G C指紋圖譜結合多元統計分析篩選基酒評級關鍵化合物

許 濤，劉青茹，鄭 蕾，劉光錢，張 芮，王松濤，沈才洪，張曉娟

（1.瀘州品創(chuàng)科技有限公司，四川瀘州 646000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000；3.江南大學生物工程學院，江蘇無錫 214000）

瀘（濃香）型大曲酒是多菌種固態(tài)發(fā)酵生產、酒醅蒸餾、分段摘酒等系列工序嚴格配合所得[1-2]。雖然基礎酒所用釀造原料和生產工藝大致相同，但固態(tài)發(fā)酵影響因素眾多[3-5]，每窖甚至每甑所產的基礎酒在感官、風格特征方面存在一定差異[6]。因此，依據等級、風格等對其進行定級分類對于后續(xù)酒體設計和產品生產至關重要。然而，目前分類定級仍多采用傳統感官評定的方式，按照評判標準以色、香、味、格進行綜合評價。

白酒中1 %～3 %的微量成分主要包括醇類、酸類、酯類、醛酮類化合物等[7]，它們的組合決定了酒體的風格和品質[8-11]，例如，醇類主要表現出柔和的刺激感和微甜、濃厚的感覺，有時也會賦予酒體一定苦味；酯類是含量最多的一類，主要表現為微甜、略帶澀味，并有一定刺激感，有些表現出苦味，瀘型酒中酯類主要是乙酯類物質，大多表現為水果的芳香；酸類是重要的呈味物質，有促進新酒老熟，增長后味、消除苦味、雜味和抑制掩蔽香氣的作用；醛酮類主要賦予酒體刺激感或辛辣感，同時也有促香或提香效應。因此，通過氣相色譜（GC）采集基礎酒中呈香呈味物質的組成與含量特征，以其指紋圖譜結合多元統計分析能夠從數字化信息層面為基礎酒定級分類提供科學支撐[12-14]。此外，此方法標準化程度高、信息豐富、便于推廣和應用。

本試驗以專業(yè)的傳統感官評定方式為分類定級參照，通過氣相色譜法采集六類新收儲濃香型白酒基酒的色譜數據，按保留時間一致的原則進行共有峰匹配后利用中位數法構建了6類不同等級濃香型白酒基酒的標準指紋圖譜。利用偏最小二乘法-判別法（PLS-DA）建模，分析影響基礎酒分類定級的因素。以探討基礎酒中揮發(fā)性組分對目前基礎酒定級體系的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：樣品為瀘州老窖每日收儲的新基礎酒。共計36個酒樣。所取酒樣均由專業(yè)的品評人員進行感官評定。定量分析時，以無水乙醇配制含2 %vol叔戊醇、2 %vol乙酸正戊酯與2 %vol 2-乙基正丁酸的3種內標混合液，然后按照定容體積10 mL酒樣，添加0.1 mL內標液混勻即可供進樣。

儀器設備：便攜式酒度計，Agilent 6890 GC儀，FID檢測器；數據處理采用Agilent 6890工作站；檢測器與進樣口的溫度均為250 ℃。Agilent 5975I GC-MS，EI源，離子源溫度180 ℃，接口溫度200 ℃，電離電壓70 eV。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

根據文獻修改[8]，色譜柱為DB-Wax毛細管柱，柱長60 m，內徑0.25μm。升溫程序：初始柱溫為30 ℃，保持6 min，以2.5 ℃/min升溫至40 ℃，再以5 ℃/min升溫至100 ℃，然后以10 ℃/min升溫至200 ℃，再以20 ℃/min升溫至220 ℃，保持10 min。載氣為高純氮氣，流速為1.6 mL/min。進樣口溫度為230 ℃，采用分流模式進樣，分流比為40∶1。檢測器為FID檢測器，溫度為250 ℃。進樣量為1 μL。

1.2.2 感官評定

3名省級嘗評員進行品評定級，將36個樣品分為6個等級。本實驗對6類酒樣的感官等級優(yōu)劣次序依次為：I類（A）、II類（B）、III類（C）、IV類（D）、V類（E）、VI類（G）。為便于PLS-DA分析，本實驗人工設置I類（A）=100～96分、II類（B）=95～91分、III類（C）=90～86分、IV類（D）=85～81分、V類（E）=80～76分、VI類（G）＜75分。

