混菌發(fā)酵對葡萄酒成分的影響機制

劉瑤，盧浩成，胡麗，胡娟，成池芳，王軍*

（1. 中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院/農業(yè)農村部葡萄酒加工重點試驗室，北京 100083；2. 新疆中信國安葡萄酒業(yè)有限公司/新疆釀酒葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，新疆瑪納斯 832200）

葡萄酒濃郁復雜的香氣和豐富的口感給人們帶來了感官的享受和心靈的愉悅。作為一種發(fā)酵飲品，微生物賦予了葡萄酒最主要的發(fā)酵香氣。風味的復雜平衡和典型性對葡萄酒品質至關重要。大量研究表明，相比于單純釀酒酵母發(fā)酵，混合發(fā)酵產生的揮發(fā)性物質種類和含量更多，風味更協(xié)調多樣，更能體現(xiàn)釀酒葡萄種植地的風土特點。事實上，在許多傳統(tǒng)葡萄酒產區(qū)，利用原生酵母自然發(fā)酵仍是葡萄酒釀造，尤其是紅葡萄酒釀造的常規(guī)方法。隨著對非釀酒酵母在改善葡萄酒香氣、口感、顏色等品質方面認識的加深，越來越多的商業(yè)化非釀酒酵母被應用到葡萄酒發(fā)酵中。

目前，在微生物生理和代謝組層面的葡萄酒混合發(fā)酵研究主要探究不同酵母菌的生理代謝活動過程和相互作用，一些物質直接參與葡萄酒品質相關的化學反應，如代謝酶、揮發(fā)性物質、醇類、有機酸等，一些物質通過調節(jié)微生物活動來發(fā)揮作用?；旌习l(fā)酵研究的目的是解釋并利用影響葡萄酒感官特性的生物化學原理，為混合發(fā)酵實際應用提供理論基礎。

1 混合發(fā)酵對葡萄酒化學成分的積極影響

混合發(fā)酵對葡萄酒品質的影響不一。許多非釀酒酵母具有優(yōu)良的發(fā)酵特性，如高產香氣化合物、高產增香酶類、釋放更多的甘露糖蛋白、低產乙酸、降解蘋果酸等來改善葡萄酒的風味、口感和顏色[1]。而有些非釀酒酵母發(fā)酵產生揮發(fā)性脂肪酸、含硫化合物、羰基化合物等導致葡萄酒的不良風味。因此，要根據(jù)葡萄品種、釀造工藝和陳釀條件選擇適合的混合發(fā)酵菌種，達到改善葡萄酒品質的目的。

1.1 揮發(fā)性化合物

混合發(fā)酵對葡萄酒揮發(fā)性化合物產生影響的化學基礎包括香氣合成相關酶活性（糖苷酶、醇酰基轉移酶、酯酶、脂肪酶、蛋白酶等）、歐利希通路機制、糖蛋白的分泌以及由非釀酒酵母和釀酒酵母相互作用產生的揮發(fā)性物質。

1.1.1 品種香

混合發(fā)酵體系的高糖苷酶活性有利于增加葡萄酒的品種香和香氣復雜度。葡萄果實中存在的糖苷結合態(tài)香氣物質如單萜烯、降異戊二烯和芳香族化合物在糖苷酶作用下被釋放，具有了揮發(fā)性。β-葡萄糖苷酶廣泛存在于非釀酒酵母中，假絲酵母屬（Candida）、畢赤酵母屬（Pichia）、美極梅奇酵母屬（Metschnikowia）、絲孢酵母屬（Trichosporon）、紅酵母屬（Rhodotorula）、漢遜酵母屬（Hanseniaspora）和威克漢遜酵母屬（Wickerhamomyces）都檢測到糖苷酶活性[2]。葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）和膜璞畢赤酵母（Pichia membranifaciens）的β-葡萄糖苷酶活性在數(shù)量眾多的非釀酒酵母中處于較高的水平，葡萄汁有孢漢遜酵母在發(fā)酵環(huán)境中具有最高的β-葡萄糖苷酶活性[3]。王佳等[4]對14種941株野生酵母菌進行鑒定和產β-葡萄糖苷酶能力分析，發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶活性在酵母菌種間和種內均可表現(xiàn)出顯著差異，其中陸生伊薩酵母（Issatchenkia terricola）和季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）產β-葡萄糖苷酶的能力最強；部分非釀酒酵母具有α-阿拉伯糖苷酶、α-鼠李糖苷酶和木糖苷酶活性[5]。這些糖苷酶催化末端糖苷的解離，有利于葡萄糖苷鍵斷裂[6]。酶的存在位置和聚合方式的差異會導致β-葡萄糖苷酶活性的差異[7]。

