γ-氨基丁酸對(duì)熱應(yīng)激雛雞胰腺組織結(jié)構(gòu)、抗氧化能力、消化酶活性及細(xì)胞凋亡的影響

溫 靜 余哲琪 田佳迎 陳 忠

(海南師范大學(xué)熱帶島嶼生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571158)

近年來(lái)，由于畜牧業(yè)生產(chǎn)的集約化發(fā)展，熱應(yīng)激對(duì)畜禽造成的影響越來(lái)越嚴(yán)重[1]。熱應(yīng)激影響著家禽生產(chǎn)力的諸多方面，如導(dǎo)致肉禽生產(chǎn)性能下降[2]、繁殖能力降低[3]，同時(shí)阻礙家禽的法氏囊等免疫器官的發(fā)育，降低抗氧化能力，提高細(xì)胞凋亡率[4]；熱應(yīng)激還會(huì)引起雛雞小腸黏膜的抗氧化功能明顯損傷[5]，并且顯著降低消化酶的活性，從而導(dǎo)致腸道吸收功能和免疫屏障嚴(yán)重受損[6]；同時(shí)，熱應(yīng)激也影響家禽腸道中蛋白質(zhì)的利用率以及營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因表達(dá)，甚至增加家禽的死亡率[7-8]。因此，高溫環(huán)境導(dǎo)致的熱應(yīng)激問(wèn)題使家禽業(yè)的發(fā)展面臨著巨大的挑戰(zhàn)[9]。胰腺是家禽重要的代謝器官和消化器官，在胰液的分泌、消化酶的合成以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝等方面具有十分重要的作用。消化酶活性是反映機(jī)體消化生理機(jī)能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，消化酶活性的高低反映了動(dòng)物機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化能力，直接影響蛋白質(zhì)、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，最終影響動(dòng)物的生產(chǎn)性能[10-11]。

γ-氨基丁酸(GABA)是一種廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，國(guó)家衛(wèi)生部2009年批準(zhǔn)其用于食品加工?，F(xiàn)在GABA作為一種安全的食品添加劑，廣泛應(yīng)用于食品和畜牧業(yè)，能夠有效減輕熱應(yīng)激對(duì)家畜生理功能的影響，被認(rèn)為是一種安全的飼料添加劑[12-13]。本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)，每天灌喂50 mg/kg GABA可以減緩熱應(yīng)激[(40.0±0.5) ℃]對(duì)雛雞腸道造成的損傷，有效改善熱應(yīng)激雛雞小腸黏膜的免疫功能[14]；另外，將30 mg/kg GABA添加到仔豬飼糧中能夠抑制腸上皮細(xì)胞凋亡，保持腸絨毛的完整性，降低仔豬的腹瀉率[15]。有研究指出，在熱應(yīng)激[(30±2) ℃]蛋鵪鶉的飼糧中添加25 mg/kg GABA可提高蛋鵪鶉的生產(chǎn)性能以及抗氧化能力[16]；而在飼糧中添加5 g/kg谷氨酰胺和100 mg/kg GABA可以提高肉雞在高溫(30～34 ℃)環(huán)境下的抗熱應(yīng)激能力以及血清胰高血糖素、谷氨酸、胰島素含量和肌酸激酶、堿性磷酸酶活性等血清參數(shù)[17]。目前關(guān)于熱應(yīng)激對(duì)雛雞消化系統(tǒng)影響的研究主要集中在腸道方面，而對(duì)胰腺的研究報(bào)道較少。因此，研究熱應(yīng)激對(duì)雛雞胰腺組織結(jié)構(gòu)、生理生化等方面的損傷以及緩解這些損傷的措施至關(guān)重要。因此，本研究擬探討GABA對(duì)熱應(yīng)激雛雞胰腺組織結(jié)構(gòu)、抗氧化能力、消化酶活性及細(xì)胞凋亡情況的影響，明確GABA能否恢復(fù)熱應(yīng)激對(duì)胰腺組織結(jié)構(gòu)、消化酶、抗氧化酶造成的損傷，為GABA在家禽抗熱應(yīng)激領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將240只1日齡健康雄性文昌雞雛雞隨機(jī)分為對(duì)照組(CK組)、熱應(yīng)激組(HS組)、對(duì)照+GABA組(CK+組)，熱應(yīng)激+GABA組(HS+G組)，每組60只(每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只)，稱重和編號(hào)，使雛雞組間體重、采食量無(wú)顯著差異(P>0.05)。所有雛雞均自由采食同一飼糧(市售肉小雞配合飼料，營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1)和飲用蒸餾水。各組雛雞均在常規(guī)條件下飼養(yǎng)6周，每天記錄直腸溫度、采食和飲水情況。從2周齡開(kāi)始，CK組與HS組每日每只灌喂0.2 mL的生理鹽水，CK+G組和HS+G組每日每只灌喂0.2 mL的GABA水溶液(GABA灌喂量為50 mg/kg BW)。每天灌喂2 h后于12:00—14:00對(duì)HS組和HS+G組文昌雞雛雞進(jìn)行熱應(yīng)激，氣候箱設(shè)定溫度在(40.0±0.5)℃、相對(duì)濕度為(70±5)%，同時(shí)將CK組和CK+G組的文昌雞雛雞放于溫度(32.46±0.16) ℃、相對(duì)濕度(70±5)%的氣候箱中，熱應(yīng)激結(jié)束后，再將全部雛雞放回雞籠常規(guī)飼養(yǎng)。

