒸餾水中復(fù)水，HE染色，脫水、透明后中性樹膠封片，光鏡下觀察大鼠心臟組織病理變化。

1.3.5.2 Masson染色觀察心臟組織纖維化情況 取4%多聚甲醛溶液固定的大鼠心臟組織，切片、脫蠟、復(fù)水過程同1.3.5.1。Weigert鐵蘇木素染色5min，酸性乙醇分化5～15s，Masson藍化液返藍3～5min，麗春紅酸性品紅染液染色5～10min，弱酸工作液（蒸餾水:弱酸溶液=2:1）洗滌1min，磷鉬酸溶液染色1min，弱酸工作液洗滌1min，苯胺藍染色1～2min，弱酸工作液洗滌1min，95%乙醇和無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察心臟組織纖維化情況。

1.3.6 免疫組化染色檢測CD31表達水平和微血管密度（microvascular density，MVD） 取大鼠心臟組織制作石蠟切片，方法同1.3.5.1。60℃烤片2h，二甲苯脫蠟2h，梯度乙醇復(fù)水，隨后進行抗原修復(fù)、封閉，滴加以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋的CD31兔源單克隆抗體（稀釋比例為1:100），放入濕盒中，4℃過夜，次日加入羊抗兔二抗37℃孵育0.5h，PBS沖洗后加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液，蘇木精染細胞核，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，光鏡下觀察。CD31陽性細胞可被染成棕黃色，主要分布于梗死區(qū)周邊范圍，梗死區(qū)少見。隨機選取梗死周邊區(qū)域5個視野，計算CD31呈陽性的微血管數(shù)量，取平均值，即MVD。使用Image Pro Plus Version 6.0分析CD31陽性表達的光密度（integral optical density，IOD）值，IOD值越高代表CD31陽性表達率越高。

1.3.7 Western blot檢測VEGF和bFGF蛋白表達水平 取凍存的大鼠心臟組織，冰上研磨，離心取沉淀，加入裂解液提取肺組織蛋白，蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），上樣后80V電泳2h，60V轉(zhuǎn)膜2h，5%脫脂奶粉封閉2h，隨后將條帶放入VEGF、bFGF兔源一抗稀釋液中，稀釋比例均為1∶1 000，4℃過夜，次日以含吐溫的Tris緩沖鹽溶液（Tris buffered saline tween，TBST）緩沖液清洗后加入羊抗兔二抗（稀釋比例：1∶2 000），37℃孵育2h，洗膜，滴加發(fā)光液，置于凝膠成像系統(tǒng)顯影。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，采用Image J軟件分析各蛋白對應(yīng)的灰度值，計算蛋白的相對表達量，蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗重復(fù)3次，計量資料以±s表示，多樣本比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心功能指標比較 各組間總體比較，LVEF、LVFS、LVESD和LVEDD指標差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組、阿司匹林組、柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組LVEF和LVFS均降低，LVESD和LVEDD均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，阿司匹林組、柚皮素高劑量組柚皮素低劑量組LVEF和LVFS增加，LVESD降低，LVEF和LVFS增加，LVESD和LVEDD降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與阿司匹林組比較，柚皮素高劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），柚皮素低劑量組LVEF和LVFS降低，LVESD和LVEDD增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與柚皮素高劑量組比較，柚皮素低劑量組LVEF和LVFS降低，LVESD和LVEDD增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見表1。

表1 各組大鼠心功能指標比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of cardiac function indexes in each group （±s，n=10）

表1 各組大鼠心功能指標比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of cardiac function indexes in each group （±s，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與阿司匹林組比較，△P＜0.05；與柚皮素高劑量組比較，▲P＜0.05Note:Compared with sham operation group，*P＜0.05;compared with model group，#P＜0.05;compared with aspirin group，△P＜0.05;compared with naringenin high-dose group，▲P＜0.05

組別 LVESD（mm） LVEDD（mm） LVEF（%） LVFS（%）假手術(shù)組 4.77±0.88 6.95±0.98 78.70±4.88 42.50±3.01模型組 9.18±1.36* 10.44±1.41* 38.29±2.11* 16.55±2.12*阿司匹林組 7.06±1.18*# 8.74±1.33*# 54.33±3.27*# 24.85±2.54*#柚皮素高劑量組 7.18±1.09*# 8.69±1.29*# 54.98±3.02*# 24.51±2.68*#柚皮素低劑量組 8.11±1.21*#△▲ 9.35±1.15*△▲ 49.67±2.74*#△▲ 21.75±2.02*#△▲

