堿蓬內(nèi)生菌PTL-1的分離鑒定及其次生代謝產(chǎn)物

趙倩倩, 王敏敏, 羅 成, 秦敬嘉, 李亞榮, 田 露

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

0 引言

植物內(nèi)生菌對植物次級代謝產(chǎn)物的轉化起重要作用，能產(chǎn)生與宿主相同或相似的代謝產(chǎn)物[1,2].隨著對內(nèi)生菌的深入研究，現(xiàn)在已經(jīng)從植物內(nèi)生菌中分離出了大量新結構、生物活性顯著的次級代謝產(chǎn)物，主要有生物堿類、萜類、甾體類、酚類、異香豆素類、苯丙素類、大環(huán)內(nèi)酯類、聚酮類、有機酸類等化合物，大多具有抗腫瘤活性、抗菌活性、抗氧化活性、抗病原菌、免疫抑制及對病蟲害的防治作用[3-7].

堿蓬屬(Suaeda) 植物廣泛分布于世界各地的鹽堿土地區(qū)，是一類典型的鹽生植物，屬于重要的鹽生植物資源[8-10].高鹽環(huán)境中生長的耐鹽植物組織中可能蘊藏著豐富的真菌，但從鹽堿地上生長的耐鹽植物堿蓬根系分離真菌的研究甚少[7].

本研究從堿蓬中分離純化得到6株內(nèi)生真菌，以其中具有較高清除DPPH自由基的PTL-1菌株為目標菌株,通過分子生物學手段對菌株進行鑒定，利用不同光譜技術及色譜分析方法對菌株代謝產(chǎn)物進行分離及鑒定.旨在了解我國鹽堿地耐鹽植物根際真菌及其代謝產(chǎn)物多樣性，為此類真菌資源的開發(fā)利用打下基礎.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

從堿蓬分離得到6株內(nèi)生真菌，堿蓬采于陜西省榆林市鹽堿地.植物樣品取出后放入聚乙烯袋，4 ℃保存?zhèn)溆?菌株于-80 ℃冰箱保存.

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，切丁水煮30 min，過濾液加入葡萄糖20 g，1 000 mL水，瓊脂20 g.

1.1.3 試劑及儀器

PCR反應體系購于TAKARA公司；PCR引物由上海生物工程有限公司合成；硅膠板：30X100 mm；葡聚糖凝膠：Sephadex LH-20.

PCR儀2720 thermal cycler(Applied Biosystems公司)；MQ D-0.4型壓力蒸汽滅菌器(邢臺醫(yī)療器械廠)；SW-CJ-IF單人雙面凈化工作臺(蘇州宏瑞凈化科技有限公司)；旋轉蒸發(fā)儀 N-1300(上海愛朗儀器有限公司)；ZF-2型三用紫外分析儀(上海市安亭電子儀器廠)；電熱恒溫鼓風干燥箱(西安莫吉娜儀器制造有限公司)；無菌96孔板(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；Bruker Avance 400m核磁共振波譜分析儀(德國Bruker公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離純化

內(nèi)生菌的分離純化如前所述[11].將新鮮堿蓬根、莖、葉清洗干凈，先后置于75%乙醇3 min和5%次氯酸鈉5 min進行表面消毒處理，然后浸泡于硫代硫酸鈉溶液3 min進行中和.用無菌水沖洗三遍，并用最后一次沖洗的無菌水作為漂洗對照.將表面消毒后的堿蓬組織取1 g置于研缽內(nèi)，加入5 mL無菌水后充分研磨.研磨后取上清液0.1 mL稀釋三個梯度在PDA平板上涂布.28 ℃培養(yǎng)1到3周.根據(jù)菌落形態(tài)及顏色挑取不同菌落，經(jīng)純化后甘油保藏于-80 ℃.

1.2.2 DPPH·自由基清除實驗

采用DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)法測定每種菌株粗浸膏的抗氧化活性[12].樣品濃度分別為2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL和10 mg/mL，向各反應體系加入200μmol/L的DPPH甲醇溶液3 mL，樣品(粗提物用甲醇溶解后分別配置成不同濃度樣品)2 mL，避光反應30 min后于517 nm處測定吸光度，空白組用甲醇代替樣品，對照組用甲醇代替DPPH甲醇溶液，根據(jù)吸光度計算清除率，篩選出抗氧化活性強的菌株.