表1 飼糧營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 樣品采集和處理

于2～6周齡末，每組分別取6只文昌雞雛雞，剖取胰腺，去除脂肪稱其鮮重。一部分胰腺組織保存于-80 ℃，以供進(jìn)一步分析；另一部分胰腺組織用Bouin固定液固定，用于制作組織切片。

1.3 胰腺組織結(jié)構(gòu)觀察

將胰腺組織切片常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，隨機(jī)選取3張，用Olympus-BX50F顯微鏡觀察胰腺組織結(jié)構(gòu)，再以YD400C數(shù)字?jǐn)z像系統(tǒng)進(jìn)行拍攝，每張切片拍攝5個(gè)不同視野。

1.4 胰腺組織中抗氧化指標(biāo)測(cè)定

用低溫磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗胰腺組織以除去血液，并用濾紙吸干。以質(zhì)量體積比9∶1的比例添加pH 7.4的PBS，在4 ℃下用研磨儀研磨3 min，直到細(xì)胞完全破碎，液體顏色均勻。隨后，將胰腺組織勻漿在4 ℃下3 000 r/min離心10 min，收集上清液并在-20 ℃下儲(chǔ)存，用以測(cè)定谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 胰腺組織中GSH-Px、SOD mRNA相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

1.5.1 胰腺組織總RNA的提取及濃度檢測(cè)

用電動(dòng)研磨器對(duì)胰腺組織進(jìn)行研磨勻漿，按照總RNA提取試劑盒(貨號(hào)：dp431，天根生化科技有限公司)提取胰腺組織總RNA，通過(guò)超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)量胰腺組織總RNA的濃度和純度。根據(jù)OD260 nm/OD280 nm來(lái)判斷RNA純度，二者比值在1.8～2.0為宜。

1.5.2 cDNA的合成

采用Fast Quantc DNA第1鏈合成試劑盒(貨號(hào)：kr116，天根生化科技有限公司)，于冰上進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄。先配制gDNA去除反應(yīng)體系：取5×gDNA Buffer 2 μL、總RNA 1 μg，用RNase-Free ddH2O補(bǔ)足至10 μL，徹底混勻，短暫離心后置于42 ℃孵育3 min，然后置于冰上；再配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：10×Fast RT Buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 1 μL、FQ-RT Primer Mix 2 μL，用RNase-Free ddH2O補(bǔ)足至10 μL，然后與第1步的gDNA去除反應(yīng)體系(10 μL)混勻，42 ℃孵育15 min后，再于95 ℃孵育3 min，得到的cDNA于-20 ℃低溫保存用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5.3 引物設(shè)計(jì)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件

PCR引物運(yùn)用Primer軟件設(shè)計(jì)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列及參數(shù)見(jiàn)表1。將GSH-Px、SOD引物濃度稀釋至10 μmol/L。以內(nèi)參基因β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)標(biāo)，對(duì)GSH-Px、SODmRNA進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表2 引物信息

1.6 胰腺組織中消化酶活性的測(cè)定

胰腺組織上清液的提取方法同1.4。采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的淀粉酶試劑盒(貨號(hào)：C016-2-1)、脂肪酶試劑盒(貨號(hào)：A054-1-1)和胰蛋白酶試劑盒(貨號(hào)：A080-2-1)測(cè)定相應(yīng)的酶活性，并嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.7 胰腺組織中淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶mRNA相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