2.2 各組大鼠心肌組織形態(tài)觀察 HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組心肌組織結(jié)構(gòu)正常、完整，心肌細胞分布均勻、有序，輪廓清晰可見，胞核與胞質(zhì)邊緣分明，血管管腔完整。與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織存在著色較淺、組織排列紊亂、細胞輪廓不清晰和細胞破碎等現(xiàn)象，伴有炎癥細胞浸潤。與模型組比較，柚皮素高劑量組心肌組織排列較為整齊，著色均勻，有少量炎癥細胞浸潤，血管管腔完整度較好，但阿司匹林組和柚皮素低劑量組心肌組織仍存在一定程度排列紊亂和心肌細胞核質(zhì)不清晰的現(xiàn)象，整體著色較淺。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織形態(tài)變化（HE染色，400×）Fig.1 Morphological changes of myocardium in each group（HE staining，400×）

2.3 各組大鼠心肌膠原組織變化觀察 Masson染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組心肌組織形態(tài)完整、清晰，鏡下視野呈紫紅色，部分血管周圍有少量呈藍色的膠原組織。與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織排列紊亂，呈紫紅色的心肌組織明顯減少，存在大量呈藍色的膠原纖維，血管破碎，部分血管呈管腔狹窄和閉合現(xiàn)象。與模型組比較，柚皮素高劑量組和阿司匹林組均以紫紅色心肌組織為主，藍色膠原纖維大量減少，但柚皮素低劑量組仍存在較多的藍色膠原纖維組織，且分布較紊亂。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌膠原組織形態(tài)變化（Masson染色，400×）Fig.2 Morphological changes of myocardial collagen tissue in each group（Masson staining，400×）

2.4 各組大鼠免疫組化CD31表達及MVD比較 各組間總體比較，CD31表達水平與MVD數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組CD31表達水平和MVD增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，阿司匹林組、柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組CD31表達水平增加（P＜0.05），柚皮素高劑量組和低劑量組MVD增加（P＜0.05）；與阿司匹林組比較，柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組CD31表達水平和MVD增加（P＜0.05）；與柚皮素高劑量組比較，柚皮素低劑量組CD31表達水平和MVD降低（P＜0.05）。見圖3、表2。

表2 各組大鼠免疫組化CD31表達及MVD比較（±s，n=5）Tab.2 Comparison of CD31 expression and MVD in each group（±s，n=5）

表2 各組大鼠免疫組化CD31表達及MVD比較（±s，n=5）Tab.2 Comparison of CD31 expression and MVD in each group（±s，n=5）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與阿司匹林組比較，△P＜0.05；與柚皮素高劑量組比較，▲P＜0.05Note:Compared with sham operation group，*P＜0.05;compared with model group，#P＜0.05;compared with aspirin group，△P＜0.05;compared with naringenin high-dose group，▲P＜0.05

組別IOD MVD（個）假手術(shù)組 5.89±0.54 2.41±0.22模型組 10.44±0.67* 4.98±0.39*阿司匹林組 13.72±0.58*# 5.68±0.52*柚皮素高劑量組 50.96±0.91*#△ 10.36±0.55*#△柚皮素低劑量組 19.37±0.87*#△▲ 7.99±0.39*#△▲

圖3 各組大鼠免疫組化CD31表達比較（400×）Fig.3 Comparison of immunohistochemical CD31 expression in each group（400×）

2.5 各組大鼠心肌組織VEGF、bFGF蛋白表達比較 假手術(shù)組、模型組、阿司匹林組、柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組VEGF蛋白相對表達水平分別為（0.17±0.03）、（0.30±0.04）、（0.81±0.07）、（1.08±0.09）、（0.77±0.08）；bFGF蛋白相對表達水平分別為（0.15±0.02）、（0.26±0.03）、（0.69±0.05）、（1.05±0.08）、（0.75±0.08），各組間總體比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組、阿司匹林組、柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組VEGF、bFGF蛋白表達水平增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，阿司匹林組、柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組VEGF、bFGF蛋白表達水平增加（P＜0.05）。柚皮素高劑量組VEGF、bFGF蛋白表達水平高于阿司匹林組和柚皮素低劑量組 （P＜0.05），柚皮素低劑量組與阿司匹林組VEGF、bFGF蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠心肌組織VEGF和bFGF蛋白表達比較Fig.4 Comparison of VEGF and bFGF protein expression in myocardial tissues in each group