含硫化合物在葡萄酒中一般表現(xiàn)出不良風味，然而某些痕量級揮發(fā)性硫醇表現(xiàn)出愉悅的香氣[8]。酵母菌的代謝使得揮發(fā)性硫醇從與半胱氨酸結合的前體物中釋放出來[9]?；旌习l(fā)酵的菌種相互作用也可以提高葡萄酒揮發(fā)性硫醇的含量。釀酒酵母和戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）在混合發(fā)酵過程中的協(xié)同作用使得3-巰基己醇含量提高，表現(xiàn)出水果香氣[10]。‘長相思’葡萄酒中3-巰基己基乙酸鹽含量在克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）和釀酒酵母混合發(fā)酵條件下顯著提高[5]。

1.1.2 發(fā)酵香

由酒精發(fā)酵產生的揮發(fā)性風味物質形成的發(fā)酵香是葡萄酒重要的香氣組成。形成發(fā)酵香的風味物質主要是乙醇、高級醇、雜醇和酯類。雜醇油和高級醇在酵母細胞中由氨基酸在歐利希通路（纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸）分解代謝得到[11]。例如，苯丙氨酸代謝得到苯乙醇和乙酸苯酯，這兩種物質都帶有玫瑰香氣。異丁醇和異戊醇由纈氨酸和亮氨酸代謝產生，異亮氨酸代謝產生2-甲基丁醇。Amparo等在研究不同酵母菌發(fā)酵香氣特征時發(fā)現(xiàn)，非釀酒酵母中的季也蒙有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）、加勒比星形酵母（Starmera caribaea）、亞膜威克漢姆酵母（Wickerhamomyces subpelliculosus）、有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae）、哈薩克斯坦合孢酵母（Kazachstania gamospora）和微橢圓形有孢酵母（Torulaspora microellipsoides）產生上述三種雜醇的量是釀酒酵母的3～27倍，說明在非釀酒酵母細胞中歐利希通路支鏈氨基酸表達量更高[12]。另外有研究顯示，即使發(fā)酵環(huán)境相似，不同種酵母菌產生的高級醇種類和產量存在差異，說明非釀酒酵母調節(jié)歐利希通路的機制比釀酒酵母更加多樣[13]。

酯類物質合成和相互轉化以酶反應為基礎，混合發(fā)酵和非釀酒酵母胞外酶處理對提高發(fā)酵過程中酯類物質種類和含量都有良好的效果。其中，中鏈脂肪酸乙酯濃度變化很大程度上與中鏈脂肪酸濃度有關，而乙酸酯的合成與酶活性高度相關[14]。與酯類合成相關的酶主要是醇?；D移酶和酯酶。酯酶不僅可以催化酯化反應，還能水解酯類，改變不同酯類比例。同時，一些非釀酒酵母具有高產脂肪酶能力，脂肪酶催化葡萄中和酵母自溶產生的甘油三酯和脂質，提高底物濃度，對酯類物質產生有利[15]。目前的研究大多集中在對不同來源、不同種類的非釀酒酵母增香特性的分析。

對葡萄酒香氣有貢獻的酯類是高級醇的乙酸酯和中鏈脂肪酸乙酯。通常認為釀酒酵母發(fā)酵高產乙酸酯，如乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯。在Amparo的同一研究中發(fā)現(xiàn)，加勒比星形酵母和季也蒙漢遜酵母產生上述乙酸酯的量比釀酒酵母Lalvin T73高44～84倍，乙酸酯賦予葡萄酒香蕉、梨和熱帶水果的香氣；釀酒酵母高產己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯3種酯類，4種非釀酒酵母的丁酸乙酯和異戊酸乙酯產量很高，這5種酯類使得葡萄酒帶有菠蘿、蘋果等水果香氣[12]。

非釀酒酵母和釀酒酵母在發(fā)酵過程中的相互作用對葡萄酒揮發(fā)性化合物存在影響。Philippe等人發(fā)現(xiàn)，乙酸異丁酯和乙酸異戊酯在戴爾凱氏有孢圓酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵體系中的產量顯著高于兩者單獨發(fā)酵[16]。Moreira等發(fā)現(xiàn)，與葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵過程中，酯類總體產量相比于該酵母純種發(fā)酵過程有所增加，酯類中乙酸乙酯的產量降低[17]。Kurita等人對比研究低水平乙酸乙酯的異常畢赤酵母（Pichia anomala）突變體與野生型的代謝指標發(fā)現(xiàn)，由于異常畢赤酵母代謝產生的乙酸乙酯，釀酒酵母中乙酸酯水解酯酶活性增加，同時檢測到混合發(fā)酵體系中乙酸乙酯含量的降低和乙酸異戊酯含量的升高[18]。可能的原因是乙酸酯水解酯酶分解乙酸乙酯釋放乙酸，其與發(fā)酵產物異戊醇發(fā)生了酯化反應，因此盡管在乙酸酯水解酯酶活性高于純種發(fā)酵的條件下，混合發(fā)酵依然增加了乙酸異戊醇含量。