1.2.3 目標菌株鑒定

目標菌株鑒定參照文獻[13]方法.將分離得到的6株內(nèi)生菌進行初篩，每株菌株用PDA培養(yǎng)基，220 r/min、250 mL培養(yǎng)液加入到500 mL錐形瓶中于恒溫28 ℃，轉速為220 r/min振蕩箱中發(fā)酵培養(yǎng)21天，21天后取出培養(yǎng)基，減壓抽濾，濾液用乙酸乙酯(體積比，乙酸乙酯∶濾液=1.5∶1)萃取得到粗浸膏，菌株鑒定用真菌基因組提取試劑盒提取各菌株的基因組DNA作為模板.采用真菌內(nèi)轉錄間隔區(qū)1和2序列的通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行擴增.產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司進行測序，將得到的菌株的測序序列在NCBI中進行序列比對，獲得與其序列相似的其他菌株的序列.再用CLUSTALX1.83軟件進行序列匹配排隊整理，用MEGA7.0軟件中的鄰近法構建系統(tǒng)進化樹.

1.2.4 發(fā)酵液粗提物的制備

發(fā)酵液粗提物的制備可參考文獻[14].菌株發(fā)酵21 d后取出發(fā)酵液，減壓抽濾得到濾液和菌絲體，按照濾液∶乙酸乙酯=1∶1.5的體積比用乙酸乙酯萃取，重復萃取3次，靜置待分層后合并有機層萃取液，經(jīng)旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至蒸干(溫度：45 ℃，轉速：45 r/min)得到菌液浸膏A，用少量甲醇洗出至接收瓶，自然揮干，保存?zhèn)溆?將菌絲體搗碎置于500 mL的燒杯中，以甲醇浸提，置于超聲波下重復提取三次，每次2 h，減壓抽濾.濾液用1.5倍體積的乙酸乙酯進行萃取，重復三次，合并菌絲體提取液，減壓濃縮得到菌絲體乙酸乙酯萃取浸膏B，用少量甲醇洗出至接收瓶，自然揮干，標記，備用.

1.2.5 粗提物的分離純化

粗提物的分離純化可參考文獻[15].

(1)硅膠柱層析(浸膏B)

將浸膏B進行正相硅膠柱層析分析，用石油醚∶丙酮=1∶0、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1和1∶1作為洗脫劑進行梯度洗脫.用西林瓶接收洗脫液樣品，每瓶5 mL，經(jīng)TLC檢測，合并相同組分，得到9個組分，編號為F1-9.

(2)葡聚糖凝膠柱層析

實驗用Sephadex-LH-20型葡聚糖凝膠進行純化，取上述組分F5用甲醇至完全溶解后上樣，甲醇進行洗脫.用西林瓶按順序連續(xù)收集洗脫液，得到各組分樣品，用薄層色譜檢測，合并相同組分，得到純化合物1及組分F5a-5h，備用.

(3)正向硅膠柱層析對F5d進一步分離純化

根據(jù)組分F5d的量選擇合適的玻璃柱，干法裝柱，氯仿∶乙酸乙酯=50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1和1∶1進行梯度洗脫.每個西林瓶收集5毫升洗脫液.TLC對收集液進行檢測，得到純化合物2.

1.2.6 單體化合物的結構鑒定

單體化合物的結構鑒定參考前述方法[16]，將分離得到的單體化合物1和2，分別用0.6 mL氘代氯仿溶解后，進行核磁共振波譜檢測，通過lH NMR、13C NMR數(shù)據(jù)結果及文獻調(diào)研進行結構確定.

1.2.7 單體化合物的 DPPH·自由基清除實驗

樣品濃度分別為300μg/mL、500μg/mL、700μg/mL、900μg/mL、1 000μg/mL，參照前述實驗方法對分離得到的兩個甾體類化合物進行DPPH·自由基清除作用檢測.