胰腺組織總RNA的提取、濃度檢測(cè)及cDNA的合成同1.5。PCR引物運(yùn)用Primer軟件設(shè)計(jì)，引物序列及參數(shù)見(jiàn)表1。將淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶引物濃度分別稀釋至10 μmol/L，以內(nèi)參基因β-actin為內(nèi)標(biāo)，對(duì)淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶mRNA進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.8 胰腺細(xì)胞凋亡及分布密度

采用熒光法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：G002-2-2，南京建成生物工程研究所)對(duì)常規(guī)石蠟切片進(jìn)行處理，每個(gè)樣本選取3張切片，每張切片取5個(gè)視野，經(jīng)YD400C數(shù)字?jǐn)z像系統(tǒng)對(duì)組織切片進(jìn)行拍照處理，運(yùn)用Image-Plus Pro軟件測(cè)量凋亡細(xì)胞數(shù)量及視野面積，通過(guò)(凋亡細(xì)胞數(shù)量/視野面積)得出凋亡細(xì)胞分布密度。

1.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，應(yīng)用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 胰腺組織結(jié)構(gòu)觀察

觀察雛雞胰腺組織結(jié)構(gòu)(圖1)發(fā)現(xiàn)，與CK組比較，HS組雛雞胰腺組織腺泡破壞，紋理紊亂，有的細(xì)胞核固縮，溶解消失，呈現(xiàn)一定的空泡化；而CK+G組雛雞胰腺組織腺泡結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰，無(wú)明顯異常；HS+G組雛雞胰腺組織腺泡結(jié)構(gòu)完整，輪廓較清晰，部分紋理紊亂，胰腺組織結(jié)構(gòu)較正常。

A：CK組；B：CK+G組；C：HS組；D：HS+G組。比例尺為50 μm。5W:5周齡。箭頭所指為發(fā)生病理變化。

2.2 GABA對(duì)熱應(yīng)激雛雞胰腺組織抗氧化能力的影響

如表3所示，在2～6周齡時(shí)，4組雛雞胰腺組織SOD活性均隨著周齡的增長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，HS組雛雞的SOD活性一直為4組中最低水平。在5、6周齡時(shí)，CK+G組和HS+G組的SOD活性高于CK組和HS組(P>0.05)，而在2、4周齡時(shí)，CK組的SOD活性顯著高于HS組(P<0.05)。在2～6周齡時(shí)，HS組雛雞胰腺組織GSH-Px活性隨著周齡的增長(zhǎng)一直為下降趨勢(shì)，CK組和CK+G組則總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在6周齡時(shí)達(dá)到峰值且CK組GSH-Px活性顯著高于HS組(P<0.05)。HS+G組雛雞胰腺組織GSH-Px活性隨著周齡的增長(zhǎng)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，而且在5周齡時(shí)顯著高于HS組(P<0.05)。通過(guò)對(duì)4組雛雞胰腺組織MDA含量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在6周齡時(shí)CK+G組和HS+G組MDA含量顯著低于HS組(P<0.05)。組別對(duì)雛雞胰腺組織SOD和GSH-Px活性有顯著影響(P<0.05)，且周齡與組別間的交互作用對(duì)雛雞胰腺組織MDA含量有顯著影響(P<0.05)。

表3 GABA對(duì)熱應(yīng)激雛雞胰腺組織抗氧化能力的影響

2.3 GABA對(duì)熱應(yīng)激雛雞胰腺組織中SOD、GSH-Px mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

如表4所示，在2～4周齡時(shí)，4組雛雞胰腺組織中SOD mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)，且均隨著周齡的增長(zhǎng)總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。HS組胰腺組織中SODmRNA相對(duì)表達(dá)量在5周齡時(shí)出現(xiàn)峰值，顯著高于CK組和HS+G組(P<0.05)。CK+G組胰腺組織中SODmRNA相對(duì)表達(dá)量在6周齡時(shí)達(dá)到峰值，顯著高于HS組(P<0.05)。在2～6周齡時(shí)，隨著周齡的增長(zhǎng)，CK組和HS+G組胰腺組織中GSH-PxmRNA相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而CK+G組則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且在5周齡時(shí)達(dá)到峰值，顯著高于HS組(P<0.05)。在2周齡時(shí)，HS組胰腺組織中GSH-PxmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于CK組(P<0.05)，但是在6周齡時(shí)，CK組胰腺組織中GSH-PxmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于HS組(P<0.05)。組別僅對(duì)雛雞胰腺組織中SODmRNA相對(duì)表達(dá)量有顯著影響(P<0.05)，而周齡對(duì)雛雞胰腺組織中SODmRNA相對(duì)表達(dá)量有極顯著影響(P<0.01)，對(duì)GSH-PxmRNA相對(duì)表達(dá)量有顯著影響(P<0.05)。