1.2.3 揮發(fā)性組分均值

采用共有模式圖譜[16]，中位數矢量法算法[17]，公式如下：

中位數矢量=median(X1j，X2j，……Xij，……Xnj)

式中，Xij為當第i個樣品的保留時間為j時的峰面積。

2 結果與討論

2.1 各類基礎酒酒精度

通過感官分析，對樣品進行了等級分類，得到了不同類別的基酒。這些基酒具有各自的不同風格，I類與II類主要風格特點為濃香和窖香好，III類與IV類主要為香味淡、味偏短澀，而V類與VI類以糧香好、味嫩雜為主要風格特點[15]，對不同類別基酒的感官品評標準見表1。

表1 各類基礎酒的感官品評語

6類不同類別基礎酒的酒精度見表2。從I類至VI類基礎酒酒精度有逐漸下降的趨勢。I類基礎酒酒精度最高在66 %vol～68 %vol之間。VI類基礎酒酒精度最低在60%vol～62%vol之間。與先前研究結果[15]高度一致，生產具有良好的穩(wěn)定性。

表2 各類別基礎酒平均酒精度

2.2 各類別基礎酒物質組成類別分析

2.2.1 各類物質總含量分析

糟醅在窖池的發(fā)酵過程不僅是產酒更是產酯生香的過程，發(fā)酵過程中產生的醇、酸、酯等化合物之間相互作用此消彼長最終達到動態(tài)平衡[18]。如圖1(a)、(b)所示，隨基礎酒等級降低，其總酸、總酯含量均整體呈現下降趨勢，其中第IV類基礎酒酸類物質略有回升，而酯類物質驟降。從圖1(c)可以看出，第V類基礎酒醇類物質含量最高，第IV類基礎酒醇類物質含量最低。醇類物質總含量在6類基礎酒中從I類基礎酒至IV類基礎酒逐漸下降，V類和VI類基礎酒醇類物質含量相對于I類至IV類基礎酒略高。第IV類基礎酒的酸醇酯總量最低，除第IV類基礎酒外，隨著基礎酒類別的降低其中酸醇酯的總量呈逐步減少趨勢。I類至III類基礎酒等級越高，其物質組成越豐富；但等級降至第IV類基礎酒之后，物質組成的豐富度并未與等級高低呈線性相關。

圖1 濃香型白酒不同類別基礎酒各類物質總含量

計算各類物質在酸醇酯總量中的占比可知（圖2），隨基礎酒等級降低，酸類物質占比降低，醇類、酯類物質占比增加。結合圖3醇類物質的含量熱圖可知，第V類、第IV類基礎酒中雜醇油含量顯著增加。雜醇油既是白酒中醇甜和助香的主要物質，又是形成香味物質的前體，但除了正己醇、庚醇和苯乙醇微甜外，其余均呈苦味或澀味，含量過多不僅會使酒的感官呈辣、苦、澀味，影響酒的口感，而且對人體有毒害作用[19]。酸、酯占比降低，雜醇油占比增加影響基礎酒口感，導致其評級較低。

圖2 濃香型白酒不同類別基礎酒各類物質占比

圖3 濃香型白酒不同類別基礎酒醇類含量

2.2.2 四大酯含量分析

己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯是濃香型白酒中的四大主要酯類物質，四大酯類化合物之間的比例決定著白酒的所屬風格。

因此，研究四大酯類物質在6類基礎酒中的含量可知（圖4(a)），I—IV類基礎酒中，己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯的含量均隨著等級降低而降低；第V類和第VI類中三者含量也隨等級降低而降低，但均高于第IV類。乳酸乙酯含量隨基礎酒等級的降低呈現先增后降再增再降的波動式變化。計算各組分占四大酯總量的百分比（圖4(b)）發(fā)現，隨著基礎酒等級的降低，己酸乙酯呈降低趨勢，乳酸乙酯呈增加趨勢，乙酸乙酯和丁酸乙酯變化不顯著。