2 結果與討論

2.1 菌株的分離及粗提物DPPH清除作用

對六種菌株用改良馬丁培養(yǎng)基(250 mL)在37 ℃恒溫振蕩箱220 r/min下培養(yǎng)21 d，而后對發(fā)酵液粗提物的浸膏進行抗氧化測試，其結果如圖1所示.由圖1可以看出，菌株1對DPPH·自由基的清除率隨著濃度的增高而變高，但增長趨勢比較平緩；菌株4對DPPH·自由基的清除率先增后降，濃度越高，其對DPPH·自由基的清除率反而減弱；菌株2，菌株3和菌株6對DPPH·自由基的清除率隨著濃度的升高而增大，但菌株2相對于菌株3和菌株6的增長幅度要快，其對DPPH自由基的清除率也就越高，因此，本實驗篩選出的目標菌株為菌株2，隨后對該菌種進行鑒定和擴大培養(yǎng).

圖1 各菌株對DPPH自由基的清除率

2.2 菌種鑒定

菌種的菌落形態(tài)具輻射狀皺紋，邊緣菌絲體白色，質地絨狀，分生孢子結構大量，藍綠色，有些許淺黃色滲出液和可溶性色素，菌落反面呈淺黃褐色，如圖2(a)所示.將該菌株2命名為PTL-1，提取其基因組，通過通用引物PCR擴增真菌內(nèi)轉錄間隔區(qū)1和2的序列(圖2(a))，隨后送公司測序.通過分子生物學根據(jù)測序結果進行菌種鑒定，結果顯示PTL-1為產(chǎn)黃青霉屬無性型真菌，屬于半知菌亞門絲孢綱絲孢目從梗孢科青霉屬的真菌，如圖2(b)所示.

(a)菌落形態(tài)及ITS基因PCR結果

(b)基于ITS序列鑒定菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹圖2 菌種鑒定結果

2.3 單體化合物的分離純化

對發(fā)酵培養(yǎng)的8 L培養(yǎng)液經(jīng)過過濾得到菌絲體和菌液，菌液經(jīng)減壓濃縮得到1.006 g浸膏，菌絲體用甲醇浸泡，超聲波輔助提取3次，每次2 h，隨后經(jīng)減壓抽濾，乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得到10.056 g.

由于最后菌液所得浸膏量較少，所以將菌液浸膏編號，備用.而菌絲體浸膏量大，將菌絲體浸膏上硅膠柱層析進行分離，具體的分離純化過程如圖3所示.以石油醚：丙酮為洗脫劑進行梯度洗脫，用西林瓶收集洗脫液，每瓶5 mL，依次編號，采用TLC進行跟蹤鑒定，將相同組分進行合并，最終得到9個洗脫組分，依次標號F1～F9.

圖3 內(nèi)生菌次級代謝物分離純化流程圖

浸膏經(jīng)硅膠柱層析分離得到的洗脫組分F5用葡聚糖凝膠柱層析，以甲醇為洗脫劑進一步分離純化，用西林瓶收集洗脫液，每瓶5 mL，依次編號，采用TLC對洗脫組分進行分析，合并相同組分，得到純化合物1及組分F5a～F5h.

取洗脫組分F5d采用硅膠柱層析，以氯仿∶乙酸乙酯為洗脫劑進行梯度洗脫，經(jīng)TLC檢測，合并相同組分，得到純化合物2.

2.4 單體化合物的結構鑒定

內(nèi)生菌PTL-1發(fā)酵培養(yǎng)物菌絲體甲醇浸提部分分別經(jīng)過硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析等，得到化合物1和2(如圖4、圖5所示).經(jīng)核磁共振波譜分析以及與文獻數(shù)據(jù)對比最終確定化合物1和2的結構，分別是3β-羥基-(22E,24R) -麥角甾烷-5,7,22-三烯；5α，8α-氧橋麥角甾-3β-6,22-二烯[17].其具體結構如圖6所示.

(a)化合物1的氫譜

(b)化合物1的碳譜圖4 化合物1的氫譜和碳譜

(a)化合物2的氫譜

(b)化合物2的碳譜圖5 化合物2的氫譜和碳譜

(a)化合物1

(b)化合物2圖6 單體化合物結構

化合物1為針狀晶體.ESIMS(m/z 397[M+H]+)結合13C NMR給出分子式為C28H44O.仔細分析化合物的核磁數(shù)據(jù)(如表1～2所示)：

1H NMR(400 MHz,CDCl3)：δ0.622(s,3H,18-CH3),0.807-0.839(2d,J=6.8 Hz,6H,26-CH3,27-CH3),0.901(d,J= 6.8 Hz,3H,28-CH3),0.938(s,3H,19-CH3),1.037(d,J=6.6 Hz,3H,21-CH3),1.255-2.039(m,19H),2.278-2.310(tm,1H,H-4a),2.444-2.500(m,lH,H-4b),3.600-3.635(m,lH,H-3),5.168-5.208(m,H-22,H-23),5.358-5.388(m,1H,H-7),5.542-5.562(dd,IH,H-6).