表4 GABA對(duì)熱應(yīng)激雛雞胰腺組織中SOD、GSH-Px mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

2.4 GABA對(duì)熱應(yīng)激雛雞胰腺組織中消化酶活性的影響

如表5所示，在2～6周齡時(shí)，各組雛雞胰腺組織中淀粉酶活性隨著周齡的增長(zhǎng)都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，CK組、CK+G組和HS+G組均在5周齡時(shí)出現(xiàn)峰值，而HS組在3周齡時(shí)出現(xiàn)峰值，且在5周齡時(shí)CK組和CK+G組與HS組具有顯著差異(P<0.05)。在6周齡時(shí)，CK+G組胰腺組織中淀粉酶活性顯著高于HS組(P<0.05)。在2～6周齡時(shí)，隨著周齡的增長(zhǎng)，CK組和HS組胰腺組織中脂肪酶活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而CK+G組和HS+G組則呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在3周齡時(shí)，HS+G組胰腺組織中脂肪酶活性顯著高于CK組(P<0.05)。在5周齡時(shí)，CK+G組胰腺組織中脂肪酶活性顯著高于HS組和HS+G組(P<0.05)，在6周齡時(shí)，胰腺組織中脂肪酶活性在CK組、HS組和CK+G組間均具有顯著差異(P<0.05)，CK+G組顯著高于CK組和HS組(P<0.05)。在2、3周齡時(shí)，4組雛雞胰腺組織中胰蛋白酶活性均較低，但隨著周齡的增長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在4周齡時(shí)，CK+G組和HS+G組胰腺組織中胰蛋白酶活性急劇增加，且CK+G組顯著高于HS組(P<0.05)。周齡、組別對(duì)雛雞胰腺組織中淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性均有極顯著影響(P<0.01)，而兩者間的交互作用僅對(duì)淀粉酶活性有顯著影響(P<0.05)。

表5 GABA對(duì)熱應(yīng)激雛雞胰腺組織消化酶活性的影響

2.5 GABA對(duì)熱應(yīng)激雛雞胰腺組織中淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

如表6所示，在2～6周齡時(shí)，CK+G組胰腺組織中淀粉酶mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于其他3組，但是在2、3周齡時(shí)各組之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，在4周齡時(shí)CK+G組顯著高于其他3組(P<0.05)，在5、6周齡時(shí)CK+G組有下降趨勢(shì)，但仍顯著高于其他3組(P<0.05)。在2～6周齡時(shí)，CK組和HS+G組胰腺組織中脂肪酶mRNA相對(duì)表達(dá)量隨著周齡的增長(zhǎng)均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且HS組雛雞胰腺組織中的脂肪酶mRNA相對(duì)表達(dá)量普遍低于其他3組，僅在3周齡時(shí)接近CK組。在2周齡時(shí)，CK+G組胰腺組織中脂肪酶mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于CK組和HS組(P<0.05)，在5、6周齡時(shí)，相對(duì)于CK組，CK+G組胰腺組織中脂肪酶mRNA相對(duì)表達(dá)量達(dá)到較高水平，且均顯著高于HS組(P<0.05)，但在3周齡時(shí)，HS+G組胰腺組織中脂肪酶mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于CK組(P<0.05)。在2～6周齡時(shí)，CK組、CK+G組和HS+G組雛雞胰腺組織中胰蛋白酶mRNA相對(duì)表達(dá)量隨著周齡的增長(zhǎng)均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而HS組則呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在2、4、5周齡時(shí)，CK+G組胰腺組織中胰蛋白酶mRNA相對(duì)表達(dá)量具有較高水平，均顯著高于HS組(P<0.05)，而且在4周齡時(shí)，CK+G組胰腺組織中胰蛋白酶mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于HS組和HS+G組(P<0.05)。在3周齡時(shí)，HS+G組胰腺組織中胰蛋白酶mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于HS組(P<0.05)。組別對(duì)雛雞胰腺組織中淀粉酶、胰蛋白酶和胰蛋白酶mRNA相對(duì)表達(dá)量均有極顯著影響(P<0.01)，周齡對(duì)淀粉酶和胰蛋白酶mRNA相對(duì)表達(dá)量有極顯著影響(P<0.01)，對(duì)脂肪酶mRNA相對(duì)表達(dá)量有顯著影響(P<0.05)，而兩者間的交互作用僅對(duì)淀粉酶mRNA相對(duì)表達(dá)量有顯著影響(P<0.05)。