1.1.3 陳釀香

葡萄酒在陳釀過程中酵母菌發(fā)生自溶，細胞中的代謝物質和酶被釋放出來，細胞蛋白、核酸和脂類通過酶促反應被分解，氨基酸、肽、脂肪酸和核苷酸等反應產物是合成雜醇油、高級醇和酯類的前體物質。

總的來說，非釀酒酵母產甘露糖蛋白能力優(yōu)于酵母菌，混合發(fā)酵體系甘露糖蛋白水平更高。甘露糖蛋白是位于酵母細胞外壁上的一類糖蛋白，其通過對葡萄酒中揮發(fā)性物質結合作用，避免香氣成分的散失而增強葡萄酒香氣的持久度[19]。葡萄酒中的甘露糖蛋白有兩種來源，一是由酵母菌在酒精發(fā)酵過程中分泌（0.1～0.15 g/L）[20]；二是陳釀過程中酵母自溶，即細胞壁結構破壞后甘露糖蛋白和細胞壁中的葡聚糖、幾丁質分離。Pascale等利用提取的甘露糖蛋白在模擬酒液中檢測乙酸異戊酯、己醇、乙酸乙酯和β-紫羅蘭酮的揮發(fā)性發(fā)現(xiàn)，甘露糖蛋白可與這4種香氣物質發(fā)生結合，使其揮發(fā)性降低，產生保留作用[21]。Juega發(fā)現(xiàn)高濃度的甘露糖蛋白對萜烯（香葉醇和芳樟醇）也有保留作用[22]。研究發(fā)現(xiàn)，某些非釀酒酵母在無多糖葡萄汁中釋放甘露糖蛋白的能力高于釀酒酵母，例如耐熱克魯維酵母（Kluyveromyces thermotolerans）、嗜高滲漢遜酵母（Hanseniaspora osmophila）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）、路德氏酵母（Saccharomycodes ludwigii）和戴爾凱氏有孢圓酵母[23]。除此之外，Laura等人發(fā)現(xiàn)釀酒酵母和克魯維酵母菌的天然雜種的發(fā)酵環(huán)境中甘露糖蛋白的含量高于釀酒酵母發(fā)酵環(huán)境，并發(fā)現(xiàn)天然雜種內基因組相互作用創(chuàng)造了促進甘露糖蛋白分泌的生物環(huán)境[24]。

1.2 與味覺、觸覺相關的化合物

在品嘗葡萄酒時，酸度、甜味、單寧、乙醇構成葡萄酒的基本味覺，蘋果酸、酒石酸等有機酸形成酸味；糖和甘油具有甜味；單寧產生收斂感；乙醇與干葡萄酒的苦味相關并且有溫熱、輕微灼燒的感覺。酸度、酒度、單寧（紅葡萄酒）和甜味組合形成的結構一般被認為支撐葡萄酒的酒體。

1.2.1 甘油

甘油濃度超過5.2 g/L會產生甜味，甘油還可以增加葡萄酒的黏稠度，賦予葡萄酒柔和圓潤的口感和飽滿的酒體。釀酒酵母產甘油量一般在5～8 g/L[25]。許多非釀酒酵母都有比釀酒酵母更優(yōu)越的產甘油能力，如星形假絲酵母（Candida stellata）產甘油能力非常突出，最高可達到14 g/L[26]。有趣的是，這種非釀酒酵母通常只能代謝果糖，因而與釀酒酵母混合發(fā)酵完成時可使殘?zhí)呛看蟠蠼档?，并縮短發(fā)酵時間。許多產區(qū)干紅葡萄酒都存在殘?zhí)歉撸?～10 g/L）的問題。利用這種非釀酒酵母混合發(fā)酵是一種可能的解決方法。但需要注意的是，甘油會打破酵母細胞內氧化還原電位的平衡，乙酸、乙醛和乙偶姻的增加導致葡萄酒風味不良[27]。