13C NMR(400 MHz,CDCl3)：δ12.03 (C-18),16.26(C-19),17.59(C-28),19.63(C-26),19.95(C-27),21.08(C-21,C-11),22.97(C-15),28.29(C-16),31.96(C-2),33.06(C-25),38.34(C-10,C-1),39.04(C-12),40.43(C-20),40.76(C-4),42.79(C-24,C-13),46.19(C-9),54.52(C-14),55.66(C-17),70.42(C-3),116.24(C-7),119.54(C-6),131.91(C-23),135.53(C-22),139.76(C-5),141.35(C-8).

這些數(shù)據(jù)表明，化合物1的結構被確定為(22E,24R)-ergosta-5,7,22-trien-3β-ol.

化合物2為白色粉末.ESIMS(m/z 429[M+H]+)結合13C NMR給出分子式為C28H44O3.仔細分析化合物的核磁數(shù)據(jù)(表1～2)：

1H NMR(400 MHz,CDCl3)：δ0.818 (s,3H,18-CH3),0.802-0.882(d,6H,26-CH3,27-CH3),0.911(d,3H,28-CH3),0.894(s,3H,19-CH3),1.002(d,3H,21-CH3),1.200-2.200(m,21H,steroid skeleton),5.140-5.208 (dd,2 X lH,H-22, H-23),6.233(d,J=8.5 Hz,1H,H-7),6.514(d,J=8.5 Hz,1H,H-6).

13C NMR (400 MHz,CDCl3)：δ12.83(C-18),18.15(C-19),17.53(C-28),19.93(C-26),19.61(C-27),20.84(C-21),23.35(C-11),20.58(C-15),28.64(C-16),30.04(C-2),33.01(C-25),36.85(C-10),34.62(C-1),39.26(C-12),39.73(C-20),36.89(C-4),44.50(C-13),42.71(C-24),50.98(C-9),51.61(C-14),56.10(C-17),66.39(C-3),130.68(C-7),135.15(C-6),132.22(C-23),135.36(C-22),82.12(C-5),79.38(C-8).

上述分析表明，該化合物2是一個甾體，鑒定化合物2為5α,8α-epidioxy-(22E,24R)-ergosta-6,22-dien-3β-ol.

表1 化合物1,2的13C NMR數(shù)據(jù)

表2 化合物1,2的1H NMR數(shù)據(jù)

2.5 單體化合物的 DPPH·自由基清除實驗

在實驗中，化合物1和2分別配置濃度為300μg/mL、500μg/mL、700μg/mL、900μg/mL、1 000μg/mL進行DPPH·自由基的清除率檢測.實驗結果表明,化合物在1 000μg/mL時,化合物1和2對DPPH·自由基的清除率均小于15%.因此,化合物1和2對DPPH·自由基的清除作用較弱.

3 結論

本論文從堿蓬中分離純化得到6株內(nèi)生菌株，以抗氧化活性為目標篩選菌株，發(fā)現(xiàn)菌株2對DPPH自由基有較強清除能力.根據(jù)分子生物學方法初步鑒定該菌株為產(chǎn)黃青霉屬無性型真菌，將其命名為PTL-1.并進行擴大培養(yǎng)、發(fā)酵液經(jīng)過濾、乙酸乙酯萃取和濃縮得菌絲體浸膏，浸膏分別采用硅膠柱層析和葡聚糖凝膠柱層析等分離手段對其次生代謝產(chǎn)物進行分離純化.

進一步利用核磁共振波譜對分離得到的單體化合物進行結構鑒定，得到2個甾體化合物，對這兩個化合物進行 DPPH·自由基清除實驗，結果表明兩個甾體類化合物的DPPH·自由基清除作用較弱.該結論為篩選生物活性天然產(chǎn)物以及后期結構改造奠定基礎，對充分利用我國微生物資源發(fā)現(xiàn)具有生物活性的天然產(chǎn)物具有重要的意義.