表6 GABA對(duì)熱應(yīng)激雛雞胰腺組織中淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

2.6 GABA對(duì)熱應(yīng)激雛雞胰腺組織細(xì)胞凋亡的影響

凋亡細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光，圖2顯示，5周齡CK組雛雞胰腺組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯少于HS組和HS+G組，與HS組比較，HS+G組雛雞胰腺組織凋亡細(xì)胞數(shù)量低于HS組，而CK+G組雛雞胰腺組織凋亡細(xì)胞數(shù)量低于CK組。

A：CK組；B：CK+G組；C：HS組；D：HS+G組。比例尺為50 μm。5W:5周齡。

如表7可知，在2～6周齡時(shí)，CK+G組和HS+G組的凋亡細(xì)胞分布密度隨著周齡的增長(zhǎng)均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在3周齡時(shí)達(dá)到峰值，而HS組則呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在5、6周齡時(shí)，HS組凋亡細(xì)胞分布密度顯著高于其他3組(P<0.05)；在4、6周齡時(shí)，HS+G組凋亡細(xì)胞分布密度下降，且與CK組差異不顯著(P>0.05)。組別對(duì)雛雞胰腺組織中凋亡細(xì)胞分布密度有極顯著影響(P<0.01)，且組別與周齡間的交互作用對(duì)其有顯著影響(P<0.05)。

表7 GABA對(duì)熱應(yīng)激雛雞胰腺組織凋亡細(xì)胞分布密度的影響

3 討 論

有研究表明，與正常對(duì)照組小鼠相比，熱應(yīng)激小鼠的胰腺重量和系數(shù)略有降低，表明熱應(yīng)激可能損傷了小鼠的胰腺組織結(jié)構(gòu)與功能[18]。在生長(zhǎng)初期，雛雞需要較高的溫度來(lái)維持其生長(zhǎng)發(fā)育[19]，因此，早期熱應(yīng)激對(duì)雛雞胰腺組織的影響并不大。然而在熱應(yīng)激后期，雛雞胰腺組織出現(xiàn)結(jié)構(gòu)紊亂，組織損傷嚴(yán)重。GABA處理則使熱應(yīng)激雛雞胰腺組織結(jié)構(gòu)的完整性接近CK組，表明GABA能夠減輕熱應(yīng)激對(duì)雛雞胰腺組織結(jié)構(gòu)的損傷，維持胰腺組織結(jié)構(gòu)發(fā)育接近正常水平。