圖4 濃香型白酒不同類別基礎酒四大酯含量及其占比

綜上所述，己酸乙酯和乳酸乙酯在四大酯總量中的比例（y）可作為基礎酒等級(x：1，2，3，4，5，6)評定的參考指標，其線性擬合方程如表3所示。

表3 己酸乙酯和乳酸乙酯在四大酯總量中的占比與基礎酒等級的線性關系

2.3 各類別基礎酒酒樣等級與揮發(fā)性組分相關性判斷

基礎酒酒樣色譜分析共測得66個組分，結果見表4。對基礎酒人工嘗評分類和基礎酒揮發(fā)性組分數據（表4）進行PLS-DA相關性判別分析，篩選出38個變量（VIP＞0.5）分別是：2-丁醇，甲醇，糠醇，正丙醇，正丁醇，丙酸，丁酸，己酸，壬酸，戊酸，辛酸，乙酸，異丁酸，異戊酸，丙酸乙酯，丁二酸二乙酯，丁酸乙酯，庚酸乙酯，己酸乙酯，己酸異戊酯，甲酸乙酯，癸酸乙酯，肉豆蔻酸乙酯，乳酸乙酯，戊酸乙酯，辛酸乙酯，乙酸乙酯，異丁酸乙酯，糠醛，2-丁酮，2-戊酮，3-羥基-2-丁酮，甲基異丁基酮，總酸，總酯，總酮和總醇（不含乙醇）。將6類基礎酒與38個變量進行PLS建模，通過PLS回歸分析建立的基礎酒分級與揮發(fā)性組分的相關性模型，分類變量的模型預測值與實測值的相關系數均達到了94.8 %（Comp1+Comp2+Comp3），說明模型的擬合性較好。同樣模型對組內數據預測準確率達到98.5 %（Comp1+Comp2+Comp3）（表5），說明模型的建立是合理的并且具有很高的精度。

表4 基礎酒酒樣主要揮發(fā)性物質(醇類)色譜分析結果 (mg/L)

續(xù)表4(一) 基礎酒酒樣主要揮發(fā)性物質(酸類)色譜分析結果 (mg/L)

續(xù)表4(二) 基礎酒酒樣主要揮發(fā)性物質(酯類)色譜分析結果 (mg/L)

由PLS-DA判別結果可以看到，向量（comp1/comp2）可以解釋基礎酒定級與揮發(fā)性組分的相關性為89.5%。其中總酸、總酯和除乳酸乙酯以外的其余乙酯類化合物對基礎酒定級呈正相關性。而乳酸乙酯，總酮，醇類中雜醇油總含量和糠醛等對酒的質量呈負相關性。丁酸、戊酸、辛酸等酸類物質對基礎酒中的II、III、IV 3類有較大影響。通過該方法可以有效的把不同類別基礎酒區(qū)分為I類，IIIIIIV類，VVI類3個聚類。

續(xù)表4(三) 基礎酒酒樣主要揮發(fā)性物質(醛酮類)色譜分析結果 (mg/L)

續(xù)表4(四) 基礎酒酒樣主要揮發(fā)性物質(烷烴、呋喃類)色譜分析結果 (mg/L)

表5 PLS模型擬合效果參數

圖5 1向量、2向量（comp1/comp2）上不同級別基礎酒與變量的PLS分析

3 結論

通過對濃香型白酒6種不同類別的基礎酒中的揮發(fā)性化合物進行檢測，其酒精度在60 %vol～68 %vol范圍內，酸類、酯類、醇類物質總含量分別為0.8～1.5 g/L、4～12 g/L和0.15～0.5 g/L。隨著基礎酒等級降低，酒精度、總酸、總酯含量均呈現下降趨勢，其中第IV類基礎酒酸類物質略有回升、而酯類物質驟降。I類至III類基礎酒等級越高，其物質組成越豐富。酸、酯占比降低，雜醇油占比增加影響基礎酒口感，導致其評級較低。其中，四大酯含量與基礎酒等級存在較大相關性，己酸乙酯和乳酸乙酯在四大酯總量中的比例可作為基礎酒等級評定的參考指標，兩者的線性方程擬合度好，R2分別為0.9374和0.9905。

圖6 1向量、3向量（comp1/comp3）上不同級別基礎酒與變量的PLS分析

PLS-DA判別和PLS回歸分析方法應用于基礎酒等級評定具有良好的模型擬合度（R2=94.8%）和預測精確度（準確率=98.5%），篩選出38個與基礎酒等級相關性較高的成分。此方法便于采集基礎酒指紋圖譜，且能夠聚焦關鍵化合物，所采用的多元統計分析方法便于推廣，對于其他白酒產品等級分類具有較好的借鑒意義。