1.2.2 多糖

多糖能夠增加葡萄酒的黏性和酒體的飽滿度，柔化澀感。葡萄酒中含量最豐富的多糖是來源于葡萄的阿拉伯半乳糖蛋白，其次是甘露糖蛋白[28]。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵畢赤酵母、嗜高滲漢遜酵母、路德氏酵母、貝利接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）與釀酒酵母混合發(fā)酵后葡萄酒中多糖的濃度增加[29-30]。

1.2.3 有機酸

葡萄酒中與風味相關的有機酸主要包括酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸。混合發(fā)酵可以實現(xiàn)葡萄酒有機酸的協(xié)調。葡萄醪中過量的有機酸不僅影響酵母發(fā)酵，且葡萄酒酸/甜、風味/香氣味感不平衡。葡萄果實酒石酸和蘋果酸的比例在1∶1～1∶3，兩者共同組成葡萄果實90%以上的有機酸，在正常紅葡萄酒pH3.4下，酒石酸酸味強度是蘋果酸的3倍[31]。蘋果酸呈現(xiàn)尖銳的青蘋果酸味，酒石酸帶有檸檬酸味且不會被乳酸菌和酵母菌分解。乳酸酸味柔和，是由酒精發(fā)酵后乳酸菌完成的蘋果酸-乳酸發(fā)酵產生的。乙酸是葡萄酒中最主要的揮發(fā)酸，是酒精發(fā)酵和乳酸菌代謝的副產物，葡萄酒中乙酸含量超過0.8～0.9 g/L就會顯示出明顯的醋味，果香喪失，酒體單薄。因此，維持乙酸正常水平同時使蘋果酸降解轉化是葡萄酒有機酸協(xié)調的目的。

蘋果酸-乳酸發(fā)酵是降低蘋果酸的常用方法。釀酒酵母對蘋果酸利用能力很弱。研究發(fā)現(xiàn)，裂殖酵母屬菌種在酒精發(fā)酵過程中可以有效代謝分解蘋果酸[32]。耐熱克魯維酵母代謝產生乳酸，還具有降低葡萄酒乙酸含量的效果[33]?；旌习l(fā)酵調酸節(jié)約了二次發(fā)酵的時間，降低了細菌性腐敗的風險。

Angel等發(fā)現(xiàn)，粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）和耐熱克魯維酵母連續(xù)接種發(fā)酵體系中，粟酒裂殖酵母利用蘋果酸產生乙醇和二氧化碳，葡萄汁中蘋果酸幾乎完全被消耗，耐熱克魯維酵母發(fā)酵產生乳酸，柔化尖銳的酸味，并且葡萄酒果香更濃郁，乙酸保持在正常范圍內，無需進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵[34]。張亞強等人篩選出一株可高效降解蘋果酸的粟酒裂殖酵母Y1703，其在發(fā)酵過程中降解蘋果酸達96.83%，總酸含量下降30.07%[35]?？唆斁S耐熱酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵可以提高葡萄酒酸度。采用低酸葡萄汁混合發(fā)酵后葡萄酒pH由4降低到3.5，這對氣候炎熱、葡萄酸度不足地區(qū)的葡萄酒生產具有積極作用[36]。

1.2.4 乙醇

目前，降低乙醇含量成為葡萄酒研究的一個目標。由于氣候變暖導致葡萄果實生長期縮短，可溶性固形物積累速度快，發(fā)酵后乙醇含量偏高，許多地區(qū)葡萄酒酒精度時常超過15%[37]。高糖會引起微生物生長受抑制或裂解、酒精發(fā)酵推遲、酒精發(fā)酵副產物甘油和乙酸增加，乙酸可能引起不良風味，較高pH值（4左右）會降低葡萄汁和葡萄酒微生物的穩(wěn)定性[38]，增加酒體變質和感官品質退化的可能性。葡萄酒高乙醇含量降低了對其甜味、酸味的感知，并且不利于香氣的表現(xiàn)[39]；

發(fā)生在酵母細胞內的糖酵解過程是一個由NAD＋/NADH平衡控制的氧化還原反應體系。一般情況下，大部分的NAD＋在3-磷酸甘油醛脫氫過程中被消耗，因此，NADH的大量存在使得糖酵解反應體系還原性增強。而乙醛被還原生成乙醇的反應消耗了NADH，使得氧化還原電位平衡。因此通過改變NAD＋/NADH平衡（消耗NADH）來重新定向反應終點是生物降醇的一種思路[40]。新的反應終點可以是糖酵解中的甘油或風味物質代謝中的風味物質。例如，用耐熱克魯維酵母和釀酒酵母連續(xù)接種混合發(fā)酵在降低乙醇的同時，甘油和丙酮酸含量升高[30]。改變氧化還原電位的方法有：添加代謝物、升溫和利用具有特定代謝特征的酵母菌。代謝物包括糠醛、香草醛、有機酸（肉桂酸、苯甲酸、甲酸、丙酸）、氯化鉀、氯化鈉、二氧化硫和碳酸鈉[41]。