本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，4組雛雞胰腺組織中SOD活性僅在2、6周齡時(shí)具有顯著差異，在6周齡時(shí)HS組、HS+G組和CK+G組均高于CK組，這可能是由于HS組和HS+G組的雛雞胰腺受到長(zhǎng)期熱攻擊，使得胰腺組織細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)過(guò)量產(chǎn)生，而為了維持胰腺組織內(nèi)的氧化-抗氧化平衡，機(jī)體通過(guò)代償機(jī)制上調(diào)SOD活性維持氧化-抗氧化平衡，而CK+G組可能是由于GABA的長(zhǎng)期添加，GABA促使SOD基因表達(dá)上調(diào)，從而增加雛雞胰腺組織的抗氧化能力。雛雞胰腺組織中SODmRNA相對(duì)表達(dá)量在5、6周齡時(shí)具有顯著差異，在5周齡時(shí)，HS組胰腺組織中SODmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于CK組，HS+G組胰腺組織中SODmRNA相對(duì)表達(dá)量高于CK組，也是機(jī)體通過(guò)代償機(jī)制增強(qiáng)胰腺組織的抗氧化能力。在6周齡時(shí)，由于GABA的長(zhǎng)期添加，CK+G組胰腺組織中SODmRNA相對(duì)表達(dá)量較HS組顯著上調(diào)，增強(qiáng)了胰腺組織的抗氧化能力。Zhang等[20]的試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧中添加50 mg/kg GABA能提高羅馬母雞血清胰島素水平，免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)和補(bǔ)體3(C3)含量，使抗氧化能力和免疫功能得到增強(qiáng)，從而提高母雞的生產(chǎn)性能。在2～6周齡期間，僅在5周齡時(shí)HS+G組雛雞胰腺組織中GSH-Px活性高于其他3組。胰腺組織中的抗氧化系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，抗氧化系統(tǒng)中SOD和GSH-Px的活性不能同時(shí)升高，一種機(jī)制的激活和另一種機(jī)制的相應(yīng)抑制可能就是體內(nèi)的自我保護(hù)機(jī)制。然而，這種可能的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究和證實(shí)。而在5周齡時(shí)CK+G組胰腺組織中GSH-PxmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于HS組，可能是由于GABA代謝產(chǎn)生了大量谷氨酸[21]。谷氨酸是合成GSH-Px的關(guān)鍵元素，能夠維持體內(nèi)GSH-Px活性的保持在一定水平。另外，在5周齡時(shí)，HS組和HS+G組胰腺組織中MDA含量高于CK組，這表明由于胰腺組織受到累積熱應(yīng)激的攻擊，使得胰腺細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)多的MDA，而此時(shí)GABA發(fā)揮清除胰腺組織中MDA的能力不足。在6周齡時(shí)，CK+G組和HS+G組胰腺組織中MDA含量低于HS組和CK組，證明GABA在6周齡起到了清除胰腺組織中MDA的作用，這可能是由于投喂的GABA是間接作用于胰腺組織，使其SODmRNA相對(duì)表達(dá)量在6周齡處于較高水平，因此，GABA能夠顯著提高機(jī)體的抗氧化能力。

Wang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加50 mg/kg GABA可以明顯提高奶牛的采食量，并可提高奶牛的泌乳量，且具有劑量效應(yīng)。有研究報(bào)道，35～36 ℃高溫條件下在飼糧中添加50～100 mg/kg GABA有助于雞對(duì)高溫環(huán)境的適應(yīng)，提高產(chǎn)蛋性能[23-24]。蔣磊等[25]的研究表明，32 ℃高溫處理顯著降低了肉雞十二指腸中胰蛋白酶、脂肪酶及淀粉酶活性。阮暉等[26]報(bào)道，在34.7 ℃熱應(yīng)激條件下，肉雞小腸內(nèi)總蛋白水解酶、脂肪酶和淀粉酶活性均顯著下降，且肉雞日增重與這幾種酶的活性呈極顯著正相關(guān)，并通過(guò)配對(duì)試驗(yàn)證明上述酶活性的降低并非由采食量下降所致，而是高溫環(huán)境直接作用的結(jié)果。在目前的研究中，36 ℃高溫處理后肉雞空腸脂肪酶和胰蛋白酶活性顯著降低[27]。本研究則發(fā)現(xiàn)，在3～6周齡，HS組雛雞胰腺組織中3種消化酶活性都低于其他3組，這一結(jié)果可能是因?yàn)闊釕?yīng)激導(dǎo)致交感神經(jīng)興奮，引起血管收縮，減少胰腺的血流量，使胰液的分泌減少，從而各個(gè)消化酶的分泌量減少；而在6周齡時(shí)，CK+G組和HS+G組雛雞胰腺組織中淀粉酶和胰蛋白酶活性高于CK組，說(shuō)明GABA的添加可以增強(qiáng)胰腺組織中消化酶的活性。另外，在3周齡時(shí)，HS組雛雞胰腺組織中淀粉酶和蛋白酶mRNA相對(duì)表達(dá)量高于CK組，這是由于雛雞處于快速生長(zhǎng)期，組織通過(guò)代償功能來(lái)緩解熱應(yīng)激造成的損傷，從而刺激胰腺組織中淀粉酶和蛋白酶mRNA表達(dá)量增加，而且在長(zhǎng)時(shí)間的熱應(yīng)激條件下雛雞會(huì)通過(guò)增強(qiáng)新陳代謝來(lái)調(diào)節(jié)體溫[28]。在2、4、5、6周齡時(shí)，CK+G組雛雞胰腺組織中淀粉酶和脂肪酶活性都高于其他3組，HS+G組雛雞胰腺組織中淀粉酶和脂肪酶活性都高于HS組和CK組，表明熱應(yīng)激會(huì)降低雛雞胰腺組織中主要消化酶基因的表達(dá)，與消化酶活性測(cè)定結(jié)果基本一致。而在2～5周齡時(shí)，HS組雛雞腺胰組織中蛋白酶mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于HS+G組，說(shuō)明GABA的添加促進(jìn)了熱應(yīng)激雛雞胰腺組織中胰蛋白酶基因的表達(dá)。由于消化酶合成與分泌的機(jī)理目前還沒(méi)有十分清楚，關(guān)于熱應(yīng)激對(duì)動(dòng)物胰腺組織中主要消化酶基因表達(dá)的影響又少見(jiàn)報(bào)道，所以熱應(yīng)激使消化酶基因的表達(dá)量下降的機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。