3 討論

心肌梗死是心血管疾病相關(guān)的主要死亡原因，常見治療方法包括藥物治療、溶栓治療、介入治療及冠脈搭橋術(shù)等，雖然對于該類疾病的預(yù)防和治療研究已取得成效，但該病的發(fā)病率和病死率依然居高不下，且上述常見療法對于冠狀動脈遠端彌漫性病變、復(fù)發(fā)性病變及無法手術(shù)的嚴重多支病變效果不佳[8-9]。近年來，治療性血管新生成為心絞痛、心肌梗死等心血管疾病臨床治療的研究熱點。新生血管的生成和發(fā)展是對器官病理性損害或缺血缺氧的重要潛在補救措施，通過各種療法促使心肌缺血區(qū)血管新生能夠為冠脈提供有效的側(cè)支循環(huán)，從而改善心臟功能，治療心肌梗死[10]。柚皮素是廣泛存在于蕓香科植物中的一種二氫黃酮類化合物，也是多種中藥的主要有效成分。研究表明，柚皮素對多種原因?qū)е碌男募p傷具有保護作用，能夠改善心肌細胞凋亡和心肌纖維化，抑制心臟驟停大鼠的心臟衰竭和心肌損傷[11-12]。然而，柚皮素是否具有促進心肌梗死后血管新生的作用尚未明確，本研究構(gòu)建了大鼠心肌梗死模型，旨在觀察柚皮素對心肌梗死大鼠血管新生的影響，并初步探究其作用機制。

LVEF、LVFS、LVESD和LVEDD是評價心臟功能的常用指標，本研究中多普勒超聲結(jié)果顯示，模型組LVEF和LVFS均降低，LVESD和LVEDD均增加，而阿司匹林、高劑量和低劑量柚皮素可增加LVEF和LVFS，降低LVESD和LVEDD，表明心肌梗死后大鼠心功能顯著降低，出現(xiàn)明顯心室擴張和重構(gòu)，阿司匹林、高劑量和低劑量柚皮素可顯著改善大鼠心臟功能，減輕心肌梗死后出現(xiàn)的失代償性心室擴張。心肌細胞屬于終末細胞，心肌梗死會導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的組織缺血壞死，從而誘發(fā)機體的自我保護反應(yīng)，包括早期無菌性炎癥反應(yīng)和修復(fù)期成纖維細胞增殖、瘢痕形成及血管新生等活動，然而持續(xù)的炎癥損傷和過度的修復(fù)反而會加劇細胞死亡和心肌收縮功能障礙，不利于心功能的改善[13-14]。本研究采用HE染色和Masson染色觀察各組大鼠心肌梗死后心肌組織病理生理學(xué)改變。結(jié)果顯示，心肌梗死對大鼠心肌組織造成明顯損傷，大量膠原纖維增生，但柚皮素可改善大鼠心肌損傷現(xiàn)象，使膠原纖維沉積減少，其中高劑量柚皮素的效果優(yōu)于低劑量，表明一定劑量的柚皮素能夠顯著抑制心肌梗死導(dǎo)致的組織損傷，減輕心肌組織膠原纖維的沉積。

CD31是內(nèi)皮細胞的特異性標志物，在評價血管新生情況時多采用CD31免疫組化染色來統(tǒng)計MVD，以此反映血管的生成情況[15]。本研究結(jié)果顯示，心肌梗死后心肌組織CD31表達水平和MVD增加，而阿司匹林及不同劑量的柚皮素均可增加心肌組織CD31表達水平和MVD，其中柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組CD31表達水平和MVD顯著高于阿司匹林組，表明柚皮素能夠顯著增加大鼠心肌梗死后心梗邊緣區(qū)域CD31的表達，有效促進血管新生。VEGF是特異性最高、作用最強的促血管生成細胞因子，能夠特異性作用于血管內(nèi)皮細胞，促進細胞增殖、出芽、遷移和血管形成過程，已被證明可促進缺血性心臟病患者血管新生[16]。bFGF是一種生長刺激因子，能夠特異性作用于血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞及神經(jīng)細胞。已有研究證實，VEGF和bFGF在促進血管新生過程中有明顯的協(xié)同效應(yīng)[17]。本研究結(jié)果顯示，模型組VEGF、bFGF蛋白表達水平高于假手術(shù)組，表明大鼠心肌梗死后，機體出現(xiàn)代償反應(yīng)；與模型組比較，阿司匹林組、柚皮素高劑量組和柚皮素低劑量組VEGF、bFGF蛋白表達水平增加，其中柚皮素高劑量組VEGF、bFGF蛋白表達水平高于阿司匹林組和柚皮素低劑量組，表明柚皮素促進血管新生的作用可能與VEGF、bFGF蛋白表達水平升高密切相關(guān)。

綜上所述，柚皮素能夠改善心肌梗死大鼠的心功能，減輕心肌梗死后的組織損傷和膠原沉積，有效促進血管新生，其作用機制可能與促進VEGF、bFGF蛋白表達升高有關(guān)。