Contreras等對50種不同非釀酒酵母在連續(xù)接種條件下的降醇能力進行了評估。結果發(fā)現(xiàn)，非釀酒酵母Metschnikowia pulcherrima AWRI1149降醇效果最好，分別使‘霞多麗’和‘西拉’葡萄酒的酒度下降了0.9%和1.6%[42]。葡萄汁有孢漢遜酵母、接合酵母（Zygosaccharomyces sapae）、貝利接合酵母和雙孢接合酵母（Zygosaccharomyces bisporus）在純種發(fā)酵‘維蒂奇諾’（Verdicchio）和‘特雷比奧羅’（Trebbiano）葡萄時具有低產乙醇的潛力[43]。仙人掌有孢漢遜酵母（Hanseniaspora opuntiae）和葡萄汁有孢漢遜酵母可用于生產低酒精度的‘長相思’和‘比諾塔吉’（Pinotage）葡萄酒。桿狀假絲酵母（Starmerella bacillaris）和釀酒酵母連續(xù)接種混合發(fā)酵使‘巴貝拉’葡萄酒酒度下降0.7%[44]。

混合發(fā)酵還可以彌補目前生產低醇葡萄酒普遍采用的減少可發(fā)酵糖分、蒸餾脫醇以及添加二氧化硫終止發(fā)酵造成的香氣成分損失[45]。

1.3 花色苷

紅葡萄酒中主要的呈色化合物是花色苷。但花色苷結構易受環(huán)境因素影響而破壞。因此，提高葡萄酒中總花色苷或穩(wěn)態(tài)花色苷（聚合色素）含量，避免穩(wěn)定的花色苷衍生物破壞是改善葡萄酒顏色和護色的目標。

首先，非釀酒酵母產生的果膠酶有利于花色苷在浸漬階段從葡萄皮中浸出進入發(fā)酵液，提高發(fā)酵液中花色苷含量，并有助于澄清和過濾過程的進行。假絲酵母、隱球酵母、克魯維酵母和紅酵母都可以產生果膠酶[23]。其次，酵母菌能夠通過改變色度和色調直接或間接地影響葡萄酒顏色，包括但不限于以下三種方式：第一，增加花色苷修飾物乙烯基苯酚、乙醛和丙酮酸和羥基肉桂酸等物質的產量形成更多的穩(wěn)態(tài)葡萄酒色素[46]。第二，通過有機酸代謝降低pH，增強花色苷的呈色性[47]。如耐熱克魯維酵母代謝產的乳酸降低了pH值，起到護色的作用[48]。丙酮酸和乙醛與二甲花翠素-3-O-葡萄糖分別相互作用生成vitisin A和vitisin B[49]。這種花色苷衍生物抗氧化活性強，陳釀過程中不易分解，對SO2和pH變化穩(wěn)定性強[50]。vitisins呈橙紅色調，使酒體色澤呈現(xiàn)磚紅色[51]。研究表明，混合發(fā)酵能夠有效促進丙酮酸和乙醛量的增加[52]，從而使vitisins含量增加，起到改善葡萄酒顏色的作用。研究發(fā)現(xiàn)，裂殖酵母具有較強的產丙酮酸能力[53]，粟酒裂殖酵母和耐熱克魯維酵母連續(xù)接種發(fā)酵比釀酒酵母發(fā)酵產生更多vitisins A[54]。第三，部分β-葡萄糖苷酶會水解花色苷的糖苷鍵釋放游離的花色苷分子，并迅速降解，其呈色結構破壞后導致葡萄酒紅綠色調變弱[55]。不同菌株產生的β-葡萄糖苷酶對花色苷的降解作用不同，阿薩絲孢酵母（Trichosporon asahii）產生的β-葡萄糖苷酶對花翠素-3-葡萄糖苷具有明顯的降解作用[56]，而有研究者將有β-葡萄糖苷酶活性的釀酒酵母用于發(fā)酵‘桑嬌維賽’葡萄汁時，葡萄酒顏色并未發(fā)生不良變化。β-葡萄糖苷酶對花色苷降解作用的差異可能與底物結構特征和β-葡萄糖苷酶的性質有關[57]。羥基肉桂酸脫羧酶能促進乙烯基苯酚類吡喃花色苷的形成，季也蒙畢赤酵母和裂殖酵母均具有較高的該酶活性[58-59]。