細(xì)胞凋亡作為生物體內(nèi)的一個(gè)重要生命現(xiàn)象，對(duì)機(jī)體的正常發(fā)育具有重要作用，一旦細(xì)胞凋亡發(fā)生異常，機(jī)體發(fā)生疾病的概率就會(huì)增加[29]。在2～6周齡時(shí)，CK組雛雞胰腺組織中細(xì)胞凋亡情況變化不大，隨周齡的增長(zhǎng)呈現(xiàn)出先上升后下降的過(guò)程，在4周齡時(shí)凋亡細(xì)胞分布密度達(dá)到最大，而在5周齡時(shí)細(xì)胞凋亡數(shù)量又下降到最低水平。這可能是因?yàn)?周齡為雛雞發(fā)育最旺盛的時(shí)期，自然凋亡細(xì)胞數(shù)量增多所致，而在5周齡時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)量下降則可能與該時(shí)期雛雞胰腺發(fā)育緩慢相關(guān)。在2周齡時(shí)，HS組雛雞胰腺組織中細(xì)胞凋亡處于較低水平，而在3～6周齡期間，胰腺組織中細(xì)胞凋亡水平急劇上升，這可能是由于熱應(yīng)激對(duì)雛雞胰腺組織造成的損傷還不足以使得胰腺組織中細(xì)胞的正常凋亡過(guò)于紊亂，而從3周齡開(kāi)始，由于雛雞快速生長(zhǎng)，以及胰腺組織所受的熱應(yīng)激的損傷累積，使得雛雞胰腺組織中細(xì)胞凋亡水平急劇上升。有研究發(fā)現(xiàn)慢性熱應(yīng)激導(dǎo)致肉雞小腸中消化酶活性失調(diào)，細(xì)胞增殖被抑制，細(xì)胞凋亡增加[28]。HS+G組雛雞胰腺組織中細(xì)胞凋亡水平在3周齡時(shí)較高，但在3周齡后HS+G組雛雞胰腺組織中細(xì)胞凋亡水平逐漸下降，并于6周齡時(shí)接近CK組水平，這可能是由于GABA緩解了雛雞的熱應(yīng)激，從而使得HS+G組胰腺組織中細(xì)胞凋亡水平在3周齡后逐漸下降。CK+G組雛雞胰腺組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量一直處于較低水平，僅在3周齡時(shí)高于CK組，可能是由于雛雞的快速生長(zhǎng)使得胰腺組織中的自然凋亡細(xì)胞的數(shù)量增加，而4～6周齡時(shí)CK+G組雛雞胰腺組織中細(xì)胞凋亡水平處于下調(diào)狀態(tài)，且低于其他3組，可能是由于GABA的長(zhǎng)期添加對(duì)雛雞胰腺的發(fā)育起到促進(jìn)作用，緩解了雛雞胰腺組織中細(xì)胞的凋亡。

4 結(jié) 論

綜上所述，熱應(yīng)激能夠改變雛雞胰腺組織的結(jié)構(gòu)，降低抗氧化酶和消化酶活性，增加細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重阻礙了雛雞胰腺的發(fā)育進(jìn)程；GABA的添加可以使熱應(yīng)激雛雞胰腺組織損傷程度減輕，使雛雞胰腺組織結(jié)構(gòu)保持完整性，還能提高雛雞胰腺組織中抗氧化酶和消化酶的活性及其mRNA相對(duì)表達(dá)量，降低MDA含量。所以，GABA可以作為添加劑來(lái)減輕熱應(yīng)激對(duì)雛雞胰腺組織結(jié)構(gòu)、抗氧化能力和消化功能發(fā)育的負(fù)面影響。