此外，甘露糖蛋白這種大分子膠體通過空間位阻穩(wěn)定作用，減少單寧和花色苷聚集沉淀，增強葡萄酒顏色穩(wěn)定性[60]。Valerie等研究從葡萄酒中提取到的6種多糖物質對單寧聚集的影響，發(fā)現(xiàn)只有甘露糖蛋白能顯著降低單寧聚合形成的膠體顆粒的大小[61]。Alcalde等通過對葡萄酒色素成分分析發(fā)現(xiàn)，添加甘露糖蛋白能降低冷處理后葡萄酒中的花色苷衍生物（黃烷醇-花色苷復合物、vitisin A）的損失[62]。

表1列出了一些非釀酒酵母對葡萄酒釀酒質量參數(shù)的改善作用，幾種非釀酒酵母已存在商業(yè)化產品[63]。

2 混合發(fā)酵動力學研究和混合發(fā)酵條件選擇

混合發(fā)酵動力學是研究在同一發(fā)酵環(huán)境中多菌種的動態(tài)發(fā)酵活動。非釀酒酵母菌種實際應用時是否能順利完成酒精發(fā)酵達到預期要求，需要混合發(fā)酵動力學指標來評估。除此之外，混合發(fā)酵條件的選擇需要在充分了解不同酵母菌代謝活動過程后進行。

2.1 混合發(fā)酵動力學研究

葡萄酒酒精發(fā)酵期間酵母菌生長遵循“S”形生長曲線，單獨發(fā)酵時，酵母菌在第3～5天進入生長穩(wěn)定期，細胞數(shù)可達108cfu/mL左右[64]。非釀酒酵母和釀酒酵母同時接種條件下，酵母之間存在明顯的競爭關系[65]。酵母菌的總生長量一致或高于釀酒酵母純培養(yǎng)的生長量的情況都有出現(xiàn)[66]。

有孢漢遜酵母和釀酒酵母以相同的比例同時接種進行混合發(fā)酵時，釀酒酵母的生長曲線與純發(fā)酵接近，釀酒酵母的生長未受到混合發(fā)酵的影響[67]。而李婷等利用畢赤酵母與釀酒酵母等比例接種的混合發(fā)酵過程中，釀酒酵母數(shù)量低于其純種發(fā)酵時的數(shù)量[68]。隨著畢赤酵母接種比例提高，其對釀酒酵母的影響愈發(fā)顯著。表現(xiàn)為釀酒酵母達到穩(wěn)定期時間推遲且細胞數(shù)降低[69]。

Viana等發(fā)現(xiàn)，混合發(fā)酵條件下發(fā)酵前期葡萄糖消耗速率降低，并且葡萄糖消耗速率下降程度與非釀酒酵母接種比例成呈負相關。嗜高滲漢遜酵母和釀酒酵母接種比例為75∶25和90∶10的混合發(fā)酵條件分別使葡萄糖消耗速率下降了10%～20%和20%～30%[70]。然而葡萄糖消耗速率下降不改變釀酒酵母在葡萄汁中的生長優(yōu)勢，非釀酒酵母通常存在于發(fā)酵初期階段[71]。發(fā)酵結束時非釀酒酵母的數(shù)量取決于其對乙醇的耐受性，不同非釀酒酵母的乙醇耐受性存在差異。如荊雄等發(fā)現(xiàn)，檸檬形克勒克酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵，在發(fā)酵結束時其幾乎全部衰亡，而東方伊薩酵母混合發(fā)酵時，其細胞濃度在發(fā)酵結束時仍保持在105cfu/mL[72]。說明東方伊薩酵母對乙醇的耐受性高于檸檬形克勒克酵母。

表1 非釀酒酵母品種對葡萄酒釀酒質量參數(shù)的影響Table 1 Influence of non-Saccharomyces species on winemaking quality parameters

2.2 混合發(fā)酵接種方式

混合發(fā)酵的接種方式有同時接種和連續(xù)（順序）接種。同時接種混合發(fā)酵條件下，非釀酒酵母對于酵母菌生長動力學的影響和其細胞濃度、存活的時間和其生長代謝特性有關。釀酒酵母和非釀酒酵母的生長都有可能受到具有競爭優(yōu)勢一方的抑制。例如，Renault等對比分析了連續(xù)接種和同時接種發(fā)酵葡萄酒中的酯類物質發(fā)現(xiàn)，丙酸乙酯、異丁酸乙酯和二氫肉桂酸乙酯水平與非釀酒酵母戴爾凱氏有孢圓酵母的生長狀況（最大菌數(shù)水平）直接相關，被視為非釀酒酵母的活動標記物，與連續(xù)發(fā)酵相比，同時接種發(fā)酵降低了這類物質的產生[9]。而有些非釀酒酵母在混合發(fā)酵競爭時處于優(yōu)勢地位。例如畢赤酵母對極端環(huán)境條件有更高的耐受性，比釀酒酵母具有更強的競爭優(yōu)勢[73]，在同時接種條件下，往往使釀酒酵母的生長受到抑制。

同時接種增強了非釀酒酵母和釀酒酵母之間的相互作用，這種相互作用可能會引發(fā)酶類和揮發(fā)性物質的產量提升。李婷等發(fā)現(xiàn)，同時接種比提前接種的發(fā)酵體系中有更高的酯酶活性積累量[66]。在Renault的同一研究中，同時接種發(fā)酵條件下產生了更多乙酸異丁酯和乙酸異戊酯，賦予葡萄酒水果香氣[9]。Philippe等發(fā)現(xiàn)，乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、丁酸乙酯和癸酸乙酯產量和釀酒酵母的最大菌數(shù)在同時接種發(fā)酵條件下顯著高于順序接種[16]。

提前接種酵母菌有利于其在發(fā)酵前期有更高的代謝表達量[74]，提前接種非釀酒酵母有利于非釀酒酵母與香氣代謝有關的酶類積累，避免釀酒酵母受到過分抑制。因此，提前接種非釀酒酵母進行連續(xù)混合發(fā)酵是一種常見的接種策略。由于酵母菌對氨基酸的利用存在偏好性，氮源不足會成為后接種酵母菌不能良好繁殖的主要原因[75]。王星晨在上述同一研究中發(fā)現(xiàn)，在提前接種條件下，有孢漢遜酵母的最高細胞濃度高于同時接種，發(fā)酵后期的衰減速率也更低[67]，提前接種延緩了非釀酒酵母衰亡的速度。在實際生產中，釀酒師會根據(jù)葡萄酒的風格特點選擇合適的非釀酒酵母以及接種方式。

2.3 混合發(fā)酵接種比例和數(shù)量

對于多菌種發(fā)酵體系來說，由于有限營養(yǎng)資源的競爭和相互抑制的關系更為復雜，非釀酒酵母和釀酒酵母的接種比例以及酵母菌數(shù)量對葡萄酒或培養(yǎng)物的風味香氣特征的影響并未出現(xiàn)簡單的放大和疊加效應，而是酵母生長量、存活時間和生長代謝特性的綜合性體現(xiàn)。

酵母菌接種比例對葡萄酒風格特點有調節(jié)作用。Lee等[76]研究發(fā)現(xiàn)，接種比例是混合發(fā)酵調節(jié)木瓜酒風味的重要因素，土星擬威爾酵母（Williopsis saturnus）與釀酒酵母10∶1接種增加了木瓜酒中乙酸酯的相對含量，1∶1和1∶10接種則使乙醇酯、高級醇和2-乙酸苯乙酯含量增加。王倩倩等利用畢赤酵母進行混合發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，較高比例同時接種畢赤酵母與釀酒酵母（1∶1、4∶1、10∶1）混合發(fā)酵條件下[77]對促進‘愛格麗’干白葡萄酒中乙酸異戊酯、高級脂肪酸及其酯類、異戊醇和苯乙醇的生成更加有利，不同接種比例間葡萄酒呈現(xiàn)出不同的風格，4∶1接種葡萄酒的花香特征明顯，1∶1接種葡萄酒的柑橘類香氣突出。

混合發(fā)酵的發(fā)酵劑是由一種或多種非釀酒酵母以合理比例混合作為復合發(fā)酵劑與釀酒酵母共同組成。白夢洋[78]發(fā)現(xiàn)釀酒酵母、畢赤酵母和東方伊薩酵母三者混合發(fā)酵時，畢赤酵母在競爭中處于優(yōu)勢地位，對釀酒酵母的抑制作用非常明顯，因此發(fā)酵后主要由釀酒酵母產生的醇類物質相對含量下降；酯類相對含量顯著增加，均高于純種發(fā)酵或兩兩混合發(fā)酵。李藝凡[79]等利用3種非釀酒酵母H8、全美梅氏酵母、葡萄有孢漢生酵母作為混合發(fā)酵劑與釀酒酵母混合發(fā)酵時發(fā)現(xiàn)，葡萄酒中存在某些獨有的揮發(fā)性化合物如薄荷醇、苯乙醇、檸檬烯、十一醛和肉豆蔻醛，且其在感官評價中香氣濃郁度、酸甜協(xié)調性和酒體均優(yōu)于釀酒酵母純種發(fā)酵。

3 菌種相互作用機制

混合發(fā)酵過程存在微生物相互作用。大量研究表明，非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵與單菌株發(fā)酵之間代謝活動存在差異?；旌习l(fā)酵中存在或缺失不同于純種發(fā)酵的菌株特異性組分。在‘長相思’葡萄汁中混合培養(yǎng)光滑念珠菌和畢赤酵母，經過65代繁殖，混合發(fā)酵條件下的菌株已經顯示出可遺傳的生長代謝差異，這種微生物相互作用被稱為共同進化，共同進化對于優(yōu)化酵母菌的發(fā)酵特性具有一定意義[80]。

釀酒酵母和非釀酒菌種之間的相互作用表現(xiàn)為協(xié)同、競爭或拮抗關系，其機制可以描述為：（1）代謝物（乙醛、乙偶姻、葡萄糖、果糖等）的補充消耗或交換，表現(xiàn)出協(xié)同效應；（2）營養(yǎng)資源（氧氣、維生素、礦物質、碳源、氮源）的競爭；（3）具有拮抗作用的物質（乙醇、乙酸、乳酸、中鏈脂肪酸、嗜殺因子、抗菌肽）的分泌引起其他微生物代謝水平降低或死亡[81]；（4）細胞膜（壁）成分介導的或代謝物介導的細胞直接接觸共聚合，結果是細胞的生存能力提高或誘導細胞死亡。

劉茜等發(fā)現(xiàn)釀酒酵母和東方伊薩酵母對乙酸和乳酸的代謝差異是混合培養(yǎng)中釀酒酵母的生長受到抑制造成。乙酸和乳酸對酵母菌生長都有不同程度的抑制作用，東方伊薩酵母可以代謝消耗釀酒酵母產生的乙酸而釀酒酵母不能消耗前者產生的乳酸[82]；Yamaoka發(fā)現(xiàn)乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）代謝產生的甘油、丙氨酸等物質可以改變釀酒酵母細胞內氨基酸水平，延長其細胞生命周期[83]。

蛋白質代謝物（嗜殺因子、抗菌肽）的產生對混合發(fā)酵中酵母菌種的生長和優(yōu)勢地位的確立有著顯著的影響。嗜殺因子與酵母菌細胞壁受體和細胞膜受體結合，通過破壞細胞壁受體和細胞膜通透性、阻礙DNA合成等機制誘導細胞死亡[84]。非釀酒酵母比釀酒酵母具有更廣譜的嗜殺能力，利用這一特點可對葡萄汁中有孢漢遜酵母、酒香酵母、德克酵母等破壞性酵母增殖進行控制[85]。陳玉茜利用原生質體融合技術進行釀酒酵母的選育，發(fā)現(xiàn)融合子具有更加廣譜的抗菌能力[84]。Branco等發(fā)現(xiàn)釀酒酵母在酒精發(fā)酵時分泌的抗菌肽對某些非釀酒酵母菌（如布魯塞爾德克酵母）和細菌（酒球菌）有抑制作用，這些抗菌肽與釀酒酵母中的3-磷酸甘油醛脫氫酶蛋白片段有一致性[86]。

4 展望

首先，混合發(fā)酵涉及到眾多的非釀酒酵母，這些非釀酒酵母往往來源于自然環(huán)境，非釀酒酵母的分離鑒定、選育到實際應用面臨許多困難。商業(yè)化生產的非釀酒酵母需要具備耐受性強且發(fā)酵特性良好的特點。其次，在微生物變量更加復雜的情況下，酵母菌的代謝活動、相互作用和混合發(fā)酵動力學變化規(guī)律還未研究清楚。另外，為了實現(xiàn)混合發(fā)酵的實際應用，混合發(fā)酵條件的控制需要精細到具體的釀造工藝環(huán)節(jié)，考慮到營養(yǎng)環(huán)境變化對混合發(fā)酵效果的影響，進行中型、大型混合發(fā)酵葡萄酒生產試驗十分必要。最后，在基因組和轉錄組學層面研究酵母菌種群結構、非釀酒酵母釀造特性、多菌種相互作用機制是從根本上認識和調控混合發(fā)酵葡萄酒品質的基礎，目前逐漸成為研究熱點。